奶牛乳腺上皮細胞氧化損傷模型構建編制說明
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內蒙古自治區(qū)地方標準奶牛乳腺上皮細胞氧化損傷模型構建技術規(guī)程編制說明一、 工作簡況1. 任務來源:內蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局關于下達2019年第2批內蒙古自治區(qū)地方標準制修訂項目計劃的通知(內市監(jiān)標準字2019300號)。2. 起草單位:內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院、吉林農業(yè)大學、內蒙古大學。3. 起草人:馬燕芬、趙磊、吳志紅、宋利文、乃門塔娜、鳳英、羿靜、寶華、張春華、杜瑞平。二、 制定標準的目的和意義隨著我國奶牛養(yǎng)殖水平的提高和養(yǎng)殖密度的加大,使得奶牛產奶量也隨之遞增,同時也加大了奶牛的代謝強度,進而導致機體代謝過程中產生大量的自由基。處于圍產期和泌乳高峰期的代謝需要均可增加奶牛體內活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成。正常情況下,動物機體內的氧自由基處于動態(tài)平衡,維持機體正常的新陳代謝與免疫功能。但是當ROS生成量超出機體的清除限度,就會引起機體發(fā)生脂質過氧化反應,使奶牛處于氧化應激狀態(tài),進而改變細胞膜的結構與功能,導致生產性能、炎癥應答能力與機體免疫功能下降。此時,機體極易感染上疾病,如乳房炎、胎衣滯留、子宮炎、酮病、真胃變位、脂肪肝等。因此,如何提高動物機體抗氧化能力已成為當前奶牛生產中一個亟待解決的問題。為解決由氧化應激對奶牛機體內部組織、器官及細胞所造成的損傷,需要在體外構建奶牛不同組織細胞的氧化損傷模型,在成功構建乳腺細胞氧化損傷模型的基礎上,就可以對其損傷機理進行深入研究。由此可知,構建體外組織氧化損傷模型對深入研究代謝病發(fā)病機理的重要性。細胞培養(yǎng)是采用無菌技術從動物機體內分離細胞,然后模擬體內生理環(huán)境,使離體細胞體外生存、生長并維持結構和功能的一門技術,是細胞學研究的基本技術之一,也是細胞生物學乃至整個生命科學研究最基本的試驗技術。該技術對現代組織培養(yǎng)技術的發(fā)展,尤其對生產大量細胞以適應生物化學分析無疑起到了極大的推進作用。動物乳腺是復管泡狀皮膚腺,乳腺細胞的增殖和分化始終貫穿于乳腺發(fā)育及泌乳全過程,乳汁中的許多成分只有乳腺上皮細胞才能合成。人們在20世紀70年代就開始對乳腺細胞進行研究,而且在細胞水平上進行了大量的乳腺上皮細胞增殖及分化的研究。近些年,乳腺細胞體外培養(yǎng)的發(fā)展在很大程度上由科研需要和畜牧業(yè)發(fā)展的需求所促成,加速了人們對乳腺的認識和乳腺營養(yǎng)的深入研究。原代培養(yǎng)是從供體獲取組織后的首次培養(yǎng)。乳腺上皮細胞是一種貼壁型細胞,在動物機體內,它是以細胞與細胞之間的相互接觸、細胞與細胞外基質之間的相互接觸的方式生存和生長發(fā)育的。體外培養(yǎng)時,此細胞仍然保持這種特性。因此,在分離乳腺細胞時,要盡可能地采用有效的方法獲得乳腺上皮細胞。目前主要采用酶消化法或機械法分離乳腺細胞,這樣既省時間又可獲得大量的目的細胞。原代培養(yǎng)一般需要14周。在這段時間里,乳腺細胞移動活躍,進行貼壁,可見有絲分裂但不旺盛。此時,細胞仍保持著機體內細胞的形態(tài)特征和生理功能,相互依存性強,對環(huán)境的要求極為苛刻,容易污染。因此在進行原代培養(yǎng)時,首先,要按照一定密度接種,保證在細胞貼壁之前不要劇烈振動。其次,一定要提供充分的營養(yǎng),減少人員在細胞培養(yǎng)室的走動,盡量避免細菌的感染。做好原代培養(yǎng)是乳腺細胞培養(yǎng)的基礎。乳腺細胞氧化損傷模型的構建是在原代細胞培養(yǎng)的基礎上通過添加不同作用濃度的氧化劑作用不同時間,通過檢測細胞生長情況和氧化指標的情況下來判斷所構建的模型是否符合奶牛機體生理狀態(tài)下氧化應激的發(fā)生狀態(tài),同時還需判斷該模型是否符合我們的試驗要求,是否可以繼續(xù)開展后續(xù)的研究。目前奶牛乳腺細胞氧化損傷模型的構建方法很多,所使用的氧化劑也很多,對此也沒有制定一個相應的規(guī)程。因此,制定奶牛乳腺細胞氧化損傷模型非常必要,在每次開展試驗時不需要開展反復試驗來驗證,直接參考本規(guī)程即可。該規(guī)程適用于構建奶牛乳腺細胞氧化損傷模型,實驗室內新手和熟手都易于操作、操作程序簡單。在乳腺細胞培養(yǎng)范圍內具有普遍適用性,規(guī)程涉及的內容屬于自治區(qū)經濟或社會發(fā)展的重點領域。通過該規(guī)程的建立,可節(jié)省培養(yǎng)時間快速構建,提高試驗效率。三、 主要起草過程本標準由內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院動物營養(yǎng)與飼料研究所的科研工作人員,通過構建乳腺上皮細胞模型和構建氧化損傷乳腺上皮細胞模型,查閱國內外相關資料及標準,最終制定出“奶牛乳腺上皮細胞氧化損傷模型”。在前期技術資料收集、調研、驗證試驗和經驗總結基礎上,標準起草小組按GB/T 1.1-2009標準化工作導則 第1部分:標準的結構和編寫編寫要求,對標準草案進行編寫、修改和完善,于2019年11月完成了標準征求意見稿和編制說明。本標準由內蒙古農牧業(yè)科學院提出和申報,內蒙古農牧業(yè)科學院作為本標準第一起草單位,吉林農業(yè)大學作為主要起草單位,各主要參加單位及工作組成員所做工作見下表:主要參加單位成員主要工作內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院馬燕芬負責方案確定,國內外相關技術資料的收集、編制驗證試驗方案,負責標準起草和說明編寫工作吳志紅參與方案確定,驗證試驗等宋利文參與方案確定,驗證試驗等鳳英參與方案確定,驗證試驗等羿靜組織和協調、參與方案確定等工作寶華參與方案確定,驗證試驗等張春華參與方案確定,驗證試驗等杜瑞平參與方案確定,驗證試驗等吉林農業(yè)大學趙磊負責國內外相關技術資料的收集、編制驗證試驗方案,驗證試驗等內蒙古大學乃門塔娜參與方案確定,驗證試驗等四、 標準編制原則和依據(一) 標準編制原則本標準格式、結構和編寫規(guī)則嚴格按照GB/T 1.1-2009標準化工作導則第一部分:標準的結構和編寫規(guī)則的要求進行編寫。(二) 主要技術內容確定的依據本標準是基于國家自然科學基金“圍產期奶牛乳腺細胞產生氧化損傷的分子機制研究(31460616,2015/1-2018/12)和茶多酚對氧化損傷乳腺細胞的干預作用及機制研究(31601975,2017/1-2019/12)”、內蒙古自然科學基金“氧化應激對圍產期奶牛的影響及茶多酚的抗氧化機制研究(2014BS0348,2014/1-2016/12)”和內蒙古農牧業(yè)科學院青年創(chuàng)新基金“茶多酚對氧化應激損傷的奶牛乳腺上皮細胞的抗氧化機制研究(2015QNJJM07,2015/1-2017/12)”;以及2017年內蒙古農業(yè)大學碩士論文“茶多酚對氧化損傷奶牛乳腺上皮細胞的干預作用及機制研究(趙磊,2017)”和“Nrf2-ARE通路在奶牛乳腺上皮細胞氧化損傷中的作用研究(吳志紅,2017)”的研究成果的基礎上進行編制的。主要依據以下技術成果:1.H2O2作用濃度和時間對乳腺上皮細胞形態(tài)的影響為了篩選出本試驗所構建的奶牛乳腺上皮細胞氧化應激模型中的H2O2的最佳誘導作用濃度和作用時間,分別在不同濃度和不同時間點檢測了H2O2誘導的細胞損傷程度。圖1是不同濃度的H2O2作用于奶牛乳腺上皮細胞0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h后,在倒置顯微鏡下觀察到的細胞數量和細胞形態(tài)的變化結果。其中橫坐標從左到右分別代表0M、100M、200M、400M、600M、800M、1000M,縱坐標從上到下分別代表0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h。從圖1結果可以看出,隨著H2O2濃度的增加,細胞數量顯著降低,作用6h后,600M組的細胞數量明顯減少,當作用8h-24h,600M-1000M組的細胞死亡數量過多,不利于后續(xù)試驗的研究。 0M 100M 200M 400M 600M 800M 1000M圖1 倒置顯微鏡下H2O2對乳腺上皮細胞數量和形態(tài)的影響2.H2O2對乳腺上皮細胞增殖率的影響為了確定出H2O2作用濃度和作用時間,本試驗測定了H2O2對乳腺上皮細胞增殖率的影響。從表1結果可以看出,隨著H2O2濃度的增加,乳腺上皮細胞增殖率在0h24h內呈顯著下降趨勢。其中在乳腺上皮細胞培養(yǎng)0h4h時,當H2O2濃度為0400M時,增殖率下降緩慢,各組之間差異不顯著(P0.05);當H2O2濃度增加到600M時,乳腺細胞增殖率下降了10%15%,差異顯著(P0.05);當H2O2濃度增加到800M1000M時,細胞增殖率下降達45%,差異顯著(P0.05)。在乳腺上皮細胞培養(yǎng)6h8h時,H2O2濃度增加到600M時,乳腺細胞增殖率下降達25%,差異顯著(P0.05);當H2O2濃度增加到800M1000M時,細胞增殖率下降達40%51%,差異顯著(P0.05)。在乳腺上皮細胞培養(yǎng)12h24h時,H2O2濃度增加到600M時,乳腺細胞增殖率下降達40%52%,差異顯著(P0.05);當H2O2濃度增加到800M1000M時,乳腺細胞增殖率下降達44%80%,差異顯著(P0.05)。隨著H2O2培養(yǎng)時間的延長,乳腺上皮細胞增殖率在100mol/L1000mol/L內呈先上升后下降趨勢(P0.05)。其中在04h內乳腺上皮細胞增殖率呈上升趨勢,在6h時開始下降(P0.05),在6h24h內增值率分別下降了4%37%(P0.05),其中H2O2濃度為600M時,BMECs增殖率下降最為明顯(P0.05)。綜合以上分析,當H2O2濃度增加到600M時,培養(yǎng)時間為6h8h時,乳腺細胞增殖率下降25%左右,當再增加H2O2濃度和時間,乳腺細胞增殖率下降達44%80%,也有50%的細胞死亡,無法進行后續(xù)的試驗。因此,為縮短培養(yǎng)時間,本試驗選擇H2O2作用濃度600M,作用時間6h作為H2O2構建乳腺上皮細胞氧化損傷模型的適宜條件。表 1 H2O2對BMECs增殖率的影響H2O201002004006008001000SEMp-value(mol/L)0h100aA96.97aA96.20aA95.79aA85.28abA56.93cB56.02bB5.2340.0012h100aA97.31aA97.07aA96.57aA87.43aA58.25cB57.09bB4.8520.0014h100aA98.13aA97.89aA97.03aA90.99aA72.48aB69.46aB3.3230.0016h100aA95.76aA88.34bAB86.93bAB78.80bcB65.37bC58.31bC3.3860.0018h100aA94.18aA88.00bAB85.82bAB75.27cB60.00bcC49.46cC4.2580.00112h100aA93.55aA85.63bAB70.09cBC59.24dCD56.01cD38.41dE5.0010.00124h100aAB92.43aA81.92bAB61.13dBC48.67eCD37.42dCD19.81eD8.2670.001SEM02.3052.5931.1832.2622.0771.711p-value0.53810.00040.0010.0010.0010.05),不同小寫字母表示差異顯著(P0.05),不同大寫字母表示差異顯著(P0.05)。下同。3.H2O2對乳腺上皮細胞培養(yǎng)液中抗氧化指標的影響為了進一步篩選出H2O2作用濃度,本試驗測定了H2O2對乳腺上皮細胞培養(yǎng)液中抗氧化指標的影響。結果詳見表2和表3。表 2 H2O2作用濃度對BMECs抗氧化指標的影響H2O2SODCATGSTLDHGSH-PX(mol/L)(U/mL)(U/L)(mIU/L)(IU/L)(U/L)0185.01a115.03a911.77c20.57d750.26a100178.49b109.36b917.42c21.68c630.15b200178.12b107.25b921.00c21.83c625.07b400153.55c95.42c1005.02b23.24b620.21b600134.54d88.87d1148.51a25.27a581.73c800134.21d88.55d1154.13a25.41a577.99c1000133.19d88.22d1160.01a25.60a571.27cSEM0.95470.87567.73700.28544.4787P值P-valueP0.0001P0.0001P0.0001P0.0001P0.0001 表 3 H2O2對BMECs ROS、MDA、8-iso-PG、PC和8-OHdG的影響H2O2ROSMDA8-iso-PGPC8-OHdG(mol/L)(pg/mL)(mmol/L)(ng/L)(nmol/mg prot)(ng/L)02926.86d69.83c121.17c0.87d231.63d1003085.17c70.42c122.50c0.91cd234.16cd2003221.02b70.88c125.63b0.97c236.99c4003258.78b73.47b127.29b1.04b249.08b6003551.58a77.30a140.52a1.39a278.08a8003574.08a77.70a141.33a1.41a280.21a10003604.87a78.25a142.05a1.43a282.19aSEM20.34120.41730.82970.02301.6101P值P-valueP0.0001P0.0001P0.0001P0.0001P0.0001由表2結果可知,隨著H2O2作用濃度的增加,乳腺上皮細胞培養(yǎng)液中SOD活性和CAT活性顯著下降(P0.05)。其中0M為最高,顯著高于其他各組(P0.05),且顯著高于400M組(P0.05);600M1000M組為最低,顯著低于其它各組(P0.05)。GSH-PX活性隨著H2O2濃度的增加呈下降趨勢,其中,0M為最高,顯著高于其他各組(P0.05);600M1000M組為最低,顯著低于其它各組(P0.05)。GST活性和LDH活性隨著H2O2濃度的增加呈上升趨勢,其中0M200M組活性為最低,各組之間無顯著差異(P0.05);400M組居中(P0.05)。由表3結果可知,ROS含量、MDA含量、8-iso-PG含量、PC含量和8-OHdG含量隨著H2O2濃度的增加呈上升趨勢。其中,0M組為最低(P0.05);100M400M組居中,ROS含量和8-iso-PG含量100M組顯著低于200M和400M組(P0.05),MDA含量、PC含量和8-OHdG含量100M組和200M組顯著低于400M組(P0.05);600M1000M組為最高(P0.05)。綜合表3和表4的結果可知,乳腺上皮細胞培養(yǎng)液中SOD活性、CAT活性和GSH-PX活性隨著H2O2濃度的增加呈顯著下降趨勢,而GST活性、LDH活性、ROS含量、MDA含量、8-iso-PG含量、PC含量和8-OHdG含量隨著H2O2濃度的增加呈顯著上升趨勢。說明乳腺上皮細胞隨著H2O2濃度的增加出現了不同程度的氧化損傷,當H2O2濃度增加到600M1000M時,乳腺細胞氧化損傷程度達到最大,且當H2O2濃度為800M時,乳腺細胞死亡數量顯著升高,不利于后續(xù)試驗的開展。因此,本試驗選擇600M作為H2O2誘導乳腺上皮細胞構建氧化損傷模型的適宜作用濃度。圍產期奶牛由于日糧干物質采食量遠遠低于機體本身能量需求和泌乳需求,極易導致機體處于能量負平衡狀態(tài)。一旦奶牛機體處于能量負平衡狀態(tài),就會動員機體內產生大量的脂質,多余的脂質就會被氧化并產生大量的ROS,過量的ROS如果不能及時清除就會蓄積于細胞內部,很容易引起奶牛機體產生氧化應激。圍產期奶牛由于能量負 平衡以及分娩應激等的影響,極易導致機體產生如乳房炎、酮病、子宮內膜炎、胎衣不下、難產、產后癱瘓等代謝病。近年來的研究顯示,氧化應激可使圍產期奶牛乳腺組織產生明顯的氧化損傷,降低其抗氧化能力,持續(xù)的氧化應激通過產生過量的ROS對細胞進行攻擊,使其發(fā)生脂質過氧化反應,并引起細胞膜結構和功能發(fā)生改變。為此,本研究以健康奶牛乳腺上皮細胞為材料,以H2O2為應激源構建氧化應激模型。本試驗選擇不同濃度的H2O2作用不同時間,通過對乳腺上皮細胞形態(tài)、增值率和抗氧化指標的測定,確定出當H2O2作用濃度增加到600M1000M時,作用時間為6h,乳腺上皮細胞氧化損傷程度達到最大,但當H2O2濃度為800M時,乳腺細胞死亡數量顯著升高,不利于后續(xù)試驗的開展。因此,本試驗選擇作用濃度為600M,作用時間為6h作為H2O2誘導乳腺上皮細胞構建氧化損傷模型的適宜條件。本研究表明:當H2O2作用濃度為600M,作用時間為6h,乳腺上皮細胞產生了明顯的氧化應激損傷,但這種損傷不會造成細胞大量死亡,損傷還有可能會被修復,可作為建立乳腺上皮細胞氧化損傷模型時的適宜條件。五、 技術規(guī)范的編寫說明為了確保起草好本標準,課題組首先確定了本標準中所普及的技術內容不僅具有科學性、先進性,而且更具有實用性和可操作性。本標準是在2017年內蒙古農業(yè)大學碩士論文“茶多酚對氧化損傷奶牛乳腺上皮細胞的干預作用及機制研究”和“Nrf2-ARE通路在奶牛乳腺上皮細胞氧化損傷中的作用研究”的研究成果的基礎上進行編制而成。六、 標準主要內容的說明本標準的主要內容由四個部分組成,即奶牛乳腺樣品采集,乳腺樣品的初處理和精細化處理,乳腺細胞傳代、純化、凍存和復蘇,氧化損傷乳腺上皮細胞模型的構建。本標準規(guī)定了乳腺的取樣要求,乳腺樣品的初處理和精細化處理步驟,乳腺細胞傳代、純化、凍存和復蘇,氧化損傷乳腺上皮細胞模型的構建方法。七、 貫徹實施規(guī)范的要求及措施本標準在經相關部門批準發(fā)布實施后,需要行政部門的監(jiān)督執(zhí)行,保證“標準”制定的目的。“標準”在執(zhí)行的過程中還需要不斷的完善和健全。八、參考文獻1. 趙磊. 茶多酚對氧化損傷奶牛乳腺上皮細胞的干預作用及機制研究D. 內蒙古農業(yè)大學碩士學位論文,20172. 吳志紅. Nrf2-ARE通路在奶牛乳腺上皮細胞氧化損傷中的作用研究D. 內蒙古農業(yè)大學碩士學位論文,20173. 金鹿. 維生素A對奶牛乳腺硒蛋白合成及抗氧化功能影響機理的研究D. 內蒙古農業(yè)大學博士學位論文, 20144. Castillo C, Hernandez J, Bravo A, et al. Oxidative status during late pregnancy and early lactation in dairy cows J. Vet. J, 2005, 169: 286-292.5. 王艷明. 日糧脂肪和能量水平對奶牛氧化應激、生產性能的影響及抗氧化劑添加效果研究D. 杭州:浙江大學博士學位論文, 20106. 馬蕊, 劉仲華, 黃建安, 等. 綠茶和紅茶提取物抑制中波紫外線誘導HaCaT細胞氧化損傷和凋亡的比較J. 湖南農業(yè)大學學報(自然科學版),2013,39(4): 377-381.7. 趙文紅,崔慧嫻,等. 茶多酚對直鏈烷基苯磺酸鈉致小鼠皮膚損傷的保護作用J.茶葉科學,2016,36(5):461-468.九、專家修改意見采納情況序號專家意見采納情況原因1應增加符號和縮略句。規(guī)程中多次出現英文單詞和縮寫,但未發(fā)現有注釋。如:3.2中一抗 小鼠源抗Vinculin單克隆抗體。二抗 將小鼠源抗Vinculin單克隆抗體與PBS按1:200比例配制而成。采納2規(guī)程中1和2沒有給出具體內容。采納3術語與定義中格式不規(guī)范,另每個定義后是否需要加上英文解釋,請統一。采納4主要試劑配制方法中:每一種試劑前可添加小標題(如4.1基礎培養(yǎng)基:DMEM/F12培養(yǎng)基),具體配制方法可以在附錄中說明。采納5文中有多處書寫錯誤。如:6.1.2 乳腺樣品的初步處理中:第二行選取1 cm3大小的組織塊改為為1 cm3采納6標準的題目應體現出H2O2誘導氧化損傷,因為還有其他構建BMECs氧化損傷模型的方法。采納7細胞的凍存和復蘇內容建議刪去,BMECs傳至P3代可以直接用于構建氧化損傷模型。采納86.1.3的標題建議改為“奶牛乳腺上皮細胞原代培養(yǎng)”;6.1.4的標題建議改為“奶牛乳腺上皮細胞傳代和純化”;7.3的標題建議改為“奶牛乳腺上皮細胞抗氧化指標測定”。采納93.1饑餓培養(yǎng)的定義需修改完善。采納107.1 細胞形態(tài)觀察部分,應描述在倒置顯微鏡下觀察時氧化損傷乳腺上皮細胞的具體數量和形態(tài)的變化。采納117.2.6 測OD值部分,應給出在490 nm處OD值的具體數字或數字范圍。 采納127.3 細胞酶活性測定部分,應明確給出上清液測定氧化和抗氧化指標所測定出的具體數字范圍。采納13封面:內蒙古自治區(qū)地方標準;發(fā)布單位:內蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局前言中本標準技術歸口單位為:內蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標準化技術委員會(SAM/TC19);正文填加范圍內容;術語定義中術語后面要加英文。編制說明中應加立項文號采納15- 配套講稿:
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- 奶牛 乳腺 上皮細胞 氧化 損傷 模型 構建 編制 說明
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