教 案 課程名稱 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn) 授課對(duì)象 11生科 主講教師 向玉勇 2012

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1、 教 案 課程名稱 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn) 授課對(duì)象 11生科 主講教師 向玉勇 2012-2013 學(xué)年度 二 學(xué)期 實(shí)驗(yàn)一 酪蛋白的制備 一、目的 1、學(xué)習(xí)從牛奶中制備酪蛋白的原理和方法。 2、掌握等電點(diǎn)沉淀法提取蛋白質(zhì)的方法。 二、原理 牛乳中的主要的蛋白質(zhì)是酪蛋白，含量約為35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白質(zhì)的混合物，等電點(diǎn)為4.7。利用等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低的原理，將牛乳的pH調(diào)至4.7時(shí)，酪蛋白就沉淀出來(lái)。用乙醇洗滌沉

2、淀物，除去脂類雜質(zhì)后便可得到純酪蛋白。 三、材料、試劑與器具 （一）材料 新鮮牛奶 （一）試劑 1、95%乙醇 1 200mL 2、無(wú)水乙醚 1 200mL 3、0.2mol/L pH4.7醋酸——醋酸鈉緩沖液 300ml 先配A液與B液 A液：0.2mol/L醋酸鈉溶液 稱NaAC·3H2O 54.44g，定容至2000ml。

3、B液：0.2mol/L醋酸溶液，稱優(yōu) 純醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000ml。 取A液1770ml，B液1230ml混合即得Ph4.7的醋酸——醋酸鈉緩沖液3000ml。 4、乙醇——乙醚混合液 乙醇：乙醚=1 ：1（V/V） （二）器具 1、離心機(jī) 2、抽濾裝置 3、精密pH試紙或酸度計(jì) 4、 電爐 5、燒杯 6、溫度計(jì) 四、操作步驟 （一）酪蛋白的粗提 100mL牛奶加熱至40℃。在攪拌下慢慢加入預(yù)熱至40℃、pH4.7的醋酸緩沖液100mL.用精密pH試紙或酸度計(jì)調(diào)pH至4.7。

4、將上述懸浮液冷卻至室溫。離心15分鐘（3000 r /min）。棄去清液，得酪蛋白粗制品。 （二）酪蛋白的純化 1、用水洗滌沉淀 3次，離心10分鐘（3 000r/min），棄去上清液。 2、在沉淀中加入30mL乙醇，攪拌片刻，將全部懸濁液轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中抽濾。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。 3、將沉淀攤開在表面 上，風(fēng)干；得酪蛋白純品。 （三）準(zhǔn)確稱重，計(jì)算含量和得率。 含量：酪蛋白g/100 mL牛乳（g%） 五、注意事項(xiàng) 1、由于本法是應(yīng)用等電點(diǎn)沉淀法來(lái)制備蛋白質(zhì)，故調(diào)節(jié)牛奶液的等電點(diǎn)一定要準(zhǔn)確。最好用酸度計(jì)測(cè)定。 2、精制過程用乙醚是揮

5、發(fā)性、有毒的有機(jī)溶劑，最好在通風(fēng)櫥內(nèi)操作。 3、目前市面上出售的牛奶是經(jīng)加工的奶制品，不是純凈牛奶，所以計(jì)算時(shí)應(yīng)按產(chǎn)品的相應(yīng)指標(biāo)計(jì)算。 六、思考題 1、制備高產(chǎn)率純酪蛋白的關(guān)鍵是什么？ 2、試設(shè)計(jì)另一種提取酪蛋白的方法？ 實(shí)驗(yàn)二 維生素C的定量測(cè)定 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1. 學(xué)習(xí)定量測(cè)定維生素C的原理及方法 2. 掌握微量滴定法的操作技術(shù) 二、實(shí)驗(yàn)原理 維生素C具有很強(qiáng)的還原性，在中性和微酸性環(huán)境中，能將染料2，6-二氯酚靛酚還原成無(wú)色的還原型的2，6-二氯酚靛酚，同時(shí)被氧化成脫氫維生素C。氧化型的2，6-二氯酚靛酚在酸性溶液中呈現(xiàn)紅色，在中性或堿性溶液中呈藍(lán)色。當(dāng)溶液由

6、無(wú)色變?yōu)槲⒓t色時(shí)即表示溶液中的維生素C剛好全部被氧化，此時(shí)即為滴定終點(diǎn)。從滴定時(shí)2，6-二氯酚靛酚溶液的消耗量，可以計(jì)算出被檢物質(zhì)中還原型維生素C的含量。 三、器材與試劑 （一）器材： 1微量滴定管(3m1)；2移液管(1ml、10ml)；3容量瓶(50m1)；4錐形瓶(100m1)；5漏斗；6天平；7研缽。 （二）試劑： （1）1％草酸溶液；（2）2％草酸溶液；（3）0.1mg/ml標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液(準(zhǔn)確稱取50.Omg純抗壞血酸，溶于1％草酸溶液，并稀釋至500m1。貯棕色瓶，冷藏，最好在使用前臨時(shí)配制)：（4）0.02％2,6-二氯酚靛酚溶液(溶解50mg 2,6-二氯酚靛

7、酚于約200ml含有52 mg碳酸氫鈉的熱水中，冷卻后加水稀釋至250m1。過濾后，裝于棕色瓶?jī)?nèi)，冷藏保存(4℃可保存一星期)。每次臨用時(shí)，以標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液標(biāo)定)。 （三）材料 青椒 四、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 提?。悍Q取新鮮樣品約4g，置于研缽中，加入5ml2%草酸溶液研磨成漿狀，殘?jiān)俅窝心?，一同轉(zhuǎn)入50ml容量瓶中，草酸總量為35ml，加水定容。過濾。濾液備用。 2.過濾：提取液充分混勻后，靜置10min，過濾。 3. 樣品滴定：準(zhǔn)確吸取濾液5或10ml于50ml的錐形瓶中，立即用標(biāo)定過的2，6-二氯酚靛酚溶液滴定至終點(diǎn)，粉紅色，15秒不褪色。記錄所用染料的毫升數(shù)（重復(fù)測(cè)定2～3

8、次）。 4. 空白滴定：準(zhǔn)確量取35ml2%的草酸，放入50ml容量瓶中，加水定容。準(zhǔn)確吸5或10ml于50ml的錐形瓶中，立即用2，6-二氯酚靛酚溶液滴定至終點(diǎn)，粉紅色，15秒不褪色。記錄所用染料的毫升數(shù)（重復(fù)測(cè)定2～3次）。 5. 計(jì)算? 維生素C含量（mg/100g樣品）=（V1-V2）VK/W）×100 式中：V1為滴定樣品所耗用的染料的平均ml數(shù) V2為滴定空白所耗用的染料的平均ml數(shù) ?????????K為1ml染料相當(dāng)于維生素C的mg數(shù) W為樣品質(zhì)量g數(shù) *標(biāo)定2，6-二氯酚靛酚：取維生素C標(biāo)準(zhǔn)液5ml及1%草酸溶液5ml于50ml的錐形瓶中，用配制好的2，6-

9、二氯酚靛酚溶液標(biāo)定。 五、注意事項(xiàng) 1．提取樣液時(shí)，如漿狀物泡沫很多，可加數(shù)滴辛醇或丁醇，若漿狀物不易過濾，可離心取上清液測(cè)定。 2．樣品滴定過程宜迅速，一般不超過2min。滴定所用的染料不應(yīng)少于1ml或多于3ml如樣品含抗壞血酸太高或太低時(shí)，可酌量增減樣液。另外，樣品中某些雜質(zhì)亦能還原二氯靛酚，但速度均較抗壞血酸慢，故終點(diǎn)以淡紅色存在15s為準(zhǔn)。 六、思考題 1. VC理化性質(zhì)最重要的是哪一點(diǎn)？為何用草酸來(lái)提??？ 2．為了準(zhǔn)確測(cè)定維生素C的含量，實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)注意哪些操作步驟？為什么？ 實(shí)驗(yàn)三 甲醛滴定法測(cè)定氨基氮 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 初步掌握甲醛滴定法測(cè)定氨基酸含量的原

10、理和操作要點(diǎn)。 e$I[W^U(2 ? 二、實(shí)驗(yàn)原理 氨基酸是兩極電解質(zhì)，在水溶液中有如下平衡：R-CH（N+H3）-COOˉ?R-CH（NH2）COOˉ+H+-N+H3是弱酸，完全解離時(shí)PH為11-12或更高,若用堿滴定-N+H3釋放的H+來(lái)測(cè)量氨基酸，一般指示劑變色域小于10，很難準(zhǔn)確指示終點(diǎn)。 常溫下，甲醛能迅速與氨基酸的氨基結(jié)合，生成羥甲基化合物,使上述平衡右移，促使-N+H3釋放H+，使溶液的酸度增加，滴定終點(diǎn)移至酚酞的變色域內(nèi)（PH9.0左右）。因此，可用酚酞作指示劑，用標(biāo)準(zhǔn)的氫氧化鈉溶液滴定。 三、器材與試劑 （一）器材 1．25 mL錐形瓶????2．3 mL微量

11、滴定管????3．吸管 sj$$>&J ? （二）試劑 1．0．1 m01／L標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸溶液????300 mL >`>%A M= ? 準(zhǔn)確稱取750mg甘氨酸，溶解后定容至100mL。 Fi
#Rti] ? 2．0．1 mol／L標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液???? 500 mL $!XQab} ? 3．酚酞指示劑????20 mL !5-~<[,>I ? 0.5％酚酞的50％乙醇溶液 d L:[s4W? ? 4．中性甲醛溶液????400mL 1ld1,W4=8/ ? ??在50mL 36～37％分析純甲醛溶液中加入1 mL 0．1％酚酞乙醇水溶液，用0．1 m

12、ol／L的氫氧化鈉溶液滴定到微紅，貯于密閉的玻璃瓶中。此試劑在臨用前配制。如已放置一段時(shí)間，則使用前需重新中和。 4>'7S2\t ? 四、實(shí)驗(yàn)步驟 1．取3個(gè)25 mL的錐形瓶，編號(hào)。向第1、2號(hào)瓶?jī)?nèi)各加入2 mL 0.1 mol／L的標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸溶液和5 mL水，混勻。向3號(hào)瓶?jī)?nèi)加入7mL水。然后向3個(gè)瓶中各加入5滴酚酞指示劑，混勻后各加2mL甲醛溶液，再混勻，分別用0．1 mol／L標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定至溶液顯微紅色。 *ohBWUo ?重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)2次，記錄每次每瓶消耗標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的mL數(shù)。取平均值，計(jì)算甘氨酸氨基氮的回收率。 ;w{:8 ? 甘氨酸氨基氮回收率％

13、= 實(shí)際測(cè)得量 / 理論加入量 × 100% +o<[7/n ? 公式中實(shí)際測(cè)得量為滴定第1和2號(hào)瓶耗用的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液mL數(shù)的平均值與3號(hào)瓶耗用的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液mL數(shù)之差乘以標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉的摩爾濃度，再乘以14．008。 jU?H%U. ? 2 mL乘以標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸的摩爾濃度再乘14．008。即為加入理論量的mg數(shù)。 >>2Z "2
 ? 2．取未知濃度的甘氨酸溶液2ml，依上述方法進(jìn)行測(cè)定，平行做幾份，取平均值。計(jì)算每ml甘氛酸溶液中含有氨基氮的mg數(shù)。 S3YPeaouh ? 氨基氮（mg/ml）=（V末—V對(duì)）×NNaOH×14.008/2 公式中： V末

14、為滴定待測(cè)液耗用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的平均毫升數(shù)； V對(duì)為滴定對(duì)照液（3號(hào)瓶）耗用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的平均毫升數(shù)； NNaOH為標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的真實(shí)當(dāng)量濃度。 五、注意事項(xiàng) 利用甲醛滴淀法可以用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的水解程度。隨著蛋白質(zhì)水解度的增加，滴定值也增加，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)水解完成后，滴定值不再增加。 六、思考題 1、甲醛法測(cè)定氨基酸含量的原理是什么？ 2、為什么氫氧化鈉溶液滴定氨基酸的—N+H3基上的H+，不能用一般的酸堿指示劑？ 實(shí)驗(yàn)四 脂肪酸的β-氧化 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? （1）了解脂肪酸的β-氧化； （2）通過測(cè)定和計(jì)算反應(yīng)液內(nèi)丁酸氧化生成丙酮的量，掌握測(cè)定β-氧化的方法及原理

15、。 二、實(shí)驗(yàn)原理 機(jī)體組織能將脂肪酸氧化生成乙酰輔酶A。兩分子乙酰輔酶A可再縮合成乙酰乙酸。在肝臟內(nèi)，乙酰乙酸可脫羧生成丙酮，也可還原生成β-羥丁酸。乙酰乙酸、β-羥丁酸和丙酮總稱為酮體。酮體為機(jī)體代謝的中間產(chǎn)物。在正常情況下，其產(chǎn)量甚微；患糖尿病或食用高脂肪膳食時(shí)，血中酮體含量增高，尿中也能出現(xiàn)酮體。 本實(shí)驗(yàn)用新鮮肝糜與丁酸保溫，生成的丙酮可用碘仿反應(yīng)測(cè)定。在堿性的條件下，丙酮與碘生成碘仿。反應(yīng)式如下： 2NaOH+I2→NaIO+NaI+H2O CH3COCH3+3NaOI→CHI3+CH3COONa+2NaOH 剩余的碘，可用標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉滴定。 NaOI+NaI

16、+2HCl→I2+2NaCI+H2O I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+2NaI 根據(jù)滴定樣品與滴定對(duì)照所消耗的硫代硫酸鈉之差，可以計(jì)算由丁酸氧化生成丙酮的量。 三、器材與試劑 （一）器材 恒溫水浴、微量滴定管 （二）試劑 1. 10%（w/v）氫氧化鈉溶液： 稱取10g氫氧化鈉，在燒杯中用少量蒸餾水將之溶解后，定容至100ml。 2. 0.1mol/L正丁酸溶液： 稱取13g碘和約40g碘化鉀，放置于研缽中。加入少量蒸餾水后，將之研磨至溶解。用蒸餾水定容到1000ml，在棕色瓶中保存。此時(shí)可用標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉溶液標(biāo)定其濃度。 3. 0.5mol/L正丁酸：

17、取0.05ml正丁酸，用0.5mol/L氫氧化鈉溶液100ml溶解即成。 4. 0.1mol/L碘酸鉀（KIO3）溶液： 稱取0.8918g干燥的碘酸鉀，用少量蒸餾水將之溶解，最后定容至250ml 5. 0.1mol/L硫代硫酸鈉（Na2S2O3）溶液： 稱取25g硫代硫酸鈉，將它溶解于適量煮沸的蒸餾水中，并繼續(xù)煮沸5min。冷卻后，用冷卻的已煮沸過的蒸餾水定容到1000ml。此時(shí)即可用0.1mol/L碘酸鉀溶液標(biāo)定其濃度。 6. 硫代硫酸鈉溶液的標(biāo)定： 將蒸餾水25ml、碘化鉀2g、碳酸氫鈉0.5g、10%鹽酸溶液20ml加入一支錐形瓶?jī)?nèi)。另取0.1mol/L碘酸鉀溶液25ml加

18、入其中，然后用硫代硫酸鈉溶液將之滴定至淺黃色。再加入0.1%淀粉溶液2ml，然后繼續(xù)用硫代硫酸鈉溶液將之滴定至藍(lán)色消褪為止。 另設(shè)一空白，其中僅以蒸餾水代替碘酸鉀，其余操作相同。計(jì)算硫代硫酸鈉溶液的濃度所依據(jù)的反應(yīng)式如下： 5KI KIO3 6HCI=3I2 6KCI 3H2O I2 2Na2S2O3=Na2S4O6 2NaI 7. 10%(v/v)鹽酸溶液： 取10ml鹽酸，用蒸餾水稀釋到100ml。 8. 0.1%(w/v)淀粉溶液 ：稱取0.1g可溶性淀粉，置于研缽中。加入少量預(yù)冷的蒸餾水，將淀粉調(diào)成糊狀。再慢慢倒入煮沸的蒸餾水90ml，攪勻后，再用蒸餾水定容至100ml。

19、 9. 0.9%(w/v)氯化鈉。 10. 1/15mol/L、PH7.7磷酸緩沖液 （A液）1/15mol/L Na2HPO4溶液：稱取Na2HPO4·2H2O1.187g，將之溶解于100ml蒸餾水中即成。 （B液）1/15mol/L KH2PO4溶液：稱取KH2PO40.9078g，將之溶解于100ml蒸餾水將之溶解，最后定容至100ml。 取A液90 ml、B液10 B液，將兩者混合即可。 四、實(shí)驗(yàn)步驟 1．肝勻漿的制備 ?? 1) 將動(dòng)物（如雞、家兔、大鼠或豚鼠等）放血處死，取出肝臟。 2) 用0.9%氯化鈉溶液洗去肝臟上的污血，然后用濾紙吸去表面的水分。稱取肝

20、組織5g ，置于研缽中加入少許0.9%NaCl溶液，將肝組織研磨成肝勻漿。再加入0.9%NaCl溶液，使肝勻漿總體積達(dá)10ml。 （二）酮體的生成 1．取錐形瓶?jī)芍?，按下表編?hào)后，分別加入各試劑。 錐形瓶編號(hào) 試劑（ml） A B 新鮮肝勻漿 — 2.0 預(yù)先煮沸肝勻漿 2.0 — PH7.6 磷酸緩沖液 3.0 3.0 正丁酸溶液 2.0 2.0 2.將加入試劑的兩只錐形瓶于43oC恒溫水浴鍋中保溫40min后取出。 3．于上述兩錐形瓶中分別加入20%三氯醋酸3mL，搖勻后，室溫放置10min。 4．將錐形瓶中的混合物分別過濾

21、，收集濾液于事先如上編號(hào)的試管中。 （三）酮體的測(cè)定 1．取碘量瓶?jī)芍唬聪卤砭幪?hào)后加入有關(guān)試劑。 碘量瓶編號(hào) 試劑（ml） A B 無(wú)蛋白溶液 5.0 5.0 0.1mol/L 碘液 3.0 3.0 10%NaOH 3.0 3.0 加完試劑后搖勻，放置10min。 2．于各碘量瓶中滴加10%HCl，溶液3ml，使各瓶溶液中和至中性或微酸性。 3．用0.02mol/L Na2S2O3滴定至碘量瓶中溶液呈淺黃色時(shí)，往瓶中滴加數(shù)滴0.1%淀粉溶液2-3滴，使瓶中溶液呈藍(lán)色。 4．用0.02mol/L Na2S2O3 繼續(xù)滴定至碘量瓶中

22、溶液的藍(lán)色消褪為止。 5．記下滴定時(shí)所用去的Na2S2O3溶液的毫升數(shù)，按下式計(jì)算樣品中丙酮的生成量。 （四）計(jì)算 實(shí)驗(yàn)中所用肝勻漿中生成的丙酮量(mmol)=(A—B)×C×1/6 肝臟生成丙硐的量（mmol·g-1）=(A-B)×C× 式中：A為滴定A 樣品所消耗的0.02mol/L Na2S2O3溶液的毫升數(shù)； B為滴定B樣品所消耗的0.02mol/L Na2S2O3溶液的毫升數(shù)； C 為Na2S2O3的濃度（mol/L）。 五、注意事項(xiàng) 1、在低溫下制備新鮮的肝糜，以保證酶的活性。 2、加HCl溶液后即有I2析出，I2會(huì)升華，所以要盡快進(jìn)行滴定，滴定的速度是前快

23、后慢，當(dāng)溶液變淺黃色后，加入指示劑就要慢慢一滴一滴的滴。 3、滴定時(shí)淀粉指示劑不能太早加入，只有當(dāng)被滴定液變淺黃色時(shí)加入最好，否則將影響終點(diǎn)的觀察和滴點(diǎn)結(jié)果。 六、思考題 1. 為什么說做好本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵是制備新鮮的肝糜？ 2. 什么叫酮體？為什么正常代謝時(shí)產(chǎn)生的酮體量很少？在什幺情況下血中酮體含量增高，而尿中也能出現(xiàn)酮體？ 3. 為什么測(cè)定碘仿反應(yīng)中剩余的碘可以計(jì)算出樣品中丙酮的含量？ 4. 實(shí)驗(yàn)中三氯乙酸起什幺作用？ 實(shí)驗(yàn)五 小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的比較 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1．學(xué)習(xí)分光光度計(jì)的原理和使用方法。 2．學(xué)習(xí)測(cè)定淀粉酶活力的方法。 3．了解小麥萌發(fā)前后淀

24、粉酶活力的變化。 二、實(shí)驗(yàn)原理 種子中貯藏的糖類主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解為麥芽糖。 2（C6H10O5）n＋nH2O→nC12H22O11 麥芽糖有還原性，能使3，5- 二硝基水楊酸還原成棕色的3-氨基5-硝基水楊酸。后者可用分光光度計(jì)法測(cè)定。 休眠種子的淀粉酶活力很弱，種子吸脹萌動(dòng)后，酶活力逐漸增強(qiáng)，并隨著發(fā)芽天數(shù)的增長(zhǎng)而增加。本實(shí)驗(yàn)觀察小麥種子萌發(fā)前后淀粉酶活力的變化。 三、器材與試劑 （一）器材 7．恒溫水浴 8 小麥種子 （二）試劑 1．0.1%標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液 20mL 精確稱量100 mg麥芽糖，用少量水溶解后，移入100 m

25、L容量瓶中，加蒸餾水至刻度。 2．pH6.9，0.02 mol／L磷酸緩沖液 100 mL 0.2 mol／L磷酸二氫鉀67.5 mL與0.2 mol／L磷酸氫二鉀82.5mL混合，稀釋10倍。 3．1％淀粉溶液 100 mL 1g可溶性淀粉溶于100 mL 0.02 mol／L磷酸緩沖液中，其中含有0.0067 mol／L氯化鈉。 4．1％ 3，5-二硝基水楊酸試劑 200mL 1g 3，5- 二硝基水楊酸溶于20 mL2 mol／L的氫氧化鈉 溶液和 50 mL水中，再加入30g酒石酸鉀鈉，定容至100 mL。若溶液混濁，可過濾。 5．1％氯化鈉溶液 300 mL 6．海

26、砂5g 四、實(shí)驗(yàn)步驟 1．種子發(fā)芽 小麥種子浸泡2.5小時(shí)后，放入25℃恒 溫箱內(nèi)或在室溫下發(fā)芽。 2．酶液提取 取發(fā)芽第3或第4天的幼苗15株，放入乳缽內(nèi)，加海砂 200 mg，加1％氯化鈉溶液10 mL，用力磨碎。在室溫下放置20分鐘，攪拌幾次。然后將提取液離心（1500 r／min）6～7分鐘。將上清液倒入量筒，測(cè)定酶提取液的總體積。進(jìn)行酶活力測(cè)定時(shí)，用緩沖液將酶提取液稀釋10倍。 取干燥種子15粒作為對(duì)照（提取步驟同上）。 3．酶活力測(cè)定 （1）取25mL刻度試管4支，編號(hào)。按下表要求加入各試劑（各試劑須在25℃預(yù)熱10分鐘） 將各管混勻，放在25℃水浴

27、中，保溫3分鐘后，立即向各管中加入10％3，5-二硝基水楊酸溶液2 mL。 　 （2）取出各試管，放入沸水浴中加熱5分鐘。冷至室溫，加水稀釋至25 mL。將各管充分混勻。 　?。?）用空白管作對(duì)照：在A500nm處①測(cè)定各管的光吸收值，將讀數(shù)填入上表。 　4．計(jì)算 　　根據(jù)溶液的濃度與光吸收值成正比的關(guān)系，即： 　　式中： 　　c為濃度； 　　A為光吸收值。 　　本實(shí)驗(yàn)規(guī)定：25℃時(shí)3分鐘內(nèi)水解淀粉釋放1mg麥芽糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位。 　　則15粒種子或15株幼苗的總活力單位=c酶×n酶×V酶 式中： c酶為酶液中麥芽糖的濃度； 　 　n酶為酶液稀釋倍

28、數(shù)； 　 　V酶為提取酶液的總體積。 五、思考題 1．為什么此酶提純整個(gè)過程在0～5℃條件下進(jìn)行？而測(cè)酶活力時(shí)要在25℃預(yù)保溫？反應(yīng)后又放入沸水浴中？ 2．實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明什么？ 實(shí)驗(yàn)六 過氧化氫酶和過氧化物酶的作用 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 進(jìn)一步加深對(duì)酶催化作用及溫度、底物對(duì)酶作用影響的認(rèn)識(shí)。 二、實(shí)驗(yàn)原理 過氧化氫酶（E）能催化過氧化氫分解，產(chǎn)生水及分子氧。作用機(jī)制如下： 過氧化物酶能催化過氧化氫釋出新生氧以氧化某些酚類和胺類物質(zhì)，例如氧化溶于水中的焦性沒食子酸生成不溶于水的焦性沒食子橙（橙紅色）；氧化愈創(chuàng)木脂中的愈創(chuàng)木酸成為藍(lán)色的愈創(chuàng)木酸的臭氧化物。 三、器材與試劑 （

29、一）器材 1．器材： （二）試劑 1．2%過氧化氫溶液。 2．1%焦性沒食子酸水溶液：焦性沒食子酸1g，溶于100ml蒸餾水。 3．白菜梗提取液：白菜梗約5g，切成細(xì)塊，置研缽內(nèi)，加蒸餾水約15ml，研磨成漿，經(jīng)棉花或紗布過濾，濾液備用。 四、實(shí)驗(yàn)步驟 1．取試管4支，按下表加入試劑。 管 號(hào) 2%H2O2 （ml） 新鮮肝糜 （g） 煮沸肝糜 （g） 生馬鈴薯 （g） 熟馬鈴薯 （g） 1 2 3 4 3 3 3 3 0．5 — — — — 0．5 — — — — 1 — — — — 1 加畢，觀察

30、有無(wú)氣泡放出，特別注意肝糜周圍和馬鈴薯周圍。 2．取4支試管，按下表編號(hào)及加入試劑： 管 號(hào) 1%焦性 沒食子酸 2%H2O2 蒸餾水 白菜梗 提取液 煮沸的白菜梗提取液 1 2 3 4 2ml 2ml 2ml 2ml 2滴 — 2滴 2滴 2ml — — — — 2ml 2ml — — — — 2ml 搖勻后，觀察并記錄各管顏色變化和沉淀的出現(xiàn)。 五、思考題 1．肝糜、馬鈴薯和白菜梗提取液煮熟的目的是干什么？ 實(shí)驗(yàn)七 菜花（花椰菜）中DNA的分離與鑒定 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 初步掌握從菜花中分離核酸的方法，

31、和RNA、DNA的定性檢定。 二、實(shí)驗(yàn)原理 用冰冷的稀三氯乙酸或稀高氯酸溶液在低溫下抽提菜花勻漿，以除去酸溶性小分子物質(zhì)，再用有機(jī)溶劑，如乙醇、乙醚等抽提，去掉脂溶性的磷脂等物質(zhì)，最后用濃鹽溶液(10% 氯化鈉溶液)和0.5mol/L 高氯酸(70℃)分別提取 DNA 和 RNA，再進(jìn)行定性檢定。 由于核糖和脫氧核糖有特殊的顏色反應(yīng)，經(jīng)顯色后所呈現(xiàn)的顏色深淺在一定范圍內(nèi)和樣品中所含的核糖和脫氧核糖的量成正比，因此可用此法來(lái)定性、定量的測(cè)定核酸。 1. 核糖的測(cè)定： 測(cè)定核糖的常用方法是苔黑酚法。當(dāng)含有核糖的 RNA與濃鹽酸及3，5 - 二羥甲苯在沸水浴中加熱10～20分鐘后，

32、有綠色物產(chǎn)生，這是因?yàn)?RNA 脫嘌呤后的核糖與酸作用生成糠醛,后者再與3，5 - 二羥甲苯作用產(chǎn)生綠色物質(zhì)。 DNA、蛋白質(zhì)和粘多糖等物質(zhì)對(duì)測(cè)定有干擾作用。 2. 脫氧核糖的測(cè)定： 測(cè)定脫氧核糖的常用方法是二苯胺法。含有脫氧核糖的DNA在酸性條件下和二苯胺在沸水浴中共熱10分鐘后，產(chǎn)生藍(lán)色。這是因?yàn)镈NA嘌呤核苷酸上的脫氧核糖遇酸生成ω-羥基-6-酮基戊醛,它再和二苯胺作用產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。 100℃ DNA + 二苯胺試劑 藍(lán)色物 此法易受多種糖類及衍生物和蛋白質(zhì)的干擾。 上述二種定糖的方法準(zhǔn)確性較差，但快速、簡(jiǎn)便，能鑒別DNA與RNA，

33、是鑒定核酸、核苷酸的常用方法。 三、器材與試劑 （一）器材 1.恒溫水??；2. 電爐；3．離心機(jī)；4．布氏漏斗裝置；5．吸管；6. 燒杯；7．量筒；8. 剪刀。 （二）試劑 1．新鮮菜花。 2．95％乙醇。 600毫升 3．丙酮。 400毫升 4．5％高氯酸溶液。

34、 200毫升 5．0.5當(dāng)量／升高氯酸溶液。 200毫升 6．10％氯化鈉溶液。 400毫升 7．標(biāo)準(zhǔn)RNA溶液(5毫克／100 毫升)。 50毫升 8．標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液(15毫克/100毫升)。 50毫升 9．粗氯化鈉。

35、 250克 10．海砂。 5克 11．二苯胺試劑。 60毫升 將l克二苯胺溶干100毫升冰醋酸中，再加入2.75毫升濃硫酸(置冰箱中可保存6個(gè)月。使用前，在室溫下?lián)u勻)。 12．三氯化鐵濃鹽酸溶液 25毫升 13．菩黑酚乙醇溶液

36、 200毫升 四、實(shí)驗(yàn)步驟 1．核酸的分離。 (1) 取菜花的花冠20克，剪碎后置于研缽中。加入20毫升95%乙醇和400毫克海沙，研磨成勻漿。然后用布氏漏斗抽濾，棄去濾液。 (2)濾渣中加入20毫升丙酮，攪拌均勻，抽濾，棄去濾液。 (3)再向?yàn)V渣中加入20毫升丙酮，攪拌5分鐘后抽千(用力壓濾渣，盡量除去丙酮)。 (4)在冰鹽浴中，將濾渣懸浮在預(yù)冷的20毫升5％高氯酸溶液中。攪拌，抽濾，棄去濾液。 (5)將濾渣懸浮于20毫升95％乙醇中，抽濾，棄去濾液。 (6)濾渣中加入20毫升丙酮，攪拌5分鐘。抽濾至干，用力壓濾渣

37、盡量除去丙酮。 (7)將干燥的濾渣重新懸浮在40毫升10%為氯化鈉溶液中。在沸水浴中加熱15分鐘。放置，冷卻，抽濾至干，留濾液。并將此操作重復(fù)進(jìn)行一次。將兩次濾液合并，為提取物一。 (8)將濾渣重新懸浮在20毫升0.5當(dāng)量／升高氯酸溶液中。加熱到70℃。保溫20分鐘(恒溫水浴)后抽濾。留濾液(提取物二)。 2．RNA，DNA的定性檢定： (1)二苯胺反應(yīng)： 管號(hào) 1 2 3 4 5 蒸餾水（毫升） 1 — — — — DNA溶液（毫升） — 1 — — — RNA溶液（毫升） — — 1 — — 提取物一(毫升) — — — 1

38、 — 提取物二（毫升） — — — — 1 二苯胺試劑（毫升） 2 2 2 2 2 放沸水浴中10分鐘后的現(xiàn)象 （2）、苔黑酚反應(yīng)： 管號(hào) 1 2 3 4 5 蒸餾水（毫升） 1 — — — — DNA溶液（毫升） — 1 — — — RNA溶液（毫升） — — 1 — — 提取物一(毫升) — — — 1 — 提取物二（毫升） — — — — 1 三氧化鐵濃鹽酸溶液（毫升） 2 2 2 2 2 苔黑酚乙醇溶液（毫升） 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 放沸水浴中10-20分鐘后的現(xiàn)象 五、思考題 根據(jù)現(xiàn)象分析提取物一和提取物二主要含有什么物質(zhì)？