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1、本章內(nèi)容： 種子制備原理與技術(shù) 影響種子質(zhì)量的因素 種子質(zhì)量的控制措施 種子制備的放大原理與技術(shù) 概念： 種子的制備 ， 即 菌種的擴(kuò)大 培養(yǎng) 就是把保藏的菌種，即砂土管， 冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn) 菌種接入試管斜面活化，再經(jīng)過扁 瓶或搖瓶和種子罐，逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng) 后達(dá)到一定的數(shù)量和質(zhì)量的純種培 養(yǎng)過程。這些純種的培養(yǎng)物稱為種 子。 種子擴(kuò)培的 目的 接種量的需要 菌種的馴化 縮短發(fā)酵時(shí)間、保證生產(chǎn)水平 生長(zhǎng)活力強(qiáng)，延遲期短； (接種后在發(fā)酵罐 中能迅速生長(zhǎng) ) 生理狀態(tài)穩(wěn)定； 濃度及總量能滿足大容量發(fā)酵罐接種量的要求； 無雜菌污染 ， 保證純種發(fā)酵； 適應(yīng)性強(qiáng)，生產(chǎn)能力穩(wěn)定 優(yōu)良種子 應(yīng)
2、具備的 條件 /種子的 要求： 一 .發(fā)酵級(jí)數(shù)的確定 種子擴(kuò)大的級(jí)數(shù) ：制備種子需逐級(jí)擴(kuò) 大培養(yǎng)的次數(shù) 級(jí)數(shù)愈少 ， 愈利于簡(jiǎn)化工藝及控制 ， 并可減少種子罐污染雜菌的機(jī)會(huì) ， 減 少消毒及值班工作量 ， 減少因種子罐 生長(zhǎng)異常而造成的發(fā)酵波動(dòng) 。 種子制備原理與技術(shù)： 谷氨酸 ：三級(jí)發(fā)酵 （ 谷氨酸棒桿菌 ） 一級(jí)種子（搖瓶） 二級(jí)種子 （小罐） 發(fā)酵 青霉素 ：三級(jí)發(fā)酵 一級(jí)種子 （ 小罐 ） 二級(jí)種子（ 中罐 ） 發(fā)酵 一般由 菌絲體培養(yǎng) 開始計(jì)算發(fā)酵級(jí)數(shù)，但有時(shí)， 工廠從 第一級(jí)種子罐 開始計(jì)算發(fā)酵級(jí)數(shù) 發(fā)酵級(jí)數(shù)確定的依據(jù) 級(jí)數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長(zhǎng)特性、接種量的影響 級(jí)數(shù)大，難控制、易
3、染菌 、易變異，管理困難，一 般 2-4級(jí) 。 在發(fā)酵產(chǎn)品的 放大 中，反應(yīng)級(jí)數(shù)的確定是非常重要 的一個(gè)方面 發(fā)酵級(jí)數(shù)確定方法 菌種的性質(zhì) (如菌種傳代后的穩(wěn)定性 ) 瓶中的孢子數(shù) ， 孢子發(fā)芽及菌絲繁殖速度 發(fā)酵罐中種子培養(yǎng)液的最低接種量 種子罐與發(fā)酵罐的容積比 生產(chǎn)規(guī)模 隨工藝條件的改變作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整 二 .種子質(zhì)量的判斷方法 通常檢測(cè)的培養(yǎng)液中參數(shù) pH是否在種子要求的范圍之內(nèi) 糖、氨基氮、磷酸鹽的含量 菌絲形態(tài)、菌絲濃度和培養(yǎng)液外觀 有無雜菌污染 其他參數(shù)，如接種前酶活、種子罐的 溶氧和尾氣等 種子制備 步驟： 斜面培養(yǎng)基中活化； 扁瓶固體培養(yǎng)基或搖瓶培養(yǎng)基中擴(kuò)大培 養(yǎng)，完成實(shí)驗(yàn)室種子制
4、備 一級(jí)種子罐，制備生產(chǎn)用種子；視情況 確定擴(kuò)大級(jí)數(shù)，完成生產(chǎn)車間種子制備； 種子轉(zhuǎn)種至發(fā)酵罐 三 .種子制備過程 實(shí)驗(yàn)室 種子制備階段：瓊脂斜面至 固體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)（如茄子瓶斜 面培養(yǎng)等或液體搖瓶培養(yǎng) 生產(chǎn)車間 種子制備階段：種子罐擴(kuò) 大培養(yǎng) 種子制備過程概覽 實(shí)驗(yàn)室階段： 不用種子罐，所用的設(shè)備為培養(yǎng)箱、搖床等實(shí)驗(yàn) 室常見設(shè)備，在工廠這些培養(yǎng)過程一般都在 菌種室 完成，因 此現(xiàn)象地將這些培養(yǎng)過程稱為實(shí)驗(yàn)室階段的種子培養(yǎng)。 生產(chǎn)車間階段 ： 種子培養(yǎng)在 種子罐 里面進(jìn)行，一般在工程歸為 發(fā)酵車間 管理，因此形象地稱這些培養(yǎng)過程為生產(chǎn)車間階段。 (一 )實(shí)驗(yàn)室種子制備 無菌方式接保藏的菌種至
5、斜面培養(yǎng)基上，成 熟后挑選正常菌落至試管斜面和搖瓶。 菌種產(chǎn)孢子能力強(qiáng)及孢子發(fā)芽、生長(zhǎng)繁殖迅 速，可用 固體培養(yǎng)基 培養(yǎng)孢子 菌種產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢，可用 搖 瓶液體培養(yǎng) 法 不產(chǎn)孢子的菌種，保藏基礎(chǔ)上，在一定溫度 下 活化 即可 兩個(gè)過程：在固體培養(yǎng)基上生產(chǎn)大量 孢子的 孢子制備 過程和在液體培養(yǎng)基上 生產(chǎn)大量菌絲的 種子制備 過程 孢子的產(chǎn)生條件？ I. 孢子制備 （ 1）放線菌孢子的制備 A .工藝過程 菌 種 母 斜 面 搖 瓶 種 子 種 子 罐 發(fā) 酵 罐 子 斜 面 B. 注意事項(xiàng) 限制碳源 (約 1%)和氮源 (不超過 0.5%) 培養(yǎng)溫度多為 28 ，少數(shù)為 37 ，
6、培 養(yǎng)時(shí)間為 514天 采用孢子進(jìn)罐：工藝簡(jiǎn)單，批間差異小， 便于控制孢子質(zhì)量；采用菌絲進(jìn)罐：可 縮短種子罐內(nèi)的培養(yǎng)時(shí)間 (尤適生長(zhǎng)緩慢 的菌種 ) 2.霉菌孢子的制備 注意 事項(xiàng) 天然農(nóng)產(chǎn)品 因具有獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)成分 和較大表面積而適合作霉菌的培養(yǎng)基 培養(yǎng)溫度多為 2528 ，培養(yǎng)時(shí)間為 414天 3. 細(xì)菌孢子的制備 注意事項(xiàng) 適合采用碳源限量而 氮源豐富 的培 養(yǎng)基 培養(yǎng)溫度多為 37 ，少數(shù)為 28 ，培養(yǎng)時(shí) 間細(xì)菌菌體為 12天， 產(chǎn)芽孢的細(xì)菌為 510天 II.種子制備 概念：指將固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)出的 孢 子或菌體 轉(zhuǎn)入到液體培養(yǎng)基種培養(yǎng)， 使其繁殖成大量 菌絲或菌體 的過程。 搖瓶種
7、子 種子罐種子 1. 搖瓶種子制備 A. 孢子發(fā)芽或 菌絲繁殖緩慢 的菌種需將孢 子經(jīng)搖瓶培養(yǎng)成菌絲后再進(jìn)入種子罐， 搖瓶具有 濃縮種子罐 的作用，其培養(yǎng)基 配方和培養(yǎng)條件與種子罐相似。 B. 種子培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)應(yīng)豐富完全，易被菌體 利用，濃度不宜過高 2 .種子罐種子制備 A. 孢子或搖瓶菌絲被接入體積較小的種子罐中，培養(yǎng) 后形成的大量菌絲，這種種子稱為 一級(jí)種子 B. 把一級(jí)種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中發(fā)酵，稱為二級(jí)發(fā)酵 種子擴(kuò)大培養(yǎng)階段 液體培養(yǎng)法：液體試管、三角瓶搖床 振蕩或回旋式培養(yǎng)。 表面培養(yǎng)法：茄子瓶、克氏瓶或瓷盤 培養(yǎng)。 固體培養(yǎng)法：三角瓶、蘑菇瓶、克氏 瓶、培養(yǎng)皿等麩皮培養(yǎng)。 實(shí)驗(yàn)室階段 種
8、子培養(yǎng)物 選擇的原則 A. 目的：種子擴(kuò)培到一定的量和質(zhì)，根據(jù)菌種的特點(diǎn)最 終的培養(yǎng)物可分為兩類： 對(duì)于 不產(chǎn)孢子 和芽胞的微生物 獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的 菌體 對(duì)于不產(chǎn)芽孢和孢子的微生物，實(shí)驗(yàn)室階段的種子擴(kuò)培 最終是獲得一定 數(shù)量和質(zhì)量 的 菌體 ，如谷氨酸的種子培 養(yǎng)。 獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的 孢子 菌絲體培養(yǎng)步驟少，因而 更容易獲得量和質(zhì)穩(wěn)定的 種子 ，但操作 繁瑣 。 對(duì)于產(chǎn)孢子 的微生物 獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的 菌絲體 便于操作，但需要更仔細(xì)的控制。 培養(yǎng)基的選擇應(yīng)該是有利于菌體的生長(zhǎng)，對(duì) 孢子培養(yǎng)基 應(yīng)該是有利于 孢子的生長(zhǎng) 。 B.在原料方面 ，實(shí)驗(yàn)室種子培養(yǎng)階段，規(guī)模一般比較小， 因
9、此為了保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，培養(yǎng)基的原料一般都比較 精細(xì) 。 起始接種物的傳代問題 細(xì)菌 保藏斜面 活化斜面 產(chǎn)孢子 保藏 母斜面 子斜面 目的 ：使菌種的 傳代次數(shù)盡可能的少 。 母瓶 ：活化、純化，使 保藏菌種生長(zhǎng) ，并去處變異株。 所以接種時(shí)要 稀一點(diǎn) 、便于純化生長(zhǎng)到單菌落。 子瓶 : 大量繁殖，得到大量孢子 。 接種：從母斜面上點(diǎn)接種，選取生長(zhǎng)好的單 菌落 接種時(shí) 密一點(diǎn)，得到大量的孢子 。 孢子培養(yǎng)時(shí)注意 濕度 ，子斜面使用一般不超過 1個(gè)月 孢子培養(yǎng) （二）生產(chǎn)車間種子制備 實(shí)驗(yàn)室制備的孢子斜面或搖瓶種子移接到種子 罐進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng) 種子罐培養(yǎng)一獲得足夠的菌種數(shù)量，二 種子 罐的培養(yǎng)基
10、接近發(fā)酵罐培養(yǎng)的醪液成分和培養(yǎng) 條件，使菌體適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境 種子罐級(jí)數(shù)越少，越有利于簡(jiǎn)化工藝和控制， 并減少由于多次轉(zhuǎn)種而帶來的染菌機(jī)會(huì)以及 減少因種子罐生長(zhǎng)異常而造成的發(fā)酵波動(dòng) 但考慮能否在一定時(shí)間內(nèi)獲得優(yōu)質(zhì)、足量的 種子以滿足發(fā)酵的需求 1。生產(chǎn)車間階段種子培養(yǎng)物的 選擇原則 在 生產(chǎn)車間 階段，最終一般都是獲得一定數(shù)量的 菌絲體 。 縮短發(fā)酵時(shí)間 有利于獲得好的發(fā)酵結(jié)果 菌絲體 比孢子要有利： 目的：獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的 菌體 ，因此培養(yǎng)基的選擇應(yīng) 首先考慮的是有利于孢子的發(fā)育和菌體的生長(zhǎng)，所 以 營(yíng)養(yǎng) 要比發(fā)酵培養(yǎng)基豐富。 在原料方面 ：不如實(shí)驗(yàn)室階段那么精細(xì)，而是 基本接近于 發(fā)酵培養(yǎng)
11、基 ，這有兩個(gè)方面的原因 : 一是 成本 二是 馴化 例：檸檬酸發(fā)酵 （ 黑曲霉 ） 以蔗糖為原料 成分 斜面 種子罐 發(fā)酵 麥芽汁 麥汁 蔗糖 2.5-5% 20% NH4NO3 0.225% 0.11% K2HPO4 0.03% MgSO4.H2O 0.025% 0.025% KCl 0.015% 瓊脂 2% 薯干粉 成分 斜面 種子罐 發(fā)酵 麥芽汁 麥汁 薯干粉 10% 22-28% (NH4)2SO4 0.5% 瓊脂 2% 種子制備過程舉例 一、谷氨酸生產(chǎn)的種子制備 制備過程 斜面菌種 一級(jí)種子培養(yǎng) 二級(jí)種子培養(yǎng) 發(fā)酵 1、斜面 培養(yǎng)基：蛋白胨 1%，牛肉膏 1%，氯化鈉 0.5 瓊脂
12、 2%， pH 7.0-7.2 培養(yǎng)基特點(diǎn)： 有利于菌體的生長(zhǎng)，原料比較精細(xì) 培養(yǎng)條件： 32 ，生長(zhǎng) 18-24小時(shí) 生長(zhǎng)斜面要求： 生長(zhǎng)良好，所使用 斜面連續(xù)傳代不超過 3次 2. 一級(jí) 種子（ 搖瓶 ） 培養(yǎng)條件：于 1000ml三角瓶中，裝液 200-250ml,32 培 養(yǎng) 12小時(shí)。 培養(yǎng)基： 葡萄糖 2%，尿素 0.5%，玉米漿 2.5%， K2HPO4 0.1% 培養(yǎng)基特點(diǎn)： 有利于菌體的生長(zhǎng)，所使用的原料已經(jīng)基 本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基 3. 二級(jí)種子 (種子罐 ) 培養(yǎng)條件：在 種子罐 中培養(yǎng)（容積為發(fā)酵罐的 1%）， 32 培養(yǎng) 7-10個(gè)小時(shí) 培養(yǎng)基：和一級(jí)種子相似，其中葡萄
13、糖用 水解糖 代替， 濃度為 2.5% 培養(yǎng)基的特點(diǎn) ：長(zhǎng)菌體，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基 種子的質(zhì)量要求： 108-109個(gè) /ml 大小均勻，呈單個(gè)或八字排列 PH 7.0-7.2時(shí)結(jié)束， 6.887.0 -7.2 活力旺盛 二、青霉素生產(chǎn)的種子制備 制備過程 安培管 斜面孢子 大米孢子 一級(jí)種子 二級(jí)種子 發(fā)酵 1、斜面孢子 培養(yǎng)基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等 培養(yǎng)基特點(diǎn) ： 有利于 長(zhǎng)孢子 ，用量少而精細(xì) 培養(yǎng)條件： 25 、 7天 , 注意濕度 50%左右 2、大米孢子 培養(yǎng)基：大米及 氮源（玉米漿） 培養(yǎng)基的特點(diǎn) ： 成本低、米粒之間結(jié)構(gòu)疏松提高比表 面積和氧的傳質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)適當(dāng)（要求 大米
14、的白點(diǎn)小 ）有利于孢子的生長(zhǎng)。 培養(yǎng)條件： 25 、 7天，控制濕度 大米孢子的要求 ： 1粒米含 1.4*106個(gè)孢子 3、一級(jí)種子 培養(yǎng)基：（ 葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米 漿 目的 ： 長(zhǎng)菌體 培養(yǎng)條件： 27 ， 40小時(shí) 接種量： 200億孢子 /噸 4、二級(jí)種子 培養(yǎng)基：同上 培養(yǎng)條件： 27 、 10-14小時(shí) 接種量： 10% 種子的質(zhì)量要求 菌絲長(zhǎng)稠呈絲狀、菌絲團(tuán)很少，有中小空孢，處于 期 青霉素發(fā)酵菌絲體的生長(zhǎng)共分為 6個(gè)期 ， 1-4為年青期 ， 4-6期合成青霉素的能力最強(qiáng) 四 .影響種子質(zhì)量的因素 原材料質(zhì)量 培養(yǎng)溫度 濕度 通氣與攪拌 斜面冷藏時(shí)間 培養(yǎng)基 pH 培養(yǎng)
15、基，培養(yǎng)條件，種齡，接種量： 原材料質(zhì)量 原材料質(zhì)量波動(dòng)引起種子質(zhì)量不穩(wěn)定 原材料質(zhì)量波動(dòng)的主要原因：無機(jī)離子 含量不同（微量元素 Mg2+、 Cu2+、 Ba2+ 能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少 也會(huì)影響孢子的質(zhì)量）。 培養(yǎng)溫度 溫度過低，菌種生長(zhǎng)發(fā)育緩慢 溫度 過高 會(huì)使菌絲 過早自溶 在制備土霉素生產(chǎn)種子過程中， 高于 37 培養(yǎng)時(shí)， 孢子接入發(fā)酵罐后表現(xiàn)出糖代謝變慢，氨 基氮回升提前，菌絲過早自溶，效價(jià)降低等現(xiàn)象。 濕度 濕度 低 ，孢子生長(zhǎng) 快 ； 濕度大，孢子生長(zhǎng)慢 制備土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌孢子時(shí) 發(fā)現(xiàn)，在含有少量水分的試管斜面培養(yǎng)基下 部孢子長(zhǎng)得較好，而斜面 上部 由于水
16、分迅速 蒸發(fā)呈 干癟狀，孢子稀少 通氣與攪拌 足夠的通氣量，以保證菌種代謝正 常，提高種子的質(zhì)量 攪拌可提高通氣效果，促進(jìn)生長(zhǎng)繁 殖，過度攪拌導(dǎo)致培養(yǎng)液大量涌泡， 液膜表面的酶易氧化變性，泡沫過 多增加染菌機(jī)會(huì)，增加能耗。 絲狀微生物不宜劇烈攪拌。 斜面冷藏時(shí)間 對(duì)孢子的生產(chǎn)能力有較大影響 冷藏時(shí)間越長(zhǎng)，生產(chǎn)能力下降越多 鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在 6 冷藏兩 個(gè)月后的發(fā)酵單位比冷藏一個(gè)月的降低 18， 比冷藏 3個(gè)月的降低 35。 培養(yǎng)基 培養(yǎng)種子的目的： 擴(kuò)大培養(yǎng)，增加細(xì)胞數(shù)量； 同時(shí)也必須培養(yǎng)出強(qiáng)壯、健康、活性 高的細(xì)胞。為了使細(xì)胞迅速進(jìn)行分裂 或菌絲快速生長(zhǎng)。 有較完全和豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，
17、糖分少，需充足 氮源和生長(zhǎng)因子，無機(jī)氮源比例大； 各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度不必太高； 供孢子用的種子培養(yǎng)基，可添加易被吸收利 用的碳源和氮源； 應(yīng)考慮與發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分相近 。 種子培養(yǎng)基特點(diǎn) pH 選擇最適種子培養(yǎng) pH的原則是獲得 最大比生長(zhǎng)速率和適當(dāng)?shù)木?培養(yǎng)最后一級(jí)種子的培養(yǎng)基的 pH應(yīng) 接近于發(fā)酵培養(yǎng)基的 pH，以便種子 能盡快適應(yīng)新的環(huán)境 種齡與接種量 （一）種齡 種子罐中培養(yǎng)的菌體從開始移入下一級(jí)種 子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間 種子培養(yǎng)期應(yīng)取菌種的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為宜， 菌種過嫩或過老，不但延長(zhǎng)發(fā)酵周期，而 且會(huì)降低產(chǎn)量。 大量地接入培養(yǎng) 成熟 的菌種的優(yōu)點(diǎn)： 縮短生長(zhǎng)過程的延緩期，因而
18、縮短了 發(fā)酵周期，提高了設(shè)備利用率 節(jié)約發(fā)酵培養(yǎng)的動(dòng)力消耗 有利于減少染菌機(jī)會(huì) 放射形土壤桿菌多糖（ ARPS） 發(fā)酵過程中不同的種齡對(duì)多糖產(chǎn)量的影響 （舒琴） 鏡檢： 24小時(shí)多個(gè)桿菌首位相連成線形，處于繁殖旺盛期 30小時(shí)開始出現(xiàn)芽孢 種齡短：菌體 太少 ；種齡長(zhǎng)：易 老化 。 種齡選擇原則： 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末 ，細(xì)胞活力強(qiáng)，菌體濃 度相對(duì)較大，但是最終由實(shí)驗(yàn)結(jié)果定。 （二）接種量： 移入的種子液體積和接種 后培養(yǎng)液體的體積的 比例 接種量過多，菌絲生長(zhǎng)過快、溶氧不足，衰 老細(xì)胞增加等，發(fā)酵后勁不足 種量過少延長(zhǎng)發(fā)酵周期，形成異常形態(tài)，而 且易造成染菌。 以生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中的繁殖速度為依據(jù)
19、接種量的大小直接影響發(fā)酵周期。 移入 種子的體積 接種量 接種后 培養(yǎng)液的體積 在放射形土壤桿菌多糖（ ARPS） 發(fā)酵過程中不同的接種量對(duì)多糖產(chǎn)量的影響 接種量對(duì)菌體形態(tài)和產(chǎn) 亞麻酸的影響 （楊博 亞麻酸是一種人體必需多價(jià)不飽和脂肪酸，它是人體 前 列腺素 的前體物質(zhì)，在預(yù)防與 治療心腦血管疾病、糖尿病 治療、增強(qiáng)免疫力、抗癌和保護(hù)皮膚 等方面具有重要的生理 功能。因發(fā)酵法生產(chǎn) 亞麻酸與從 天然植物提取 相比具有一 系列優(yōu)點(diǎn)，發(fā)酵法生產(chǎn) 亞麻酸成了當(dāng)今研究的一個(gè)熱點(diǎn)。 亞麻酸發(fā)酵一般是采用 絲狀真菌 來進(jìn)行，絲狀真菌的 形態(tài)往往對(duì)發(fā)酵有較明顯的影響，而絲狀真菌發(fā)酵 亞麻酸 時(shí)菌絲體形態(tài)的不同
20、對(duì)發(fā)酵的影響很少有報(bào)道。 采用被孢霉進(jìn)行 亞麻酸發(fā)酵時(shí)接種量可以明顯影響 菌絲體 研究發(fā)現(xiàn)，采用被孢霉進(jìn)行 亞麻酸發(fā)酵時(shí)接種量可以明顯 影響 菌絲體的形態(tài) ，從而影響菌體干重和 亞麻酸產(chǎn)量 。 接種量過大過小都不好，最終以實(shí)踐定，如 大多數(shù)抗 生素為 7-15%。但是一般認(rèn)為大一點(diǎn)好。 雙種 ：兩個(gè)種子罐接種到一個(gè)發(fā)酵罐中。（ 加大接種量 ） 倒種 ：一部分種子來源于種子罐，一部分來源于發(fā)酵罐。 種子罐染菌或種子質(zhì)量不理想可采樣倒種法，以適宜的發(fā)酵罐倒 出部分給另一發(fā)酵罐。 小結(jié) 二 生產(chǎn)菌種的質(zhì)量控制 A. 影響 孢子 質(zhì)量的因素及控制 培養(yǎng)基 a) 培養(yǎng)基的原材料 的產(chǎn)地 、品種、加工方法
21、 和用量對(duì)孢子質(zhì)量都有一定影響 b) 減少 水質(zhì) 影響的方法：在蒸餾水或無鹽水 中加入適量無機(jī)鹽，供配制培養(yǎng)基使用 c) 斜面培養(yǎng)基的主要材料經(jīng)化學(xué)分析和搖瓶發(fā)酵 試驗(yàn)合格后 才 能用于孢子培養(yǎng)基 d) 應(yīng)保證培養(yǎng)基 滅菌 后的 質(zhì)量 e) 水份適中 有利于孢子生長(zhǎng)，因此斜面培養(yǎng)基使用前應(yīng)于一定 溫度下放置一定時(shí)間，使斜面 無冷凝水 兩條經(jīng)驗(yàn)： 1. 供 生產(chǎn)用的孢子 培養(yǎng)基或作為沙土孢子或傳代所用的培養(yǎng)基 宜用 單一氮源 ，以保持正常菌落的優(yōu)勢(shì)。 2. 作為選種或 分離用 的平板培養(yǎng)基，則需采用較復(fù)雜的 有機(jī)氮 源 ，目的是便于選擇特殊代謝菌落。 溫度和濕度 a) 提高培養(yǎng)溫度，可加速菌體代
22、謝，縮短 培養(yǎng)時(shí)間，但 不可超過 菌體敏感溫度 a) 相對(duì)濕度對(duì)孢子形成的速度、數(shù)量和質(zhì) 量均有影響，北 40 45%方南方 35 42%。 培養(yǎng)時(shí)間和冷藏時(shí)間 a) 孢子培養(yǎng)時(shí)間 孢子培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)控制在孢子量多、孢子 成熟、發(fā)酵產(chǎn)量正常的階段終止培養(yǎng) 一般， 衰老 的孢子核物質(zhì)趨于分化，因 此不如年輕的孢子，但 過于年輕的孢子 經(jīng)不起冷藏 b) 孢子冷藏時(shí)間 原則： 宜短 不宜長(zhǎng) 舉例 土霉素 菌種斜面培養(yǎng) 4.5d，冷藏 7 8d開 始自溶，如培養(yǎng) 5d，冷藏 20d也不自溶。 接種量 a) 應(yīng) 適中 b) 傳代用的 斜面 孢子要求菌落分布 較稀 ， 適于挑選單個(gè)菌落進(jìn)行傳代培養(yǎng) c) 接種
23、 搖瓶或進(jìn)罐 的斜面孢子 要求菌落 密 度適中或稍密 ，孢子數(shù)達(dá)到要求標(biāo)準(zhǔn)， 一只高度為 20cm 、直徑為 3cm的試管斜 面，絲狀菌孢子數(shù)要求達(dá) 107 d) 接入種子罐的孢子接種量對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)也 有影響 B. 影響 種子 質(zhì)量的因素及控制 培養(yǎng)基 a) 應(yīng)養(yǎng)成分適當(dāng) 豐富和完全 ，易于被菌 體直接吸收和利用，利于孢子發(fā)芽和 菌絲生長(zhǎng) b) 營(yíng)養(yǎng)成分 盡可能和發(fā)酵培養(yǎng)基接近 c) pH值穩(wěn)定 ，濃度 較稀 培養(yǎng)條件 a) 采用最適溫度 b) 根據(jù)不同時(shí)期需氧量不同控制通氣 攪拌 ， 一般， 前期較少，后期增加 c) 產(chǎn)品小罐生產(chǎn)，可采用 補(bǔ)料 工藝提高種 子質(zhì)量 d) pH控制 種齡 種子培
24、養(yǎng)時(shí)間 a) 一般選擇生命力極旺的 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 ， 菌體尚 未達(dá)到最高峰時(shí) 移種 b) 一般細(xì)菌最適種齡 7 24h，霉菌最適 種齡 16 50h，放線菌最適種齡 21 64h c) 同一菌種采用不同工藝，或不同批次 種子質(zhì)量不同 接種量 a) 移入發(fā)酵罐的種子液的體積和接種后培養(yǎng)液的體積 的比例，稱接種量 b) 較大接種量 可縮短發(fā)酵罐中菌體繁殖至最高峰所需 時(shí)間，加快產(chǎn)物合成，但 過大 易造成營(yíng)養(yǎng) 不足和溶 氧缺乏 c) 過小接種量已造成營(yíng)養(yǎng)缺乏，發(fā)酵異常 d) 加大接種量可采用 雙種法 ，兩個(gè)種子罐的種子接入 一個(gè)發(fā)酵罐；種子罐染菌或種子質(zhì)量不理想可采樣 倒種法 ，以適宜的發(fā)酵罐倒出部分
25、給另一發(fā)酵罐 五 .種子質(zhì)量的控制措施 菌種穩(wěn)定性的檢查 測(cè)定其生產(chǎn)能力，從中挑選高產(chǎn)菌株，并 及時(shí)對(duì)退化菌種進(jìn)行復(fù)壯 提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境 種子無雜菌檢查，保證純種發(fā)酵。 種子液生化分析項(xiàng)目主要有：營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的消 耗速度、 pH變化、溶氧變化、色澤和氣味等 種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞或菌體 生化指標(biāo) 產(chǎn)物生成量 酶活力 種子異常的的分析 菌種生長(zhǎng)過快或過慢、菌絲結(jié)團(tuán)、菌 絲粘壁 種子制備的放大原理與技術(shù) 細(xì)菌發(fā)酵時(shí)的種子擴(kuò)大培養(yǎng)； 細(xì)菌發(fā)酵過程中種子擴(kuò)大培養(yǎng)的主要目的是 為了獲得大量的活力強(qiáng)的種子 ； 種齡對(duì)于生芽孢的種子尤其重要。若接種物 含大量芽孢，將給后續(xù)發(fā)酵帶來較長(zhǎng)遲滯期 梭狀芽孢桿菌 發(fā)酵 丁
26、醇丙酮 時(shí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的程序 舉 例： 酵母發(fā)酵時(shí)的種子擴(kuò)大培養(yǎng) 釀酒酵母的擴(kuò)大培養(yǎng) 最初采用純種進(jìn)行酵母發(fā)酵并設(shè)計(jì)出 酵母繁殖流程，他將每一步的接種量 規(guī)定為 10，并控制繁殖條件與釀造 時(shí)一致 現(xiàn)代的流程中，接種量為 1%或更低， 控制的條件也與釀造時(shí)不同。 絲狀真菌發(fā)酵的種子擴(kuò)大培養(yǎng) 絲狀真菌既可以利用孢子，也可以 利用菌絲體作為接種物接種到發(fā)酵罐 進(jìn)行發(fā)酵 在固化的培養(yǎng)基上產(chǎn)生孢子 “ 滾瓶 ” 技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)黃青霉的孢子生產(chǎn) 在固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生孢子 在谷類的顆粒表面形成大量的孢子 在液體深層培養(yǎng)基中產(chǎn)生孢子 真菌利用 孢子 作為接種物 灰黃霉素產(chǎn)生菌 展青霉 一試驗(yàn)表明在良好的 通氣條
27、件下，培養(yǎng)基中含氮是在 0.05 0.1 （ w/v）之間時(shí)，可以產(chǎn)生大量的孢子 絲狀真菌的 菌絲體 作為接種物 不能產(chǎn)生無性孢子的用繁殖體菌絲作 為接種物，如生產(chǎn)赤霉素的菌種 藤倉赤霉 問題：難以獲得均一的接種物 接種前將菌絲打成碎片，形成大量的 菌絲段，它具有大量的生長(zhǎng)點(diǎn) 放線菌發(fā)酵時(shí)的種子擴(kuò)大培養(yǎng) 斜面培養(yǎng)，制備孢子懸浮液作初級(jí) 種子 可用培養(yǎng)搖瓶菌絲體作為初級(jí)種子 量：要求達(dá)到一定的濃度 質(zhì) : 形態(tài) （生長(zhǎng)處于某個(gè)階段、均勻等等） 理化指標(biāo)： C、 N、 P的含量， pH 酶活等 無污染 種子質(zhì)量要求小結(jié)： 本章小結(jié)： 了解種子擴(kuò)培的工藝過程及其中的基本概念 理解種子擴(kuò)培的目的和要求 掌握控制種子質(zhì)量的基本方法和手段
發(fā)酵種子制備與發(fā)酵機(jī)制
