《植物生物反應(yīng)器》PPT課件

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1、1,第6章 植物生物反應(yīng)器,2,第6章 植物生物反應(yīng)器,第1節(jié) 植物生物反應(yīng)器概述 第2節(jié) 植物生物反應(yīng)器的醫(yī)藥工程 第3節(jié) 植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)其他有機(jī)物 第4節(jié) 植物生物反應(yīng)器的研制策略 第5節(jié) 存在問題和可能的解決方法,3,第1節(jié) 植物生物反應(yīng)器概述,生物反應(yīng)器 生物技術(shù)產(chǎn)品生產(chǎn)中的主體設(shè)備。 生物反應(yīng)器是可用來進(jìn)行微生物或基因工程細(xì)胞發(fā)酵或利用酶進(jìn)行生化反應(yīng)者。 機(jī)械攪拌式發(fā)酵槽應(yīng)用最廣。 利用動(dòng)物、植物本身作為反應(yīng)器。,4,近年來，轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器來表達(dá)外源蛋白(包括疫苗、抗體、藥用蛋白)，即所謂的“分子農(nóng)業(yè)(molecular farming)”已成為植物基因工程領(lǐng)域內(nèi)一個(gè)研

2、究的生長(zhǎng)點(diǎn)，具有極大的市場(chǎng)前景和商業(yè)價(jià)值。 目前，已用于生物反應(yīng)器的植物有煙草、擬南芥、大豆、小麥、水稻、玉米、油菜、馬鈴薯、西紅柿等。 本章將就這一領(lǐng)域的發(fā)展現(xiàn)狀，存在的問題及前景進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。,5,1.1 植物生物反應(yīng)器的概念,說法1：植物生物反應(yīng)器，就是利用植物這個(gè)系統(tǒng)，包括植物細(xì)胞、組織器官，以及整株植物為工廠來生產(chǎn)具有商業(yè)價(jià)值的生物制品包括疫苗、抗體、藥用蛋白等等。,6,說法2：植物生物反應(yīng)器是指通過基因工程途徑，以植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)或整株植物為“工廠”，大量生產(chǎn)藥物、工農(nóng)業(yè)用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂類等有機(jī)化合物。,7,廣義上講，植物生物反應(yīng)器不僅僅指經(jīng)基因工程改造的植

3、物細(xì)胞、組織器官以及整株植物，也包括天然的植物，例如一些天然植物的次生代謝產(chǎn)物也具有重要的藥用價(jià)值。,8,1.2 植物生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn),1.2.1 植物是最經(jīng)濟(jì)的蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng) 種植植物所需要的僅是陽光,來自土壤或肥料的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)、水分。這一點(diǎn)明顯優(yōu)于微生物發(fā)酵和動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)，因?yàn)槲⑸锇l(fā)酵需要昂貴的設(shè)備投入，而動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)需要昂貴的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，而且要保持無菌的生產(chǎn)條件。,9,1.2.2 植物可以大規(guī)模種植,而且產(chǎn)物貯藏在種子、果實(shí)、塊莖中便于貯運(yùn),例如，在室溫條件下經(jīng)過5個(gè)月儲(chǔ)存的水稻種子中，scFv(single chain Fv)的含量和活性沒有明顯的損失。在4條件下，儲(chǔ)存18個(gè)月的鈴

4、薯仍保留50%的有活性的抗體。,10,相關(guān)知識(shí),單鏈抗體(Single-chain Fv，ScFv)是將抗體變異區(qū)(fragment of variable region，F(xiàn)v)中的重鏈變異區(qū)(variable region of heavy chain，VH)和輕鏈變異區(qū)(variable region of light chain ，VL)以人為的連接子(linker)連接起來，是深具應(yīng)用潛力的蛋白質(zhì)工程產(chǎn)物。具有分子量小、組織穿透能力強(qiáng)及免疫原性低等特點(diǎn)，在疾病的診斷及治療應(yīng)用方面具有很大潛力。,11,1.2.3 植物具有完整的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),表達(dá)產(chǎn)物能進(jìn)行正確的折疊裝配，及糖基化、磷

5、酸化、酰胺化，從而具有與高等動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)物基本一致的免疫原性和生物活性。,12,1.2.4 植物生物反應(yīng)器的表達(dá)產(chǎn)物具有無毒性和副作用,安全可靠,無殘存DNA和潛在致病致癌性,用動(dòng)物細(xì)胞作為生物反應(yīng)器,則有可能因?yàn)閯?dòng)物本身攜帶的致病原而對(duì)人的健康造成威脅。,13,由于植物具有上述優(yōu)勢(shì),所以分子農(nóng)業(yè)的設(shè)想在20世紀(jì)80年代末一經(jīng)提出,就成為轉(zhuǎn)基因植物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 目前,在植物生物反應(yīng)器上已取得一定成績(jī),這主要表現(xiàn)在3個(gè)方面： 一是在植物中表達(dá)抗體 二是利用植物生產(chǎn)疫苗 三是利用植物生產(chǎn)其他藥用蛋白。,14,第2節(jié) 植物生物反應(yīng)器應(yīng)用研究,2.1 植物抗體 2.2 口服疫苗 2.3 其他藥

6、用蛋白,15,2.1 植物抗體,抗體(antibody)是動(dòng)物體液中的一系列球蛋白,稱為免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)。它們可介導(dǎo)動(dòng)物的體液免疫反應(yīng)。 將編碼全抗體或抗體片段的基因?qū)胫参?在植物中表達(dá)出具有功能性識(shí)別抗原及結(jié)合特性的全抗體或部分抗體片段即植物抗體。,16,植物抗體最大的優(yōu)點(diǎn)是使生產(chǎn)抗體更加方便和廉價(jià)。尤其在生產(chǎn)單克隆抗體方面,利用植物生產(chǎn)要比雜交瘤細(xì)胞低廉的多。 據(jù)估計(jì) ，在250m2的溫室中利用苜蓿生產(chǎn)IgG的成本約為500600美元/g，而利用雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)抗體的成本約為5000美元/ g 。,17,因此,利用植物生產(chǎn)抗體具有廣闊的市場(chǎng)前景。目前,利用轉(zhuǎn)

7、基因植物表達(dá)的抗體包括完整的抗體分子、分泌型抗體IgA、IgG、單鏈可變區(qū)片段(scFv)、Fab片段、雙特異性scFv片段以及嵌合型抗體等不同類型的抗體。,18,Ma等（1995）將鼠的單克隆抗體的J鏈、雜合的IgA-G重鏈、鼠的J鏈和兔的SC鏈、分別轉(zhuǎn)化煙草，獲得4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，經(jīng)后代連續(xù)的有性雜交，得到同時(shí)表達(dá)4個(gè)蛋白質(zhì)鏈的轉(zhuǎn)基因植株，這4種蛋白質(zhì)鏈能組裝成一個(gè)有功能的分泌型免疫球蛋白。,19,McCormick等（1999）利用煙草花葉病毒(TMV)為載體在煙草中瞬時(shí)表達(dá)了一種腫瘤起源的scFv，該抗體是淋巴瘤特異的疫苗，經(jīng)過這種疫苗免疫的小鼠能夠產(chǎn)生10Lg/ml以上的抗獨(dú)特性抗體，

8、能夠抵制致死劑量的腫瘤。 Zeitlin等（1998）將人抗單純皰疹病毒(anti-herpessimplex virus，HSV)的抗體在大豆中表達(dá)，其效果已在小鼠模型中得到證實(shí)，能夠預(yù)防HSV-2的傳播。,20,Ma等(1998)將引起齲齒的鏈球菌(Sreptpcpccus mutants)表面抗原的嵌合抗體IgA-G引入到煙草中，該抗體對(duì)抑制鏈球菌(Sreptpcpccus mutants)的作用與雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體一樣。 臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該抗體可以有效清除人口腔內(nèi)的變異鏈球菌(S.mutans)，并預(yù)防志愿者口腔產(chǎn)生齲齒。目前已被作為牙膏的一種成分，進(jìn)入二期臨床試驗(yàn)。,21,Stoge

9、r （2000）等在水稻和小麥中成功表達(dá)了癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)的scFv抗體，CEA是一種腫瘤相關(guān)標(biāo)記抗原，可以利用CEA的抗體進(jìn)行癌癥的治療。,Carcinoembryonic Antigen (CEA) Carcinoembryonic antigen (CEA) preparation.,22,Hull等（2005）在煙草中表達(dá)了炭疽桿菌保護(hù)抗原特異性單克隆抗體,在活體內(nèi)外均表現(xiàn)出毒素中和活性,這項(xiàng)研究表明用植物生產(chǎn)炭疽桿菌單克隆抗體可以成功地用于預(yù)防。,23,在放大31207倍的高倍顯微鏡下，拍到了斯特恩炭疽桿菌的孢子。這些孢子可存活很

10、多年，這使得炭疽桿菌能在休眠狀態(tài)下存活。,24,能生產(chǎn)狂犬病抗體的煙草,25,植物不僅作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)抗體用于醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)，而且植物抗體介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)在植物抗病育種上也很值得研究。 Fecker等(2000)將抗甜菜壞死黃脈病毒(BNYVV)的外殼蛋白基因的scFv轉(zhuǎn)化煙草，產(chǎn)生的scFv定位于細(xì)胞質(zhì)中或通過末端的連接信號(hào)肽而分泌到質(zhì)外體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)scFv的植株出現(xiàn)癥狀的時(shí)間明顯遲于對(duì)照。,26,另外，在植物細(xì)胞中表達(dá)具有催化或鈍化酶和激素作用的抗體，從而對(duì)細(xì)胞代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)，這對(duì)于植物代謝機(jī)理的研究非常有用。,27,2.2 口服疫苗,傳染病嚴(yán)重威脅人類的生命和健康，一直以來人類獲得免疫預(yù)防主要

11、通過疫苗接種。但在發(fā)展中國(guó)家，昂貴的疫苗造成數(shù)百萬人尤其是兒童依然死于傳染病。 目前利用植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服疫苗，極大降低了疫苗的生產(chǎn)成本，并且研究表明植物疫苗確實(shí)可以使人和動(dòng)物產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答，因此這一新技術(shù)將有助于疫苗的普及從而改善發(fā)展中國(guó)家人民的健康狀況。,28,轉(zhuǎn)基因植物疫苗是把植物基因工程技術(shù)與機(jī)體免疫機(jī)理相結(jié)合,生產(chǎn)出能使機(jī)體獲得特異抗病能力的疫苗。 轉(zhuǎn)基因植物疫苗有兩個(gè)研究方向: 一種是利用植物生產(chǎn)大量的蛋白質(zhì)抗原，經(jīng)分離和提純?cè)僦苽涑梢呙纾?另一種是不需要分離和提純，將植物或其某部分作為可以直接口服的疫苗。與注射疫苗相比,可食疫苗具有成本低,便于運(yùn)輸儲(chǔ)存及使用方便等優(yōu)點(diǎn)

12、,因此成為基因工程疫苗的研究熱點(diǎn)。,29,目前，科學(xué)家正在進(jìn)行植物源性的抗癌疫苗、抗艾滋病疫苗、抗糖尿病疫苗以及利用植物生產(chǎn)加強(qiáng)免疫效應(yīng)的輔助佐劑方面的研究 。 Tacket等（2000）將轉(zhuǎn)諾沃克病毒外殼蛋白基因的馬鈴薯讓20個(gè)志愿者服用，結(jié)果19個(gè)人產(chǎn)生特異性IgG，6個(gè)人產(chǎn)生特異性IgA，說明95%的人對(duì)諾沃克病毒產(chǎn)生了抵抗力。,30,Shchelkunov等（2006）首次研究了一種能同時(shí)抗兩種病毒的疫苗，將編碼艾滋病病毒中致免疫的ENV、GAC抗原表位及乙肝表面抗原的嵌合基因?qū)敕巡⒌靡员磉_(dá)。,31,Li等（2006）將霍亂毒素B亞基ctb基因融合到糖尿病自身抗原基因中，用來轉(zhuǎn)化低

13、煙堿煙草，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行功能性分析后，發(fā)現(xiàn)該融合蛋白具有與天然CTB一樣的生物活性及免疫活性，包括GM1神經(jīng)節(jié)苷酯受體結(jié)合能力，表明CTB3/InsB3 融合蛋白可通過誘導(dǎo)口服免疫耐受能力來預(yù)防和治療自身免疫糖尿病。,32,迄今在植物中表達(dá)的疫苗有幾十種，包括乙肝病毒表面抗原(hepatitisB surface antigen， HbsAg)，諾沃克病毒(Norwalk virus)外殼蛋白、大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素B亞基(LT-B)、霍亂毒素的A，B亞基(CT-A，B)、冠狀病毒(Corona virus)的免疫原糖蛋白S多肽、狂犬病毒糖蛋白、口蹄疫病毒(foot-andmouth diseas

14、evirus)抗原、水貂腸炎病毒抗原、犬細(xì)小病毒抗原。,33,研究人員用于表達(dá)疫苗的植物多為煙草、馬鈴薯、西紅柿，但這些植物作為口服疫苗都存在缺點(diǎn)，如煙草不能食用，馬鈴薯不易生食，而西紅柿不易長(zhǎng)期貯存。 因此更宜于生產(chǎn)口服疫苗的是那些含有大量可溶性蛋白、耐貯運(yùn)的種子植物，特別是水稻、小麥、玉米，其胚乳中含有豐富可溶性蛋白能夠與種子其余部分分開，從而降低植物疫苗服用劑量。 此外，植物必須高水平表達(dá)疫苗才能達(dá)到口服免疫的效果。 ,34,2.3 其他藥用蛋白,植物作為生物反應(yīng)器除了可以生產(chǎn)抗體疫苗外，還可表達(dá)細(xì)胞因子、酶及其它藥用蛋白和生物活性肽等。 但是利用植物生產(chǎn)上述細(xì)胞因子、酶、藥用蛋白和生物

15、活性肽等需要下游純化，只有它占總可溶性蛋白(Total soluble protein，TSP)的1%以上才具有商業(yè)開發(fā)的價(jià)值。,35,Verwoerd等（1995）將黑曲霉的肌醇六磷酸酶(即植酸酶)基因轉(zhuǎn)入煙草，在成熟種子中植酸酶占總可溶性蛋白的1%。 Witcher等（1998）利用轉(zhuǎn)基因玉米生產(chǎn)重組的-葡萄苷酸酶(GUS)，表達(dá)水平高達(dá)種子總可溶性蛋白的0.7%，且生物活性與天然的的GUS相同。,植物性飼料中，約有70%的磷以植酸磷的形式存在。由于單胃動(dòng)物消化道中缺乏分解植酸磷的植酸酶，故導(dǎo)致植物性飼料中總磷的消化利用率很低。植酸酶可水解植酸，提高植物性飼料中總磷的利用率。,36,Hoo

16、d等（1997）在轉(zhuǎn)基因玉米中成功表達(dá)了重組抗生物素蛋白，其表達(dá)量占總可溶性蛋白的2%。與從雞蛋清中提取的相比具有相同的功效而成本卻大大降低了?，F(xiàn)已成為Sigma-Aldrich的商品。 Moloney （1997）等將人的亮氨酸腦啡肽基因?qū)胗筒酥?，先以種子貯藏蛋白2S清蛋白的形式表達(dá)，再用胰蛋白酶水解，獲得的腦啡肽產(chǎn)量達(dá)到220nmol/g種子，腦啡肽臨床可作為止痛劑或鎮(zhèn)定劑。,37,此外，在轉(zhuǎn)基因油菜種子油體中高效表達(dá)的水蛭素目前已經(jīng)在加拿大投入商業(yè)生產(chǎn)，這是第一個(gè)用來商業(yè)開發(fā)的范例。,38,水蛭素是水蛭（螞蟥）的唾液腺分泌的一種酸性多肽，是目前已知的最強(qiáng)有力的凝血酶的天然抑制劑。對(duì)多種

17、血栓疾病如靜脈血栓、彌散性血管內(nèi)凝血、腦凝血、血栓靜脈炎及冠狀動(dòng)脈血栓都有預(yù)防和治療效果，特別是對(duì)外科手術(shù)后及深栓治療后的再栓塞有重要的預(yù)防和治療效果。因此，水蛭素將成為新的抗凝血抗血栓形成的藥物。,39,Sijmous等人將人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)編碼區(qū)與煙草的一個(gè)蛋白分泌信號(hào)肽序列的融合基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯，表達(dá)的融合蛋白占總可溶性蛋白的0.02%.,40,此外在植物中表達(dá)的其它人源蛋白的含量也很低。例如B-干擾素的含量低于0.03%(鮮重)、促紅細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EPO)占總可溶性蛋白的0.003%。人工合成的人表皮因子在煙草中的表達(dá)量?jī)H達(dá)到總可溶性蛋白的0.

18、001%，因此尚不具備開發(fā)價(jià)值，需通過進(jìn)一步的研究來提高表達(dá)量。,41,胰島素,42,43,第3節(jié) 植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)其他有機(jī)物,關(guān)于工農(nóng)業(yè)用蛋白質(zhì)在植物中表達(dá)的報(bào)道： 首先進(jìn)行商品化的兩種轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的蛋白分別是利用轉(zhuǎn)基因玉米生產(chǎn)的雞源抗生素（親和素）和大腸桿菌來源的葡糖醛酸酶，它們都應(yīng)用于分子生物學(xué)中作為診斷試劑盒。,44,親合素（Avidin）在診斷試劑中的應(yīng)用十分廣泛，它是蛋清中比較豐富的一種真核生物蛋白，在常規(guī)情況下可從蛋清中直接分離純化。 在轉(zhuǎn)基因玉米中研究生產(chǎn)這種蛋白，以確定它是否能夠與蛋清來源的雞親合素進(jìn)行商業(yè)化競(jìng)爭(zhēng)。將一個(gè)雞親合素蛋白的編碼序列按照玉米偏愛的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，

19、然后與大麥-淀粉酶信號(hào)肽編碼序列融合，并導(dǎo)入玉米染色體中表達(dá)。,45,每公斤轉(zhuǎn)基因玉米種子可產(chǎn)230mg的親合素，據(jù)估計(jì)這種玉米來源的親合素成本約比蛋清來源的親合素低10倍。玉米親合素具有與天然蛋白相同的生物活性，現(xiàn)在成為商品公開出售（見Sigma-Aldrich product#A8706）。,46,利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的-葡萄糖醛酸酶（GUS）也已經(jīng)商品化。 gus基因是報(bào)告基因（reporter gene），是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因，其來自于大腸桿菌，編碼-葡萄糖醛酸糖苷酶或-葡糖醛酸酶（-glucuronidase，GUS），能

20、催化裂解一系列的-葡萄糖苷，產(chǎn)生具有發(fā)色團(tuán)或熒光的物質(zhì)，可用分光光度計(jì)、熒光計(jì)和組織化學(xué)法對(duì)GUS活性進(jìn)行定量和空間定位分析，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單靈敏。,47,Zeigler等（2000）報(bào)道了細(xì)菌的纖維素酶在擬南芥中的表達(dá)，其表達(dá)量高達(dá)25%。,48,動(dòng)物血紅蛋白,靈芝和煙草,49,表2 利用轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的其他藥用蛋白(2005年后),50,續(xù)表,51,續(xù)表,52,第4節(jié) 植物生物反應(yīng)器的研制策略,植物基因工程生產(chǎn)藥用蛋白的過程一般包括目的基因的克隆、高效表達(dá)載體的構(gòu)建、植物細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化、受體細(xì)胞的組織培養(yǎng)和植株再生、轉(zhuǎn)化植株栽培、目標(biāo)產(chǎn)品的分離純化及純度鑒定等，其中載體表達(dá)系統(tǒng)主要有兩種：穩(wěn)定

21、的整合表達(dá)系統(tǒng)和瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)。,53,4.1 轉(zhuǎn)基因植物穩(wěn)定整合表達(dá)系統(tǒng),外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞并整合到宿主基因組中，且能夠穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的轉(zhuǎn)基因植株稱為穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)。 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或DNA直接轉(zhuǎn)移法，把編碼生物活性蛋白的外源基因或編碼結(jié)構(gòu)性抗原決定簇參與誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的病原體DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞，并整合到植物細(xì)胞染色體上。,54,整合了外源基因的植物細(xì)胞在一定條件下生長(zhǎng)成新的植株，并在生長(zhǎng)過程中表達(dá)生物活性蛋白和疫苗，同時(shí)把能表達(dá)異源性蛋白的性狀遺傳給子代，形成穩(wěn)定的表達(dá)生物活性蛋白的植物品系。,55,Ponstein 等(2002)將來源于A. niger 植酸酶phy基因轉(zhuǎn)移到油菜

22、籽中，用種子特異性啟動(dòng)子CruA控制phyA ，并在植酸酶成熟肽前加上十字花科信號(hào)肽序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)95的油菜籽實(shí)中檢測(cè)到了植酸酶的活性，此酶對(duì)胃蛋白酶具有抗性。,56,4.2 重組植物病毒瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)是利用可在植物中自行復(fù)制的植物病毒為載體表達(dá)異源蛋白。 植物病毒具有廣寄主性，能夠感染多種植物，且基因組小，易于進(jìn)行遺傳操作。 以植物病毒為載體，將編碼生物活性蛋白的基因或編碼疫苗抗原決定簇基因插入植物病毒基因組中，并置于強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下，然后用此重組病毒感染植物，外源基因即隨病毒的復(fù)制而高水平表達(dá)（接種后12周），從已感染病毒的葉片中提取病毒蛋白，酶解后即可獲得目標(biāo)蛋白。,57,一

23、般病毒蛋白可以占到感染病毒葉片總蛋白含量的50%。外源蛋白產(chǎn)生的形式或是獨(dú)立的多肽，或與病毒基因產(chǎn)物融合。 大多數(shù)植物病毒可借助快速的機(jī)械接種感染植物，適合于大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)，利用這類方法有望獲得高產(chǎn)量的藥用蛋白，實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)蛋白質(zhì)的“綠色工廠”。,58,將構(gòu)建好的外源性基因的病毒載體導(dǎo)入植物主要采用的是體外接種法。 目前已有十幾種植物病毒被改造成不同類型的外源蛋白表達(dá)載體，包括花椰菜花葉病毒（CaMV ）、煙草花葉病毒（TMV）和豇豆花葉病毒（CPMV ）等，其中有150 多種蛋白多肽在TMV 載體中成功表達(dá)。例如：,59,4.2 重組植物病毒瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),雙鏈DNA花椰菜病毒CaMV），能感

24、染十字花科和少數(shù)非十字花科（如茄科）植物; 單鏈RNA煙草花葉病毒（TMV），是一種復(fù)制量和外殼蛋白質(zhì)表達(dá)量很高的病毒，具有寄主范圍廣、能在整體植物上快速擴(kuò)散等特點(diǎn)，多年來，人們研究了利用TMV表達(dá)外源基因的多種策略，目前已有150 多種蛋白多肽在TMV 載體中成功表達(dá)。,60,4.2 重組植物病毒瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),此外還有單鏈DNA番茄金黃花葉雙病毒(TGMV)、非州木薯花葉病毒(ACMV)、玉米線條病毒(MSV)、小麥矮縮病毒(WDV)、大麥條文花葉病毒(BSMV)、番茄叢矮病毒(TBSV)、馬鈴薯X病毒(PVX)、煙草蝕刻病毒(TEV)、李痘病毒(PPV)等 。,61,6.4.3 兩種系統(tǒng)的

25、比較,62,第5節(jié) 存在問題和可能的解決方法,5.1 外源蛋白表達(dá)的水平低 這個(gè)問題普遍存在于轉(zhuǎn)基因植物的研究中，對(duì)于植物疫苗來說，表達(dá)量必須達(dá)到較高水平，才能達(dá)到口服免疫的效果，而對(duì)于在植物中表達(dá)需要純化的抗體以及藥用蛋白時(shí)，只有當(dāng)其超過總可溶性蛋白的1%，才具有商業(yè)開發(fā)價(jià)值。,63,為了進(jìn)一步提高外源蛋白在植物細(xì)胞中的表達(dá)水平，人們?cè)O(shè)計(jì)了很多策略: (1)蛋白質(zhì)的靶向定位。在高等植物葉綠體表達(dá)外源基因是一種可供選擇的轉(zhuǎn)基因體系。葉綠體環(huán)形基因在每個(gè)植物細(xì)胞中可達(dá)5001000個(gè)，可顯著提高外源基因的拷貝數(shù)，從而使基因表達(dá)產(chǎn)物成倍增加，甚至可達(dá)總可溶性蛋白的47%。,64,(2)使用植物病毒

26、作為表達(dá)載體，可大大提高外源基因的表達(dá)水平。 (3)使用植物偏愛的密碼子，植物中遺傳密碼子的使用頻率與動(dòng)物、微生物不同。適當(dāng)?shù)貙?duì)外源基因的密碼子進(jìn)行替換能顯著提高該基因在植物中的表達(dá)水平。 (4)使用增強(qiáng)子序列，利用組織特異性的啟動(dòng)子，優(yōu)化先導(dǎo)序列，能夠提高外源基因的表達(dá)水平。,65,(5)使用核基質(zhì)附著區(qū)MAR序列，可以使外源基因在染色質(zhì)中形成獨(dú)立的活躍轉(zhuǎn)錄單元，不受周圍染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，從而提高外源基因的表達(dá)水平。 (6)在擬南芥中生產(chǎn)arcelin，同時(shí)表達(dá)種子貯藏蛋白2S清蛋白的反義基因，結(jié)果使得arcelin的表達(dá)量占種子總蛋白地4%，利用這個(gè)策略有助于顯著提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。,6

27、6,5.2 下游生產(chǎn)成本高,盡管植物生產(chǎn)系統(tǒng)的上游生產(chǎn)成本比其它系統(tǒng)低，但如果產(chǎn)物需要提純。則費(fèi)用昂貴，因此在上游設(shè)計(jì)中應(yīng)注意盡量簡(jiǎn)化下游的純化成本。 將外源蛋白多肽與植物油脂蛋白(oil-body)形成融合蛋白在植物中表達(dá)，油脂蛋白的親脂性使之成為一種高效的多肽純化系統(tǒng)。,67,利用GVGVP作為融合蛋白(GVGVP是一種人工合成基因編碼的蛋白多聚體)，只要一步即可純化，這一方法已成功運(yùn)用于胰島素的純化。 另外，有發(fā)展前景的是利用毛狀根系統(tǒng)生產(chǎn)外源多肽，即利用轉(zhuǎn)基因植物將目標(biāo)蛋白從植物根系分泌到液體培養(yǎng)基中，這一系統(tǒng)已成功地生產(chǎn)Guy.s13單克隆抗體(預(yù)防齲齒)，產(chǎn)量可達(dá)2.4mg/L。

28、此外，運(yùn)用植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)也可減少下游的純化成本。,68,5.3 安全性問題,目前，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性仍存在爭(zhēng)議，尤其在口服疫苗方面，這一爭(zhēng)議就更加尖銳。 例如在轉(zhuǎn)基因研究中用于篩選陽性克隆使用的選擇標(biāo)記基因多數(shù)為抗生素抗性基因，因此人們就會(huì)擔(dān)心人食用這種轉(zhuǎn)基因作物后也會(huì)產(chǎn)生抗生素抗性。,69,另外，在植物抗體的研究中，抗體上都連有多聚糖，由于動(dòng)物源的抗體中多為唾液酸，這在植物中缺乏，而植物中富含木糖，這在動(dòng)物不存在，因此人們懷疑不同的聚糖結(jié)構(gòu)會(huì)對(duì)植物抗體的免疫原性和致敏性產(chǎn)生影響。這有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)確證。 同時(shí)，轉(zhuǎn)基因植物具有潛在的破壞生態(tài)環(huán)境的可能性，因此，制定和完善轉(zhuǎn)基因植物的安全和管理法規(guī)尤為重要。,70,展 望,盡管轉(zhuǎn)植物生物反應(yīng)器仍存在一些問題尚待解決，但利用植物表達(dá)系統(tǒng)已成功地表達(dá)了多種具有生理活性的外源多肽，而且有些已經(jīng)進(jìn)行了人體和動(dòng)物的試驗(yàn)，其前景是可觀的，隨著人類基因組計(jì)劃研究的不斷深入，會(huì)發(fā)現(xiàn)有更多醫(yī)療價(jià)值的蛋白質(zhì)，因此利用轉(zhuǎn)基因植物將會(huì)成為最具潛力的生產(chǎn)系統(tǒng)來生產(chǎn)這些藥物，為人類健康做出巨大的貢獻(xiàn)。,