用熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)及觀察口腔上皮細胞的DNA.ppt

實驗 熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)及口腔粘膜上皮細胞DNA的觀察,實驗目的 實驗原理 儀器、材料與試劑 實驗步驟 實驗報告及思考題,實 驗 目 的,了解熒光顯微鏡的基本構(gòu)造和基本光路 了解熒光探針Hoechst33258或33342與細胞成分的結(jié)合特性和光譜特性,熒光顯微鏡,什么是熒光 ?,物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光。 即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長波光。 一種光化熒光,熒光的種類,自發(fā)熒光 次生熒光,自發(fā)熒光：物質(zhì)受光激發(fā)產(chǎn)生的固有熒光 次生熒光：物質(zhì)借熒光色素受光激發(fā)產(chǎn)生的熒光,熒光的性質(zhì),吸收光 保持固有的熒光特性 熒光波長激發(fā)波長（STOKES 法則） 熒光強度極小于激發(fā)光的強度 有不同程度的衰減 熒光強度取決于激發(fā)光強度、被檢物濃度、熒光效率,落射熒光顯微鏡的構(gòu)造,吸收濾色鏡 激發(fā)濾色鏡,分色鏡,汞燈,紫外線保護罩,孔徑光欄（FS） 視場光欄（AS）,落射熒光顯微鏡各部件特性和作用,汞燈光源: 提供激發(fā)光(UV、B、G),激發(fā)濾色鏡: 波長選擇,nm,T%,BAND PASS,落射熒光顯微鏡原理,汞 燈,激發(fā)濾色鏡,分色鏡,吸收濾色鏡,物 鏡,標 本,濾色鏡的選擇,熒光素的特性,濾色鏡的特性,激發(fā),分色,吸收,根據(jù)熒光素和濾色鏡的特性選擇濾色鏡,實 驗 原 理,熒光顯微鏡技術(shù)是利用一定波長的光（通常是波長短的紫外光和藍紫光）照射被檢樣品，樣品獲得能量，產(chǎn)生能量躍遷，從基態(tài)到汽激發(fā)態(tài)，再從激發(fā)態(tài)回到原態(tài)，放出光和熱能，產(chǎn)生的光為波長較長的光（相對于激發(fā)光波長），此可見光稱為熒光。通過物鏡、目鏡的成像、放大，以供觀察、檢測和拍攝。,熒光顯微鏡要求有特殊的光源提供足夠強度和較短波長的激發(fā)光，誘發(fā)熒光物質(zhì)發(fā)出較長波長的熒光。視野中所看到的像，主要是樣品的熒光映像。熒光顯微鏡技術(shù)是在光學顯微鏡水平上對蛋白質(zhì)和亞細胞組分進行定位的最常用的方法之一。非免疫熒光探針可用來直接標記許多特殊的亞細胞組分及生物大分子。這些探針大多數(shù)能被活細胞直接攝取并摻入和聚集在特定的細胞器中，因此我們就可以通過熒光顯微鏡對這些細胞器進行觀察。,Hoechst33258是一種親脂性物質(zhì)，可跨膜進入活細胞，與DNA特異性結(jié)合，它主要結(jié)合在富含AT區(qū)域的DNA小溝部分。結(jié)合DNA后熒光大大增強，最大激發(fā)光波長約為350nm, 最大發(fā)射光波長約為461nm?？捎糜诨罴毎^察，不需要對細胞作固定及透化處理。,儀器、材料與試劑,儀器：熒光顯微鏡， 材料：口腔粘膜上皮細胞，載玻片，牙簽 試劑：PBS(pH 7.4) Ho.33258 or H.33342（10g/mL，溶于PBS),實 驗 步 驟,在1張載玻片上分別滴加一滴PBS溶液 用牙簽刮取口腔上皮細胞，分別涂于載玻片上（牙簽在液滴中攪勻） 在涂細胞處分別滴加10g/mL的Hoechst.33342蓋片室溫暗處孵育2-3分鐘 用紫外光激發(fā)，觀看細胞DNA熒光,注 意 事 項,蓋片時防止產(chǎn)生氣泡 滴加的染料不宜太多，否則背景太深，影響觀察 注意避光，包括制片、熒光觀察和探針保存 操作時防止污染皮膚和環(huán)境,口腔粘膜上皮.jpg,