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1、實(shí)驗(yàn) 熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)及口腔粘膜上皮細(xì)胞DNA的觀察,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)原理 儀器、材料與試劑 實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)報(bào)告及思考題,實(shí) 驗(yàn) 目 的,了解熒光顯微鏡的基本構(gòu)造和基本光路 了解熒光探針Hoechst33258或33342與細(xì)胞成分的結(jié)合特性和光譜特性,熒光顯微鏡,什么是熒光 ?,物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光。 即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長(zhǎng)波光。 一種光化熒光,熒光的種類,自發(fā)熒光 次生熒光,自發(fā)熒光：物質(zhì)受光激發(fā)產(chǎn)生的固有熒光 次生熒光：物質(zhì)借熒光色素受光激發(fā)產(chǎn)生的熒光,熒光的性質(zhì),吸收光 保持固有的熒光特性 熒光波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)（STOKES 法則
2、） 熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度 有不同程度的衰減 熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被檢物濃度、熒光效率,落射熒光顯微鏡的構(gòu)造,吸收濾色鏡 激發(fā)濾色鏡,分色鏡,汞燈,紫外線保護(hù)罩,孔徑光欄（FS） 視場(chǎng)光欄（AS）,落射熒光顯微鏡各部件特性和作用,汞燈光源: 提供激發(fā)光(UV、B、G),激發(fā)濾色鏡: 波長(zhǎng)選擇,nm,T%,BAND PASS,落射熒光顯微鏡原理,汞 燈,激發(fā)濾色鏡,分色鏡,吸收濾色鏡,物 鏡,標(biāo) 本,濾色鏡的選擇,熒光素的特性,濾色鏡的特性,激發(fā),分色,吸收,根據(jù)熒光素和濾色鏡的特性選擇濾色鏡,實(shí) 驗(yàn) 原 理,熒光顯微鏡技術(shù)是利用一定波長(zhǎng)的光（通常是波長(zhǎng)短的紫外光和藍(lán)紫光）照射被檢樣品
3、，樣品獲得能量，產(chǎn)生能量躍遷，從基態(tài)到汽激發(fā)態(tài)，再從激發(fā)態(tài)回到原態(tài)，放出光和熱能，產(chǎn)生的光為波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光（相對(duì)于激發(fā)光波長(zhǎng)），此可見光稱為熒光。通過物鏡、目鏡的成像、放大，以供觀察、檢測(cè)和拍攝。,熒光顯微鏡要求有特殊的光源提供足夠強(qiáng)度和較短波長(zhǎng)的激發(fā)光，誘發(fā)熒光物質(zhì)發(fā)出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光。視野中所看到的像，主要是樣品的熒光映像。熒光顯微鏡技術(shù)是在光學(xué)顯微鏡水平上對(duì)蛋白質(zhì)和亞細(xì)胞組分進(jìn)行定位的最常用的方法之一。非免疫熒光探針可用來直接標(biāo)記許多特殊的亞細(xì)胞組分及生物大分子。這些探針大多數(shù)能被活細(xì)胞直接攝取并摻入和聚集在特定的細(xì)胞器中，因此我們就可以通過熒光顯微鏡對(duì)這些細(xì)胞器進(jìn)行觀察。,Hoechst3
4、3258是一種親脂性物質(zhì)，可跨膜進(jìn)入活細(xì)胞，與DNA特異性結(jié)合，它主要結(jié)合在富含AT區(qū)域的DNA小溝部分。結(jié)合DNA后熒光大大增強(qiáng)，最大激發(fā)光波長(zhǎng)約為350nm, 最大發(fā)射光波長(zhǎng)約為461nm?？捎糜诨罴?xì)胞觀察，不需要對(duì)細(xì)胞作固定及透化處理。,儀器、材料與試劑,儀器：熒光顯微鏡， 材料：口腔粘膜上皮細(xì)胞，載玻片，牙簽 試劑：PBS(pH 7.4) Ho.33258 or H.33342（10g/mL，溶于PBS),實(shí) 驗(yàn) 步 驟,在1張載玻片上分別滴加一滴PBS溶液 用牙簽刮取口腔上皮細(xì)胞，分別涂于載玻片上（牙簽在液滴中攪勻） 在涂細(xì)胞處分別滴加10g/mL的Hoechst.33342蓋片室溫暗處孵育2-3分鐘 用紫外光激發(fā)，觀看細(xì)胞DNA熒光,注 意 事 項(xiàng),蓋片時(shí)防止產(chǎn)生氣泡 滴加的染料不宜太多，否則背景太深，影響觀察 注意避光，包括制片、熒光觀察和探針保存 操作時(shí)防止污染皮膚和環(huán)境,口腔粘膜上皮.jpg,
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