質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌.ppt
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質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌,1、重組質(zhì)粒的鑒定當(dāng)質(zhì)粒的重組或其他載體重組后,通常會發(fā)生質(zhì)粒的重組失敗,包括質(zhì)粒的本身環(huán)化。因而要求進(jìn)行篩選,把重組成功的質(zhì)粒找出來。在目前常用的質(zhì)粒和其他載體中含有相應(yīng)的抗生素抗性基因,若重組成功,或不含質(zhì)粒的自身環(huán)化,抗生素抗性基因表達(dá),被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌便具備抵抗相應(yīng)抗生素的能力,可以在含該抗生素的培養(yǎng)基上生長傳代。若重組失敗,大腸桿菌便不能抵抗該抗生素而死亡。2、為擴(kuò)增質(zhì)粒和其他載體作準(zhǔn)備由于大腸桿菌繁殖快,在適宜的條件下繁殖一代僅需要20-30min,而且常用質(zhì)??梢栽诖竽c桿菌中增殖達(dá)到幾百個(gè)拷貝。因此,通過對轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌培養(yǎng),可以在短時(shí)間內(nèi)極大的擴(kuò)增目的質(zhì)粒。,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?二、實(shí)驗(yàn)原理,通過CaCl2對特定的大腸桿菌處理,制備感受態(tài)的細(xì)菌。這些細(xì)菌可使每微克超螺旋質(zhì)粒DNA,如一些插入目的DNA片段的重組質(zhì)粒,產(chǎn)生5106~2107個(gè)轉(zhuǎn)化的菌落。當(dāng)質(zhì)粒與這些大腸桿菌混合后,質(zhì)粒粘附在大腸桿菌的表面,在42℃時(shí),大腸桿菌出現(xiàn)熱休克,質(zhì)??赏ㄟ^大腸桿菌細(xì)胞膜上形成的空隙進(jìn)入菌體內(nèi)。隨后,加入LB培養(yǎng)液,于37℃振動培養(yǎng)可使細(xì)菌復(fù)蘇,并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因,提高轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌可以在相應(yīng)抗生素培養(yǎng)皿中傳代,形成菌落。,三、實(shí)驗(yàn)流程:,滅活物/質(zhì)粒,,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,挑菌,搖菌,菌液PCR,,,,四、實(shí)驗(yàn)方法---凍融法,連接產(chǎn)物滅活70℃,10min,,(冰上解凍)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞50μl、滅火物10μl,混合物,冰上放置30min,42℃,90sec,冰上2min,加入1000ulLB液體(無抗),37℃,振蕩1h,離心10000rpm,1min,RT,去上清800μl,留下200μl上清于1.5ul離心管中重懸,涂板,37℃恒溫箱,倒置培養(yǎng)12h(時(shí)間不得超過20h),,,,,,,,,,,1、無菌落,失敗,或培養(yǎng)條件不充分。2、菌落布滿如苔樣,失敗,可能是抗生素濃度不夠或失效。3、菌落布滿,抗生素濃度太高,失敗。4、出現(xiàn)菌落,符合要求。,(1),(2),(3),(4),五、結(jié)果分析和失敗原因,(1)有菌落,說明轉(zhuǎn)化成功,但有兩種可能性:其一,質(zhì)粒自身環(huán)化;其二,重組成功。(2)無菌落,說明實(shí)驗(yàn)沒成功。(3)菌落布滿如苔樣,可能是抗生素濃度不夠或失效。(4)出現(xiàn)大菌斑,大多數(shù)是霉菌污染所致。,1、結(jié)果分析,1、平板中的抗生素部分失效,長出的克隆是雜菌。2、倒Ka平板時(shí),培養(yǎng)基太燙,應(yīng)冷卻到50℃以下加Ka抗生素。2、涂板時(shí)來回用力過大,涂布環(huán)或者涂布棒灼燒過熱,或不待冷卻就涂布。3、感受態(tài)細(xì)胞長時(shí)間處在常溫狀態(tài),會嚴(yán)重影響其轉(zhuǎn)化,操作時(shí)動作迅速。4、操作時(shí)動作過于劇烈,減少對細(xì)胞的機(jī)械損傷。切記感受態(tài)細(xì)胞比較嬌嫩。5、操作過程不規(guī)范,染菌。,2、轉(zhuǎn)化失敗的原因,六、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備,(1)從LB平板上挑取新活化的E.coliTOP10單菌落于50mlLB培養(yǎng)基中,37℃振蕩過夜;(2)將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100mlLB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)至OD600=0.5左右;(3)將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中,冰上放置10分鐘,然后于4℃下4100rpm離心10min。(4)棄掉上清,加入30ml0.1mol/L預(yù)冷的CaCl2溶液,重懸,冰上放置15-30min后,4℃下4100rpm離心10min;(5)棄掉上清,加入2ml預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl,加入無菌甘油300μl,重懸混勻,冰上放置幾分鐘;(6)分裝,每管100μl,液氮冷凍后,保存于-70℃冰箱。,七、挑菌、搖菌,(1)離心管標(biāo)號(2)每個(gè)管內(nèi)吸入650μlLB+Ka抗生素(3)用牙簽挑取單個(gè)菌(4)搖床上搖菌(時(shí)間大于8h),準(zhǔn)備:離心管、牙簽、鑷子、LB+抗生素,八、藍(lán)白斑篩選原理,藍(lán)白斑篩選-----篩選重組子:根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子,如α-互補(bǔ)、抗生素基因等。現(xiàn)在許多載體都含有一個(gè)大腸桿菌DNA的短區(qū)段,其中有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調(diào)控序列和前146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)(MCS)。受體菌則含編碼β-半乳糖苷酶C端aa的序列。當(dāng)外源基因插入時(shí),二者溶為一體后,有β-半乳糖苷酶表達(dá),在生色底物5-溴-4-氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)培養(yǎng)基中形成藍(lán)色菌落。而當(dāng)有外源基因插入到多克隆原點(diǎn),從而造成插入失活,而使lacZ基因不表達(dá)而形成白色菌斑。通過顏色不同而區(qū)分重組子和非重組子。,九、菌液PCR驗(yàn)證,加樣:easybuffer:2.5μl樣數(shù)DNTP:1.5μl樣數(shù)M13R:1μl樣數(shù)M13F:1μl樣數(shù)easyTaq:0.2μl樣數(shù),,,,混勻、離心,分裝,樣品,跑電泳,跑PCR,混勻、離心,加菌液1μl(酒精燈前),,,,電泳圖:,謝謝!,- 1.請仔細(xì)閱讀文檔,確保文檔完整性,對于不預(yù)覽、不比對內(nèi)容而直接下載帶來的問題本站不予受理。
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