奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷模型構(gòu)建編制說明

內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷模型構(gòu)建技術(shù)規(guī)程編制說明一、 工作簡(jiǎn)況1. 任務(wù)來源：內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局關(guān)于下達(dá)2019年第2批內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目計(jì)劃的通知（內(nèi)市監(jiān)標(biāo)準(zhǔn)字2019300號(hào)）。2. 起草單位：內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院、吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)、內(nèi)蒙古大學(xué)。3. 起草人：馬燕芬、趙磊、吳志紅、宋利文、乃門塔娜、鳳英、羿靜、寶華、張春華、杜瑞平。二、 制定標(biāo)準(zhǔn)的目的和意義隨著我國(guó)奶牛養(yǎng)殖水平的提高和養(yǎng)殖密度的加大，使得奶牛產(chǎn)奶量也隨之遞增，同時(shí)也加大了奶牛的代謝強(qiáng)度，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生大量的自由基。處于圍產(chǎn)期和泌乳高峰期的代謝需要均可增加奶牛體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成。正常情況下，動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的氧自由基處于動(dòng)態(tài)平衡，維持機(jī)體正常的新陳代謝與免疫功能。但是當(dāng)ROS生成量超出機(jī)體的清除限度，就會(huì)引起機(jī)體發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使奶牛處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，進(jìn)而改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能，導(dǎo)致生產(chǎn)性能、炎癥應(yīng)答能力與機(jī)體免疫功能下降。此時(shí)，機(jī)體極易感染上疾病，如乳房炎、胎衣滯留、子宮炎、酮病、真胃變位、脂肪肝等。因此，如何提高動(dòng)物機(jī)體抗氧化能力已成為當(dāng)前奶牛生產(chǎn)中一個(gè)亟待解決的問題。為解決由氧化應(yīng)激對(duì)奶牛機(jī)體內(nèi)部組織、器官及細(xì)胞所造成的損傷，需要在體外構(gòu)建奶牛不同組織細(xì)胞的氧化損傷模型，在成功構(gòu)建乳腺細(xì)胞氧化損傷模型的基礎(chǔ)上，就可以對(duì)其損傷機(jī)理進(jìn)行深入研究。由此可知，構(gòu)建體外組織氧化損傷模型對(duì)深入研究代謝病發(fā)病機(jī)理的重要性。細(xì)胞培養(yǎng)是采用無菌技術(shù)從動(dòng)物機(jī)體內(nèi)分離細(xì)胞，然后模擬體內(nèi)生理環(huán)境，使離體細(xì)胞體外生存、生長(zhǎng)并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)，是細(xì)胞學(xué)研究的基本技術(shù)之一，也是細(xì)胞生物學(xué)乃至整個(gè)生命科學(xué)研究最基本的試驗(yàn)技術(shù)。該技術(shù)對(duì)現(xiàn)代組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，尤其對(duì)生產(chǎn)大量細(xì)胞以適應(yīng)生物化學(xué)分析無疑起到了極大的推進(jìn)作用。動(dòng)物乳腺是復(fù)管泡狀皮膚腺，乳腺細(xì)胞的增殖和分化始終貫穿于乳腺發(fā)育及泌乳全過程，乳汁中的許多成分只有乳腺上皮細(xì)胞才能合成。人們?cè)?0世紀(jì)70年代就開始對(duì)乳腺細(xì)胞進(jìn)行研究，而且在細(xì)胞水平上進(jìn)行了大量的乳腺上皮細(xì)胞增殖及分化的研究。近些年，乳腺細(xì)胞體外培養(yǎng)的發(fā)展在很大程度上由科研需要和畜牧業(yè)發(fā)展的需求所促成，加速了人們對(duì)乳腺的認(rèn)識(shí)和乳腺營(yíng)養(yǎng)的深入研究。原代培養(yǎng)是從供體獲取組織后的首次培養(yǎng)。乳腺上皮細(xì)胞是一種貼壁型細(xì)胞，在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)，它是以細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互接觸、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互接觸的方式生存和生長(zhǎng)發(fā)育的。體外培養(yǎng)時(shí)，此細(xì)胞仍然保持這種特性。因此，在分離乳腺細(xì)胞時(shí)，要盡可能地采用有效的方法獲得乳腺上皮細(xì)胞。目前主要采用酶消化法或機(jī)械法分離乳腺細(xì)胞，這樣既省時(shí)間又可獲得大量的目的細(xì)胞。原代培養(yǎng)一般需要14周。在這段時(shí)間里，乳腺細(xì)胞移動(dòng)活躍，進(jìn)行貼壁，可見有絲分裂但不旺盛。此時(shí)，細(xì)胞仍保持著機(jī)體內(nèi)細(xì)胞的形態(tài)特征和生理功能，相互依存性強(qiáng)，對(duì)環(huán)境的要求極為苛刻，容易污染。因此在進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)，首先，要按照一定密度接種，保證在細(xì)胞貼壁之前不要?jiǎng)×艺駝?dòng)。其次，一定要提供充分的營(yíng)養(yǎng)，減少人員在細(xì)胞培養(yǎng)室的走動(dòng)，盡量避免細(xì)菌的感染。做好原代培養(yǎng)是乳腺細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)。乳腺細(xì)胞氧化損傷模型的構(gòu)建是在原代細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上通過添加不同作用濃度的氧化劑作用不同時(shí)間，通過檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況和氧化指標(biāo)的情況下來判斷所構(gòu)建的模型是否符合奶牛機(jī)體生理狀態(tài)下氧化應(yīng)激的發(fā)生狀態(tài)，同時(shí)還需判斷該模型是否符合我們的試驗(yàn)要求，是否可以繼續(xù)開展后續(xù)的研究。目前奶牛乳腺細(xì)胞氧化損傷模型的構(gòu)建方法很多，所使用的氧化劑也很多，對(duì)此也沒有制定一個(gè)相應(yīng)的規(guī)程。因此，制定奶牛乳腺細(xì)胞氧化損傷模型非常必要，在每次開展試驗(yàn)時(shí)不需要開展反復(fù)試驗(yàn)來驗(yàn)證，直接參考本規(guī)程即可。該規(guī)程適用于構(gòu)建奶牛乳腺細(xì)胞氧化損傷模型，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)新手和熟手都易于操作、操作程序簡(jiǎn)單。在乳腺細(xì)胞培養(yǎng)范圍內(nèi)具有普遍適用性，規(guī)程涉及的內(nèi)容屬于自治區(qū)經(jīng)濟(jì)或社會(huì)發(fā)展的重點(diǎn)領(lǐng)域。通過該規(guī)程的建立，可節(jié)省培養(yǎng)時(shí)間快速構(gòu)建，提高試驗(yàn)效率。三、 主要起草過程本標(biāo)準(zhǔn)由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料研究所的科研工作人員，通過構(gòu)建乳腺上皮細(xì)胞模型和構(gòu)建氧化損傷乳腺上皮細(xì)胞模型，查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)資料及標(biāo)準(zhǔn)，最終制定出“奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷模型”。在前期技術(shù)資料收集、調(diào)研、驗(yàn)證試驗(yàn)和經(jīng)驗(yàn)總結(jié)基礎(chǔ)上，標(biāo)準(zhǔn)起草小組按GB/T 1.1-2009標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫編寫要求，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)草案進(jìn)行編寫、修改和完善，于2019年11月完成了標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿和編制說明。本標(biāo)準(zhǔn)由內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院提出和申報(bào)，內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院作為本標(biāo)準(zhǔn)第一起草單位，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)作為主要起草單位，各主要參加單位及工作組成員所做工作見下表：主要參加單位成員主要工作內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院馬燕芬負(fù)責(zé)方案確定，國(guó)內(nèi)外相關(guān)技術(shù)資料的收集、編制驗(yàn)證試驗(yàn)方案，負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)起草和說明編寫工作吳志紅參與方案確定，驗(yàn)證試驗(yàn)等宋利文參與方案確定，驗(yàn)證試驗(yàn)等鳳英參與方案確定，驗(yàn)證試驗(yàn)等羿靜組織和協(xié)調(diào)、參與方案確定等工作寶華參與方案確定，驗(yàn)證試驗(yàn)等張春華參與方案確定，驗(yàn)證試驗(yàn)等杜瑞平參與方案確定，驗(yàn)證試驗(yàn)等吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)趙磊負(fù)責(zé)國(guó)內(nèi)外相關(guān)技術(shù)資料的收集、編制驗(yàn)證試驗(yàn)方案，驗(yàn)證試驗(yàn)等內(nèi)蒙古大學(xué)乃門塔娜參與方案確定，驗(yàn)證試驗(yàn)等四、 標(biāo)準(zhǔn)編制原則和依據(jù)（一） 標(biāo)準(zhǔn)編制原則本標(biāo)準(zhǔn)格式、結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則嚴(yán)格按照GB/T 1.1-2009標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第一部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則的要求進(jìn)行編寫。（二） 主要技術(shù)內(nèi)容確定的依據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)是基于國(guó)家自然科學(xué)基金“圍產(chǎn)期奶牛乳腺細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷的分子機(jī)制研究（31460616，2015/1-2018/12）和茶多酚對(duì)氧化損傷乳腺細(xì)胞的干預(yù)作用及機(jī)制研究（31601975，2017/1-2019/12）”、內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金“氧化應(yīng)激對(duì)圍產(chǎn)期奶牛的影響及茶多酚的抗氧化機(jī)制研究（2014BS0348，2014/1-2016/12）”和內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院青年創(chuàng)新基金“茶多酚對(duì)氧化應(yīng)激損傷的奶牛乳腺上皮細(xì)胞的抗氧化機(jī)制研究（2015QNJJM07，2015/1-2017/12）”；以及2017年內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文“茶多酚對(duì)氧化損傷奶牛乳腺上皮細(xì)胞的干預(yù)作用及機(jī)制研究（趙磊，2017）”和“Nrf2-ARE通路在奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷中的作用研究（吳志紅，2017）”的研究成果的基礎(chǔ)上進(jìn)行編制的。主要依據(jù)以下技術(shù)成果：1.H2O2作用濃度和時(shí)間對(duì)乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)的影響為了篩選出本試驗(yàn)所構(gòu)建的奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中的H2O2的最佳誘導(dǎo)作用濃度和作用時(shí)間，分別在不同濃度和不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)了H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷程度。圖1是不同濃度的H2O2作用于奶牛乳腺上皮細(xì)胞0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h后，在倒置顯微鏡下觀察到的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞形態(tài)的變化結(jié)果。其中橫坐標(biāo)從左到右分別代表0M、100M、200M、400M、600M、800M、1000M，縱坐標(biāo)從上到下分別代表0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h。從圖1結(jié)果可以看出，隨著H2O2濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量顯著降低，作用6h后，600M組的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，當(dāng)作用8h-24h，600M-1000M組的細(xì)胞死亡數(shù)量過多，不利于后續(xù)試驗(yàn)的研究。 0M 100M 200M 400M 600M 800M 1000M圖1 倒置顯微鏡下H2O2對(duì)乳腺上皮細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)的影響2.H2O2對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖率的影響為了確定出H2O2作用濃度和作用時(shí)間，本試驗(yàn)測(cè)定了H2O2對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖率的影響。從表1結(jié)果可以看出，隨著H2O2濃度的增加，乳腺上皮細(xì)胞增殖率在0h24h內(nèi)呈顯著下降趨勢(shì)。其中在乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)0h4h時(shí)，當(dāng)H2O2濃度為0400M時(shí)，增殖率下降緩慢，各組之間差異不顯著（P>0.05）；當(dāng)H2O2濃度增加到600M時(shí)，乳腺細(xì)胞增殖率下降了10%15%，差異顯著（P<0.05）；當(dāng)H2O2濃度增加到800M1000M時(shí)，細(xì)胞增殖率下降達(dá)45%，差異顯著（P<0.05）。在乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)6h8h時(shí)，H2O2濃度增加到600M時(shí)，乳腺細(xì)胞增殖率下降達(dá)25%，差異顯著（P<0.05）；當(dāng)H2O2濃度增加到800M1000M時(shí)，細(xì)胞增殖率下降達(dá)40%51%，差異顯著（P<0.05）。在乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)12h24h時(shí)，H2O2濃度增加到600M時(shí)，乳腺細(xì)胞增殖率下降達(dá)40%52%，差異顯著（P<0.05）；當(dāng)H2O2濃度增加到800M1000M時(shí)，乳腺細(xì)胞增殖率下降達(dá)44%80%，差異顯著（P<0.05）。隨著H2O2培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，乳腺上皮細(xì)胞增殖率在100mol/L1000mol/L內(nèi)呈先上升后下降趨勢(shì)（P<0.05）。其中在04h內(nèi)乳腺上皮細(xì)胞增殖率呈上升趨勢(shì)，在6h時(shí)開始下降（P<0.05），在6h24h內(nèi)增值率分別下降了4%37%（P<0.05），其中H2O2濃度為600M時(shí)，BMECs增殖率下降最為明顯（P<0.05）。綜合以上分析，當(dāng)H2O2濃度增加到600M時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間為6h8h時(shí)，乳腺細(xì)胞增殖率下降25%左右，當(dāng)再增加H2O2濃度和時(shí)間，乳腺細(xì)胞增殖率下降達(dá)44%80%，也有50%的細(xì)胞死亡，無法進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。因此，為縮短培養(yǎng)時(shí)間，本試驗(yàn)選擇H2O2作用濃度600M，作用時(shí)間6h作為H2O2構(gòu)建乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷模型的適宜條件。表 1 H2O2對(duì)BMECs增殖率的影響H2O201002004006008001000SEMp-value(mol/L)0h100aA96.97aA96.20aA95.79aA85.28abA56.93cB56.02bB5.234<0.0012h100aA97.31aA97.07aA96.57aA87.43aA58.25cB57.09bB4.852<0.0014h100aA98.13aA97.89aA97.03aA90.99aA72.48aB69.46aB3.323<0.0016h100aA95.76aA88.34bAB86.93bAB78.80bcB65.37bC58.31bC3.386<0.0018h100aA94.18aA88.00bAB85.82bAB75.27cB60.00bcC49.46cC4.258<0.00112h100aA93.55aA85.63bAB70.09cBC59.24dCD56.01cD38.41dE5.001<0.00124h100aAB92.43aA81.92bAB61.13dBC48.67eCD37.42dCD19.81eD8.267<0.001SEM02.3052.5931.1832.2622.0771.711p-value0.53810.0004<0.001<0.001<0.001<0.001注：同列肩標(biāo)相同小寫字母表示差異不顯著（P>0.05），不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）；同行肩標(biāo)相同大寫字母表示差異不顯著（P>0.05），不同大寫字母表示差異顯著（P<0.05）。下同。3.H2O2對(duì)乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中抗氧化指標(biāo)的影響為了進(jìn)一步篩選出H2O2作用濃度，本試驗(yàn)測(cè)定了H2O2對(duì)乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中抗氧化指標(biāo)的影響。結(jié)果詳見表2和表3。表 2 H2O2作用濃度對(duì)BMECs抗氧化指標(biāo)的影響H2O2SODCATGSTLDHGSH-PX（mol/L）（U/mL）（U/L）（mIU/L）（IU/L）（U/L）0185.01a115.03a911.77c20.57d750.26a100178.49b109.36b917.42c21.68c630.15b200178.12b107.25b921.00c21.83c625.07b400153.55c95.42c1005.02b23.24b620.21b600134.54d88.87d1148.51a25.27a581.73c800134.21d88.55d1154.13a25.41a577.99c1000133.19d88.22d1160.01a25.60a571.27cSEM0.95470.87567.73700.28544.4787P值P-valueP<0.0001P<0.0001P<0.0001P<0.0001P<0.0001 表 3 H2O2對(duì)BMECs ROS、MDA、8-iso-PG、PC和8-OHdG的影響H2O2ROSMDA8-iso-PGPC8-OHdG（mol/L）（pg/mL）（mmol/L）（ng/L）（nmol/mg prot）（ng/L）02926.86d69.83c121.17c0.87d231.63d1003085.17c70.42c122.50c0.91cd234.16cd2003221.02b70.88c125.63b0.97c236.99c4003258.78b73.47b127.29b1.04b249.08b6003551.58a77.30a140.52a1.39a278.08a8003574.08a77.70a141.33a1.41a280.21a10003604.87a78.25a142.05a1.43a282.19aSEM20.34120.41730.82970.02301.6101P值P-valueP<0.0001P<0.0001P<0.0001P<0.0001P<0.0001由表2結(jié)果可知，隨著H2O2作用濃度的增加，乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活性和CAT活性顯著下降（P<0.05）。其中0M為最高，顯著高于其他各組（P<0.05）；100M、200M和400M組居中，100M和200M組之間無顯著差異（P>0.05），且顯著高于400M組（P<0.05）；600M1000M組為最低，顯著低于其它各組（P<0.05），且各組之間無顯著差異（P>0.05）。GSH-PX活性隨著H2O2濃度的增加呈下降趨勢(shì)，其中，0M為最高，顯著高于其他各組（P<0.05）；100M、200M和400M組居中，且各組之間無顯著差異（P>0.05）；600M1000M組為最低，顯著低于其它各組（P<0.05），且各組之間無顯著差異（P>0.05）。GST活性和LDH活性隨著H2O2濃度的增加呈上升趨勢(shì)，其中0M200M組活性為最低，各組之間無顯著差異（P>0.05）；400M組居中（P<0.05）；600M1000M組為最高，且各組之間無顯著差異（P>0.05）。由表3結(jié)果可知，ROS含量、MDA含量、8-iso-PG含量、PC含量和8-OHdG含量隨著H2O2濃度的增加呈上升趨勢(shì)。其中，0M組為最低（P<0.05）；100M400M組居中，ROS含量和8-iso-PG含量100M組顯著低于200M和400M組（P<0.05），200M與400M組之間差異不顯著（P>0.05），MDA含量、PC含量和8-OHdG含量100M組和200M組顯著低于400M組（P<0.05），100M組和200M組之間差異不顯著（P>0.05）；600M1000M組為最高（P<0.05），且各組之間差異不顯著（P>0.05）。綜合表3和表4的結(jié)果可知，乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活性、CAT活性和GSH-PX活性隨著H2O2濃度的增加呈顯著下降趨勢(shì)，而GST活性、LDH活性、ROS含量、MDA含量、8-iso-PG含量、PC含量和8-OHdG含量隨著H2O2濃度的增加呈顯著上升趨勢(shì)。說明乳腺上皮細(xì)胞隨著H2O2濃度的增加出現(xiàn)了不同程度的氧化損傷，當(dāng)H2O2濃度增加到600M1000M時(shí)，乳腺細(xì)胞氧化損傷程度達(dá)到最大，且當(dāng)H2O2濃度為800M時(shí)，乳腺細(xì)胞死亡數(shù)量顯著升高，不利于后續(xù)試驗(yàn)的開展。因此，本試驗(yàn)選擇600M作為H2O2誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞構(gòu)建氧化損傷模型的適宜作用濃度。圍產(chǎn)期奶牛由于日糧干物質(zhì)采食量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于機(jī)體本身能量需求和泌乳需求，極易導(dǎo)致機(jī)體處于能量負(fù)平衡狀態(tài)。一旦奶牛機(jī)體處于能量負(fù)平衡狀態(tài)，就會(huì)動(dòng)員機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生大量的脂質(zhì)，多余的脂質(zhì)就會(huì)被氧化并產(chǎn)生大量的ROS，過量的ROS如果不能及時(shí)清除就會(huì)蓄積于細(xì)胞內(nèi)部，很容易引起奶牛機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激。圍產(chǎn)期奶牛由于能量負(fù) 平衡以及分娩應(yīng)激等的影響，極易導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生如乳房炎、酮病、子宮內(nèi)膜炎、胎衣不下、難產(chǎn)、產(chǎn)后癱瘓等代謝病。近年來的研究顯示，氧化應(yīng)激可使圍產(chǎn)期奶牛乳腺組織產(chǎn)生明顯的氧化損傷，降低其抗氧化能力，持續(xù)的氧化應(yīng)激通過產(chǎn)生過量的ROS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行攻擊，使其發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變。為此，本研究以健康奶牛乳腺上皮細(xì)胞為材料，以H2O2為應(yīng)激源構(gòu)建氧化應(yīng)激模型。本試驗(yàn)選擇不同濃度的H2O2作用不同時(shí)間，通過對(duì)乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)、增值率和抗氧化指標(biāo)的測(cè)定，確定出當(dāng)H2O2作用濃度增加到600M1000M時(shí)，作用時(shí)間為6h，乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷程度達(dá)到最大，但當(dāng)H2O2濃度為800M時(shí)，乳腺細(xì)胞死亡數(shù)量顯著升高，不利于后續(xù)試驗(yàn)的開展。因此，本試驗(yàn)選擇作用濃度為600M，作用時(shí)間為6h作為H2O2誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞構(gòu)建氧化損傷模型的適宜條件。本研究表明：當(dāng)H2O2作用濃度為600M，作用時(shí)間為6h，乳腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的氧化應(yīng)激損傷，但這種損傷不會(huì)造成細(xì)胞大量死亡，損傷還有可能會(huì)被修復(fù)，可作為建立乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷模型時(shí)的適宜條件。五、 技術(shù)規(guī)范的編寫說明為了確保起草好本標(biāo)準(zhǔn)，課題組首先確定了本標(biāo)準(zhǔn)中所普及的技術(shù)內(nèi)容不僅具有科學(xué)性、先進(jìn)性，而且更具有實(shí)用性和可操作性。本標(biāo)準(zhǔn)是在2017年內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文“茶多酚對(duì)氧化損傷奶牛乳腺上皮細(xì)胞的干預(yù)作用及機(jī)制研究”和“Nrf2-ARE通路在奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷中的作用研究”的研究成果的基礎(chǔ)上進(jìn)行編制而成。六、 標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的說明本標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容由四個(gè)部分組成，即奶牛乳腺樣品采集，乳腺樣品的初處理和精細(xì)化處理，乳腺細(xì)胞傳代、純化、凍存和復(fù)蘇，氧化損傷乳腺上皮細(xì)胞模型的構(gòu)建。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了乳腺的取樣要求，乳腺樣品的初處理和精細(xì)化處理步驟，乳腺細(xì)胞傳代、純化、凍存和復(fù)蘇，氧化損傷乳腺上皮細(xì)胞模型的構(gòu)建方法。七、 貫徹實(shí)施規(guī)范的要求及措施本標(biāo)準(zhǔn)在經(jīng)相關(guān)部門批準(zhǔn)發(fā)布實(shí)施后，需要行政部門的監(jiān)督執(zhí)行，保證“標(biāo)準(zhǔn)”制定的目的?！皹?biāo)準(zhǔn)”在執(zhí)行的過程中還需要不斷的完善和健全。八、參考文獻(xiàn)1. 趙磊. 茶多酚對(duì)氧化損傷奶牛乳腺上皮細(xì)胞的干預(yù)作用及機(jī)制研究D. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，20172. 吳志紅. Nrf2-ARE通路在奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷中的作用研究D. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，20173. 金鹿. 維生素A對(duì)奶牛乳腺硒蛋白合成及抗氧化功能影響機(jī)理的研究D. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文, 20144. Castillo C, Hernandez J, Bravo A, et al. Oxidative status during late pregnancy and early lactation in dairy cows J. Vet. J, 2005, 169: 286-292.5. 王艷明. 日糧脂肪和能量水平對(duì)奶牛氧化應(yīng)激、生產(chǎn)性能的影響及抗氧化劑添加效果研究D. 杭州:浙江大學(xué)博士學(xué)位論文, 20106. 馬蕊, 劉仲華, 黃建安, 等. 綠茶和紅茶提取物抑制中波紫外線誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞氧化損傷和凋亡的比較J. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013,39(4)： 377-381.7. 趙文紅，崔慧嫻，等. 茶多酚對(duì)直鏈烷基苯磺酸鈉致小鼠皮膚損傷的保護(hù)作用J.茶葉科學(xué),2016,36（5）：461-468.九、專家修改意見采納情況序號(hào)專家意見采納情況原因1應(yīng)增加符號(hào)和縮略句。規(guī)程中多次出現(xiàn)英文單詞和縮寫，但未發(fā)現(xiàn)有注釋。如：3.2中一抗 小鼠源抗Vinculin單克隆抗體。二抗 將小鼠源抗Vinculin單克隆抗體與PBS按1:200比例配制而成。采納2規(guī)程中1和2沒有給出具體內(nèi)容。采納3術(shù)語(yǔ)與定義中格式不規(guī)范，另每個(gè)定義后是否需要加上英文解釋，請(qǐng)統(tǒng)一。采納4主要試劑配制方法中：每一種試劑前可添加小標(biāo)題（如4.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基：DMEM/F12培養(yǎng)基），具體配制方法可以在附錄中說明。采納5文中有多處書寫錯(cuò)誤。如：6.1.2 乳腺樣品的初步處理中：第二行選取1 cm3大小的組織塊改為為1 cm3采納6標(biāo)準(zhǔn)的題目應(yīng)體現(xiàn)出H2O2誘導(dǎo)氧化損傷，因?yàn)檫€有其他構(gòu)建BMECs氧化損傷模型的方法。采納7細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇內(nèi)容建議刪去，BMECs傳至P3代可以直接用于構(gòu)建氧化損傷模型。采納86.1.3的標(biāo)題建議改為“奶牛乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)”；6.1.4的標(biāo)題建議改為“奶牛乳腺上皮細(xì)胞傳代和純化”；7.3的標(biāo)題建議改為“奶牛乳腺上皮細(xì)胞抗氧化指標(biāo)測(cè)定”。采納93.1饑餓培養(yǎng)的定義需修改完善。采納107.1 細(xì)胞形態(tài)觀察部分，應(yīng)描述在倒置顯微鏡下觀察時(shí)氧化損傷乳腺上皮細(xì)胞的具體數(shù)量和形態(tài)的變化。采納117.2.6 測(cè)OD值部分，應(yīng)給出在490 nm處OD值的具體數(shù)字或數(shù)字范圍。 采納127.3 細(xì)胞酶活性測(cè)定部分，應(yīng)明確給出上清液測(cè)定氧化和抗氧化指標(biāo)所測(cè)定出的具體數(shù)字范圍。采納13封面：內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)；發(fā)布單位：內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局前言中本標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)歸口單位為：內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAM/TC19）；正文填加范圍內(nèi)容；術(shù)語(yǔ)定義中術(shù)語(yǔ)后面要加英文。編制說明中應(yīng)加立項(xiàng)文號(hào)采納15