質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌.ppt

質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌,1、重組質(zhì)粒的鑒定當(dāng)質(zhì)粒的重組或其他載體重組后，通常會(huì)發(fā)生質(zhì)粒的重組失敗，包括質(zhì)粒的本身環(huán)化。因而要求進(jìn)行篩選，把重組成功的質(zhì)粒找出來。在目前常用的質(zhì)粒和其他載體中含有相應(yīng)的抗生素抗性基因，若重組成功，或不含質(zhì)粒的自身環(huán)化，抗生素抗性基因表達(dá)，被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌便具備抵抗相應(yīng)抗生素的能力，可以在含該抗生素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)傳代。若重組失敗，大腸桿菌便不能抵抗該抗生素而死亡。2、為擴(kuò)增質(zhì)粒和其他載體作準(zhǔn)備由于大腸桿菌繁殖快，在適宜的條件下繁殖一代僅需要20-30min，而且常用質(zhì)粒可以在大腸桿菌中增殖達(dá)到幾百個(gè)拷貝。因此，通過對(duì)轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌培養(yǎng)，可以在短時(shí)間內(nèi)極大的擴(kuò)增目的質(zhì)粒。,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?二、實(shí)驗(yàn)原理,通過CaCl2對(duì)特定的大腸桿菌處理，制備感受態(tài)的細(xì)菌。這些細(xì)菌可使每微克超螺旋質(zhì)粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重組質(zhì)粒，產(chǎn)生51062107個(gè)轉(zhuǎn)化的菌落。當(dāng)質(zhì)粒與這些大腸桿菌混合后，質(zhì)粒粘附在大腸桿菌的表面，在42時(shí)，大腸桿菌出現(xiàn)熱休克，質(zhì)?？赏ㄟ^大腸桿菌細(xì)胞膜上形成的空隙進(jìn)入菌體內(nèi)。隨后，加入LB培養(yǎng)液，于37振動(dòng)培養(yǎng)可使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因，提高轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌可以在相應(yīng)抗生素培養(yǎng)皿中傳代，形成菌落。,三、實(shí)驗(yàn)流程：,滅活物/質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,挑菌,搖菌,菌液PCR,四、實(shí)驗(yàn)方法-凍融法,連接產(chǎn)物滅活70，10min,（冰上解凍）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞50l、滅火物10l,混合物，冰上放置30min,42,90sec,冰上2min,加入1000ulLB液體（無抗）,37，振蕩1h,離心10000rpm,1min,RT,去上清800l,留下200l上清于1.5ul離心管中重懸,涂板,37恒溫箱，倒置培養(yǎng)12h(時(shí)間不得超過20h),1、無菌落，失敗，或培養(yǎng)條件不充分。2、菌落布滿如苔樣，失敗，可能是抗生素濃度不夠或失效。3、菌落布滿，抗生素濃度太高，失敗。4、出現(xiàn)菌落，符合要求。,（1）,（2）,（3）,（4）,五、結(jié)果分析和失敗原因,（1）有菌落，說明轉(zhuǎn)化成功，但有兩種可能性：其一，質(zhì)粒自身環(huán)化；其二，重組成功。（2）無菌落，說明實(shí)驗(yàn)沒成功。（3）菌落布滿如苔樣，可能是抗生素濃度不夠或失效。（4）出現(xiàn)大菌斑，大多數(shù)是霉菌污染所致。,1、結(jié)果分析,1、平板中的抗生素部分失效，長(zhǎng)出的克隆是雜菌。2、倒Ka平板時(shí)，培養(yǎng)基太燙，應(yīng)冷卻到50以下加Ka抗生素。2、涂板時(shí)來回用力過大，涂布環(huán)或者涂布棒灼燒過熱，或不待冷卻就涂布。3、感受態(tài)細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間處在常溫狀態(tài)，會(huì)嚴(yán)重影響其轉(zhuǎn)化，操作時(shí)動(dòng)作迅速。4、操作時(shí)動(dòng)作過于劇烈，減少對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷。切記感受態(tài)細(xì)胞比較嬌嫩。5、操作過程不規(guī)范，染菌。,2、轉(zhuǎn)化失敗的原因,六、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備,（1）從LB平板上挑取新活化的E.coliTOP10單菌落于50mlLB培養(yǎng)基中，37振蕩過夜；（2）將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100mlLB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)至OD6000.5左右；（3）將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中，冰上放置10分鐘，然后于4下4100rpm離心10min。（4）棄掉上清,加入30ml0.1mol/L預(yù)冷的CaCl2溶液，重懸，冰上放置15-30min后，4下4100rpm離心10min；（5）棄掉上清，加入2ml預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl，加入無菌甘油300l，重懸混勻,冰上放置幾分鐘；（6）分裝，每管100l，液氮冷凍后,保存于-70冰箱。,七、挑菌、搖菌,（1）離心管標(biāo)號(hào)（2）每個(gè)管內(nèi)吸入650lLB+Ka抗生素（3）用牙簽挑取單個(gè)菌（4）搖床上搖菌（時(shí)間大于8h）,準(zhǔn)備：離心管、牙簽、鑷子、LB+抗生素,八、藍(lán)白斑篩選原理,藍(lán)白斑篩選-篩選重組子：根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如-互補(bǔ)、抗生素基因等?，F(xiàn)在許多載體都含有一個(gè)大腸桿菌DNA的短區(qū)段，其中有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS）。受體菌則含編碼-半乳糖苷酶C端aa的序列。當(dāng)外源基因插入時(shí)，二者溶為一體后，有-半乳糖苷酶表達(dá)，在生色底物5-溴-4-氯-3吲哚-D-半乳糖苷（X-gal）培養(yǎng)基中形成藍(lán)色菌落。而當(dāng)有外源基因插入到多克隆原點(diǎn)，從而造成插入失活，而使lacZ基因不表達(dá)而形成白色菌斑。通過顏色不同而區(qū)分重組子和非重組子。,九、菌液PCR驗(yàn)證,加樣：easybuffer:2.5l樣數(shù)DNTP：1.5l樣數(shù)M13R:1l樣數(shù)M13F:1l樣數(shù)easyTaq:0.2l樣數(shù),混勻、離心,分裝,樣品,跑電泳,跑PCR,混勻、離心,加菌液1l（酒精燈前）,電泳圖：,謝謝！,