[歷史學(xué)]倫敦大學(xué)帝國學(xué)院igem項(xiàng)目之 學(xué)習(xí)筆記
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1、倫敦大學(xué)帝國學(xué)院igem項(xiàng)目之 學(xué)習(xí)筆記一:荒漠化土壤侵蝕和荒漠化是全球范圍內(nèi)的問題。導(dǎo)致耕地的損失,經(jīng)濟(jì)困難和環(huán)境退化。我們的項(xiàng)目側(cè)重于解決這些嚴(yán)重問題的工程菌,以提高植物根系生長。我們正計劃來實(shí)現(xiàn)我們的細(xì)菌帶入一個種皮,以幫助重新植被的土地侵蝕的風(fēng)險。樹木和植物有助于保持土壤和防止水土流失,導(dǎo)致荒漠化。荒漠化是下降的,其中包括干旱,半干旱和亞濕潤干旱地區(qū)的干旱地區(qū)。干旱地區(qū)近40的地球陸地約兩個億人,其中大部分生活在發(fā)展中國家。旱地土壤維持一個脆弱的生態(tài)系統(tǒng),適應(yīng)罕見的降水和劇烈的溫度變化。過度開發(fā)旱地種植和原料用途的土壤呈現(xiàn)無益的,強(qiáng)迫遷移的社區(qū)搜索肥沃的土地,離開貧瘠的土地裸露,容易受
2、到侵蝕力。在許多發(fā)展中國家的糧食供給缺乏強(qiáng)制的土地短期收益,以及砍伐森林,耕地不斷培養(yǎng)。影響:土壤侵蝕影響的氣候和生物多樣性,往往會導(dǎo)致不可逆的荒漠化。羅茨提高土壤的穩(wěn)定性和防止水土流失 。此外,樹木提供掩護(hù)和保護(hù)附近的動物和植物。在容易發(fā)生水土流失的區(qū)域,這是特別重要的,因?yàn)榻涤晖呛币姷模钱?dāng)它發(fā)生,它往往是非常激烈的,很容易造成表土被沖走。二:植物路線趨化性是根據(jù)吸引或排斥的化學(xué)品的細(xì)菌的運(yùn)動。根系分泌多種化合物,大腸桿菌 大腸桿菌不會被吸引到自然。因此,我們設(shè)計了一種化學(xué)感受器到我們的底盤,可以感知蘋果酸鹽,一個共同的根滲出物中,以便它可以向根游泳。此外,E. 大腸桿菌都在積極采取
3、了由植物的根,這將使成根,我們的系統(tǒng),有針對性的IAA交付。主要由細(xì)菌運(yùn)動對植物根系的植物路由模塊。細(xì)菌運(yùn)動的根源,微生物到自己的根。事實(shí)上,細(xì)菌,它們被用來對營養(yǎng)物質(zhì)的植物,在植物的根,是一個新的發(fā)現(xiàn),去年只當(dāng)Paungfoo Lonhienne等 。非致病性大腸埃希氏菌的吸收到根的擬南芥(豆瓣)和番茄(番茄植物)。他們已經(jīng)成功地復(fù)制了這些調(diào)查結(jié)果。為他們的項(xiàng)目,這是特別有趣的,將暴露于作為植物內(nèi)的根細(xì)胞,這顯著影響的細(xì)菌濃度的IAA需要產(chǎn)生的,以實(shí)現(xiàn)最佳的根生長的細(xì)菌的生長素。此外,植物路線有可能被用來作為一個平臺,提供化合物,自然不會發(fā)生在工廠,沒有基因改造植物本身的根。 (1)細(xì)菌趨他
4、們的主要底盤,濕實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)是大腸埃希氏菌。趨化性E. 大腸桿菌是有據(jù)可查的。這些細(xì)菌可以執(zhí)行兩種類型的運(yùn)動,翻滾和光滑游泳。兩者之間的差異被確定由鞭毛運(yùn)動。在翻滾運(yùn)動,鞭毛順時針移動。這是崔泰源-P和FLIM的,一體的鞭毛相關(guān)蛋白之間的復(fù)合物的形成引起的。在平滑游泳,鞭毛逆時針移動。崔泰源未磷酸化,并因此,不能與鞭毛蛋白,導(dǎo)致在相反的方向旋轉(zhuǎn)的鞭毛。平滑游泳是運(yùn)動,進(jìn)行細(xì)菌對引誘或遠(yuǎn)離劑。平滑游泳是控制趨化蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,使一些示范。圖1:大腸桿菌細(xì)胞表達(dá)superfolder GFP(sfGFP)的擬南芥根的植物與細(xì)菌培養(yǎng)過夜后利用共聚焦顯微鏡可以看到里面。根在PBS中洗滌,成像前,以
5、避免“假陽性”的根的外側(cè)附著的細(xì)菌。根內(nèi)的細(xì)菌對于一個很酷的3D視頻,看看我們的結(jié)果頁。(數(shù)據(jù)和影像帝國IGEM 2011)。 (2)產(chǎn)品規(guī)格1。應(yīng)積極邁向根的細(xì)菌。為了做到這一點(diǎn),需要的細(xì)菌是能夠感應(yīng)到一個共同的根滲出物。我們選擇了重新布線E. 大腸桿菌的趨化通路朝著L( - )的蘋果酸(也簡稱為蘋果酸),檸檬酸循環(huán)中發(fā)現(xiàn)的化合物。它是由分泌的根在低濃度。2。根吸收的細(xì)菌進(jìn)入。吸收細(xì)菌進(jìn)入根,接著所分泌的天然化學(xué)物質(zhì)提出了一個新的平臺,為修改而基因改造植物基因組的植物。3。在我們的機(jī)箱的外源基因的高效表達(dá)。由于我們是從土壤細(xì)菌的基因?qū)氲紼. 大腸桿菌我們必須考慮到影響密碼子偏性,可以發(fā)揮我
6、們的結(jié)構(gòu)的表達(dá)。因此,我們必須確保我們的結(jié)構(gòu)并不受這種現(xiàn)象的表達(dá)。(3)設(shè)計目標(biāo)是確保制定的規(guī)格。1。這種細(xì)菌應(yīng)該感覺到蘋果酸,積極邁向根。雖然蘋果酸敏感的傳感器不自然地發(fā)生在E. 大腸桿菌,他們已經(jīng)確定了其他一些細(xì)菌的種類,包括土壤中的微生物銅綠假單胞菌 PA01株和惡臭假單胞菌 KT2440株。PA2652是一個敏感的蘋果酸的化學(xué)感受器中發(fā)現(xiàn)P. 銅綠微囊藻和MCP是一種受體,發(fā)現(xiàn)P. 惡臭響應(yīng)一些TCA循環(huán)的中間體,包括蘋果酸的1 2 。銅綠假單胞菌和P.趨化的分子機(jī)制 惡臭不同的大腸桿菌 大腸桿菌。然而,有高度的結(jié)構(gòu)相似性的蛋白質(zhì),使在這些生物體的趨化性途徑之間。因此,這是合理的假設(shè),
7、PA2652或MCPS域的將互動與本地的趨化途徑E. 大腸桿菌,細(xì)菌將能夠執(zhí)行引入受體結(jié)合的趨化反應(yīng)后,蘋果酸鹽。2。他們的底盤中的高效表達(dá)。他們用他們的密碼子優(yōu)化軟件優(yōu)化PA2652結(jié)構(gòu)(BBa_K515102)表達(dá)的E. 大腸桿菌。3。構(gòu)建體必須是如模塊化盡可能。表達(dá)的蘋果酸的化學(xué)感受器的基因結(jié)構(gòu)并不復(fù)雜。然而,他們是模塊化的。目前的結(jié)構(gòu),表達(dá)組成型啟動子J23100受。這是的組成啟動的零件注冊表中最強(qiáng)的之一。我們選擇了這個,因?yàn)樗歉菀椎囊粋€結(jié)構(gòu)調(diào)整的表達(dá),而不是調(diào)整它的啟動子。要表達(dá)的遺傳結(jié)構(gòu)調(diào)整,我們已經(jīng)推出了15個基點(diǎn)絕緣體序列,可以方便的啟動子通過PCR使用的互換性和微調(diào)的表達(dá)
8、水平。確保啟動子替換時不改變的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的TIR(翻譯起始速率)。PA2652和MCP翻譯起始率,分別為42010和44050。4。根吸收的細(xì)菌進(jìn)入。根系的吸收都E. 大腸桿菌和面包師的酵母釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中可以觀察到的模式生物擬南芥,并在番茄植株。這是一個自然發(fā)生的過程,(雖然它在土壤中,則仍有待觀察),我們并不需要把額外的基因,我們的設(shè)計吸收發(fā)生。(4)模型1)簡介趨化性上升趨化因子(如在我們的項(xiàng)目中的蘋果酸)的濃度梯度和遠(yuǎn)離的驅(qū)蟲劑是細(xì)菌的運(yùn)動(例如毒物)。E. 大腸桿菌是太小的,檢測到任何在其兩個端部之間的濃度梯度。這些細(xì)菌周圍的環(huán)境重新
9、取樣,每隔3-4秒,無論是翻滾導(dǎo)致細(xì)胞或運(yùn)行。趨化因子短暫的“翻滾”(或偏見)的概率增加。這之后,由感官的適應(yīng)過程,返回到基線偏置,使細(xì)胞進(jìn)一步的濃度變化來檢測和響應(yīng)。在趨化因子濃度的變化在空間上均勻的環(huán)境中增加一小步的響應(yīng)時間從1秒到2-4秒。改變的飽和水平的趨化可以增加響應(yīng)時間到幾分鐘。每一個化學(xué)感受器上的細(xì)菌周質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域通信的鞭毛馬達(dá)通過CHEA,崔泰源,和Chez蛋白的磷酸化繼電器順序。趨化通路建模的結(jié)果,將決定的閾值用于細(xì)菌檢測的趨化因子的濃度和飽和細(xì)菌趨化檢測成為在哪一級,降低細(xì)菌的趨化反應(yīng)的效率。2)模型的趨化途徑 2.1目的使用MATLAB模型的趨化作用的
10、途徑和8M化學(xué)感受器,從而確定檢測閾值和飽和度水平的趨化因子的細(xì)菌。因?yàn)樗徽J(rèn)為應(yīng)放置在靠近最佳生長的種子( 0),翻滾頻率減小,因此翻滾的概率減小。參考中的式(10)6,我們知道,當(dāng)C t1的 -C t2的 0,翻滾隨著chemostatic常數(shù),細(xì)菌速度,濃度差之間相鄰的時間點(diǎn)和角度之間的指數(shù)函數(shù)的概率的兩個時間點(diǎn)。8因此,我們可以凝聚上面的描述,下面的語句:3.3結(jié)果與討論3.3.1 Baterial趨化實(shí)驗(yàn)室在實(shí)驗(yàn)室條件下,趨化因子從源頭上不斷擴(kuò)散,因此,趨化因子隨時間變化的分布格局。的誤差函數(shù)(方程2)在這種情況下,被用來描述的非穩(wěn)定狀態(tài)下的趨化分布。對于趨化的濕實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn),用戶界
11、面設(shè)計的實(shí)驗(yàn)方法來驗(yàn)證其可行性。最初,一個實(shí)驗(yàn)的目的是作為放置一定數(shù)量的細(xì)菌的6厘米距離與不同濃度的趨化源。放置100個細(xì)菌的趨化性的模擬的6厘米遠(yuǎn)離5 mM的蘋果酸源示出在下面的電影。而這MATLAB程序具有一個圖形用戶界面(GUI)(圖4),它可用于由濕實(shí)驗(yàn)室學(xué)生簡單的輸入?yún)?shù)和生成靜態(tài)的圖形或動畫。圖4: MATLAB的圖形用戶界面,(帝國學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì))。上面的視頻顯示,趨化需要14000秒擴(kuò)散到菌落。在這段時間內(nèi)的細(xì)菌會被復(fù)制到所有的板。因此,從建模,可以推斷,這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能無法清楚地表明趨化性(看到的結(jié)果,在我們的濕實(shí)驗(yàn)室)。因此,設(shè)計了新的實(shí)驗(yàn)設(shè)置,作為趨化因
12、子被保持在毛細(xì)管和以及與細(xì)菌懸浮液放入;誘食擴(kuò)散入井設(shè)置濃度梯度。細(xì)菌游泳的濃度梯度,給定的時間后進(jìn)入毛細(xì)管,毛細(xì)管被除去,并在毛細(xì)管中的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行計數(shù)。表明在圖5示出在整個實(shí)驗(yàn)設(shè)計。這種新的模式整合,完善我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這進(jìn)一步細(xì)化又是通知的設(shè)計,我們的分析,這將導(dǎo)致更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù),從而創(chuàng)造出精致的植物檢疫路由模塊之間的循環(huán)的建模和濕實(shí)驗(yàn)室。圖5:演示實(shí)驗(yàn)裝置的毛細(xì)管分析。(圖由倫敦帝國學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì)。)毛細(xì)管和趨化因子的分布狀況是不同的。因此,兩種趨化因子分布狀況進(jìn)行了推導(dǎo),推導(dǎo)的詳細(xì)信息,請?jiān)谶@里下載。示出的單核細(xì)胞趨化在阱的分布,在毛細(xì)管內(nèi)的分布方程中所示的等式3和等式
13、4。同樣地,一個用戶接口的設(shè)計,使?jié)駥?shí)驗(yàn)室學(xué)生不同的輸入?yún)?shù)(圖6)。以下的視頻顯示的模擬與1000個細(xì)菌,用直徑為1mm的填充用1mM的趨化chemotaxing朝向毛細(xì)管。圖。圖7示出了在每個時間點(diǎn)在毛細(xì)管中的細(xì)菌數(shù)量。該模型表明,在毛細(xì)管中積累的細(xì)菌,是在3600秒的最大數(shù)目。因此,我們的模型表明,的濕實(shí)驗(yàn)室的學(xué)生應(yīng)執(zhí)行本實(shí)驗(yàn)為60分鐘,然后收集數(shù)據(jù)。圖6: Matlab的圖形用戶界面,為我們的趨化毛細(xì)管分析。(帝國學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì))。圖7:細(xì)菌的數(shù)量在毛細(xì)管與時間(帝國學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì))。3.3.2在土壤中的細(xì)菌趨在現(xiàn)實(shí)的土壤,蘋果酸鹽用作趨化。馬拉特是
14、不斷從根尖分泌3 mM的9的濃度。在這種情況下,蘋果酸源總是補(bǔ)充由于持續(xù)分泌從根和分配方式可以被認(rèn)為是穩(wěn)定的(即與時間無關(guān))。的穩(wěn)定狀態(tài)Keler的謝格爾模型是用來證明這個分布(公式5)。真正的蘋果酸在土壤中的分布顯示在圖5。細(xì)菌趨藥性的路徑,當(dāng)將細(xì)菌在穩(wěn)態(tài)蘋果酸分布在不同的位置上時,表明在圖5。圖8(a):的蘋果酸鹽的距離(1D),圖8(b):蘋果酸鹽用半徑(2D)中的分布的分布,圖8(b)示出的位置的閾值檢測的濃度(1e的-8 M的半徑= 0.028 m)和飽和濃度(是1e-5 M的半徑= 0.012)。圖9:與細(xì)菌的趨化性放置在不同的起始位置。 藍(lán):210 5秒趨化開始于半徑= 0.01
15、5米(之間0.012 m和0.028米的),綠色:210 5秒趨化開始于半徑=0.008米,這是小于0.012。這表明的細(xì)菌的趨化反應(yīng)是低效的,當(dāng)它們被放置在從根尖端0.0028米0.0012米。綠線表示,這種細(xì)菌可保持接近的種子,當(dāng)它被放置在遠(yuǎn)離根尖的距離小于0.012米。因此,該模型表明,這種細(xì)菌被放置在一個距離小于0.012米,在我們的項(xiàng)目實(shí)施。最后,用于細(xì)菌檢測的閾值的趨化因子的濃度是110 -8 M和細(xì)菌趨化檢測變得飽和水平是110 -5 M。我們還表明,檢測閾值和飽和度水平是趨化因子受體的數(shù)量無關(guān),然而,為了使最大靈敏度,最強(qiáng)的啟動子應(yīng)該選擇植物路由模塊。此外,與蘋果酸濃度等于3
16、mM的,閾值檢測的濃度是在從根0.028米的距離,和飽和濃度達(dá)到0.012米(1.2厘米)遠(yuǎn)離根。從建模的細(xì)菌種群的趨化性,我們觀察到根的趨化性是緩慢的,如果該細(xì)菌最初放置在兩者之間0.012 m和0.028米的,同時,放置從根0.012米內(nèi)細(xì)菌時,細(xì)菌很可能穩(wěn)定和保持密切的根。穩(wěn)定的細(xì)菌本地化,(1.2厘米)的距離是大于0.25厘米(營養(yǎng)物質(zhì)可以有效地根的距離),因此,建議的細(xì)菌,我們的種皮的實(shí)施,應(yīng)放置在或接近0.25厘米遠(yuǎn)離根。二:生長素(1) 概觀生長素,或吲哚-3 -乙酸(IAA),是一種植物生長的激素,它是通過幾個土壤細(xì)菌。我們已經(jīng)采取的基因編碼,從假單胞菌savastanoi I
17、AA生產(chǎn)的途徑,并表示他們在大腸埃希氏菌。植物路由模塊對根和吸收趨化之后,IAA表達(dá),目的是提高土壤的穩(wěn)定性,促進(jìn)根系生長其也被稱為是一個充分研究的負(fù)責(zé)響應(yīng)于生物和非生物脅迫的用于植物生長的植物激素。通常,類似的-萘乙酸(NAA)和2,4 - 二氯苯氧乙酸(2,4-D)的合成生長素作為除草劑的使用。在過去的50年來,由于他們的高效率和廉價的成本,他們已經(jīng)在作為除草劑的用途。雖然生長素是一種促生長的激素,它可以在高濃度下對植物的代謝負(fù)擔(dān),因此,毒性。合成生長素是非常穩(wěn)定,在土壤中能堅(jiān)持幾個星期,這就是為什么他們是非常有效的除草劑。IAA,在另一方面,是化學(xué)不穩(wěn)定的,并可以很容易地由植物代謝。因此
18、,如果我們在我們的底盤生產(chǎn)IAA,它應(yīng)該促進(jìn)而不是阻礙植物根系的生長。仍然是一種風(fēng)險,即IAA可以仿照在硅片告知生長素隨心模塊的設(shè)計,其合成前在高濃度,因此,基因表達(dá)水平的植物是有毒的。我們的目標(biāo)是產(chǎn)生IAA E. 大腸桿菌中以受控的方式,以便它永遠(yuǎn)不會到達(dá)的毒性閾值。在整個項(xiàng)目,該模塊將負(fù)責(zé)影響根系生長,形成復(fù)雜的根網(wǎng)絡(luò),可以有效地保持土壤,防止其侵蝕的目的。圖1。的化學(xué)結(jié)構(gòu),合成的和天然的生長素。(圖片由先正達(dá)提供)。(2)產(chǎn)品規(guī)格1。一個簡單的的IAA生產(chǎn)的途徑,可以表現(xiàn)在我們的底盤。IAA是一種植物激素,促進(jìn)植物生長的細(xì)菌快遞(PGP) IAA的植物對營養(yǎng)物質(zhì)的交換。有幾種不同的途徑可
19、以制作IAA(圖1)。我們決定使用的IAM的途徑,因?yàn)樗驯蛔C明在E.工作 大腸桿菌,并且由的只有兩種酶。2。片段序列設(shè)計適合聚合酶延伸組件的方法,以最低的成本。我們決定用聚合酶延伸,而不是標(biāo)準(zhǔn)限制連接的組件的裝配,因?yàn)樗鼘⑹刮覀兡軌蛴嗁彾鄠€片段的序列。這將保持低于1000 bp的訂單,也降低了生產(chǎn)時間。此外,像吉布森和CPEC的方法,使我們能夠建立包含多個組件的結(jié)構(gòu),在一個反應(yīng),而不是不必結(jié)扎每個BioBrick順序的。3。實(shí)現(xiàn)足夠的IAA的表達(dá)水平在我們的底盤,在我們的工廠模式,以提高根系的生長。IAA在我們的底盤表達(dá)的目的是提高植物根系的生長,并最終提高土壤的穩(wěn)定性。因此,我們需要的IA
20、A濃度的影響根系生長模擬和測試,以確定最佳的濃度不引起毒性。4。調(diào)整的IAA生產(chǎn)水平啟動子不影響RBS強(qiáng)度的情況下切換。要促進(jìn)未來調(diào)整的表達(dá),我們在設(shè)計結(jié)構(gòu)時,蘇格蘭皇家銀行是不會受到影響的發(fā)起人。為了做到這一點(diǎn),我們增加了15個基點(diǎn)絕緣體它們之間的序列。5。建立一個結(jié)構(gòu),密碼子優(yōu)化為E. 大腸桿菌和B。枯草芽孢桿菌。我們使用的是E. 大腸桿菌作為我們的機(jī)箱,因?yàn)槿祟悓?shí)踐問題,周圍環(huán)境中的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的蔓延。此外,它已被證明,大腸桿菌 大腸桿菌是采取了積極的擬南芥 2 。然而,在未來,我們希望有可能建立相同的構(gòu)造B. 枯草芽孢桿菌,一個突出的土壤中的孢子形
21、成的細(xì)菌。圖1。有幾種不同的IAA的生產(chǎn)途徑。該IAM通路是一個兩步驟的途徑,從前驅(qū)體色氨酸生成吲哚-3 -乙酸(IAA)。IAA色氨酸單加氧酶(IAAM),催化氧化羧化的L-色氨酸為吲哚-3 -乙酰胺水解為吲哚-3 -乙酸和氨的吲哚乙酰胺水解酶(IAAH)1 。(3)設(shè)計他們心中的規(guī)格,我們通過文獻(xiàn)搜索和咨詢專家告知我們的IAA表達(dá)結(jié)構(gòu)的設(shè)計。1。該IAM通路是一個簡單的IAA的制造途徑與只有一個中間。他們選擇,使用IAM(吲哚乙酰胺)的途徑,來源于假單胞菌savastanoi。此途徑只涉及兩種酶產(chǎn)生IAA(iaaM和戰(zhàn)勝饑餓國際聯(lián)盟),因此最大限度地減少碎片的數(shù)量,我們需要在我們的結(jié)構(gòu)組裝
22、。2。設(shè)計適合于基于聚合酶延伸組裝的基因序列。由于他們有兩個比較大的酶(約61 kDa和47 kDa的),他們決定每一個分裂成兩個片段,以加快其合成。他們設(shè)計了50 bp的重疊區(qū)域的端部的每一個的四個片段,以便能夠快速基于聚合酶延伸的組裝成標(biāo)準(zhǔn)pSB1C3矢量。3。實(shí)現(xiàn)足夠的IAA的表達(dá)水平在我們的底盤,以提高我們的模式植物的根系生長。我們將iaaM和戰(zhàn)勝饑餓國際聯(lián)盟基因的控制下的Pveg2啟動。我們選擇該啟動子,因?yàn)樗枪δ蹺. 大腸桿菌和B??莶菅挎邨U菌。4。是絕緣體序列設(shè)計,使啟動開關(guān)。為了使調(diào)整的IAA生產(chǎn),使用不同強(qiáng)度的推動者,我們正在設(shè)計一個絕緣體序列前面iaaM和戰(zhàn)勝饑餓國際聯(lián)盟
23、,不影響RBS實(shí)力的情況下啟動開關(guān),以方便使用PCR的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。5。聯(lián)合密碼子優(yōu)化E. 大腸桿菌和B??莶菅挎邨U菌他們做了一個密碼子優(yōu)化軟件,優(yōu)化兩款機(jī)箱都提供靈活性,在未來的iaaM和戰(zhàn)勝饑餓國際聯(lián)盟序列,盡管我們目前使用的E. 大腸桿菌作為我們的底盤。(4)模型1)簡介足夠的生產(chǎn)能有效地促進(jìn)植物根系生長的植物激素或轉(zhuǎn)基因(GM)大腸埃希氏菌吲哚-3 -乙酸(IAA) 。但是,IAA是對植物有毒的,如果它的濃度過高。因此,重要的是IAA表達(dá)水平能夠預(yù)測一個給定的子,然后調(diào)整子強(qiáng)度,以保證我們的大腸桿菌最佳的IAA 增加根系生長。IAA增加根系生長,根長和分支數(shù)量方面。為了研究不同濃度的
24、IAA影響根系的生長模式,建模工具,用濕實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果,結(jié)合預(yù)測和可視化擬南芥根系生長。2)IAA合成模擬 2.1目的一個單一的E.確定IAA表達(dá)水平 大腸桿菌細(xì)胞與IAA啟動子強(qiáng)度4.536 RNA /分鐘/g的底物DNA,然后預(yù)測要放置在種子涂層,誘導(dǎo)最佳的根生長的細(xì)菌數(shù)量。2.2說明遺傳工程的IAA途徑涉及兩個基因,iaaM和IAAH,這兩者都是組成型表達(dá)。IAAM基因編碼色氨酸2 -單加氧酶(T-2-monase),色氨酸(Trp)的吲哚-3 -乙酰胺的催化轉(zhuǎn)換(IAM),然后將其水解以釋放吲哚-3 -乙酸(IAA)由水解酶IAAH 3 。在同一時間,合成的IAM和IAA將競爭性地抑制
25、色氨酸2 -單加氧酶的酶活性,從 而誘導(dǎo)的IAA的表達(dá)上的負(fù)反饋環(huán)路。圖1中示出在該途徑所涉及的酶促反應(yīng)。圖1:IAA合成途徑。(圖由倫敦帝國學(xué)院的iGEM比賽的隊(duì))。此外,從美國科羅拉多大學(xué)的研究進(jìn)行了數(shù)學(xué)生物學(xué)研究組的基礎(chǔ)上4 ,色氨酸也是負(fù)面的控制內(nèi)的細(xì)菌。因此,色氨酸合成途徑應(yīng)納入上述模型。此外,為了減少的數(shù)目的參數(shù),如在圖1中的參數(shù)大多數(shù)是不提供給我們,在IAA通路然后分為兩個米氏米氏方程,與色氨酸的途徑和組成型基因表達(dá)的T相結(jié)合的簡化-2-monase和IAAH。整個色氨酸IAA通路模型5中描述的公式1 ,和參數(shù)定義在下面的參數(shù)部分。在這個模型中,我們提出以下假設(shè):(1)他們忽視了
26、很短的時間延遲,由于TRP-T-2-monase(底物酶(ES)復(fù)雜的),IAM-戰(zhàn)勝饑餓國際聯(lián)盟(ES的復(fù)雜),IAM-T-2-monase(抑制酶的合成( EI)配合物)和IAA-T-2-monase(抑制劑的酶(EI)絡(luò)合物),并假定這些物種幾乎在瞬間達(dá)到其平衡。(2)IAA的降解率在黑暗中細(xì)菌的生長速度相比是非常低的。因此,我們使用了細(xì)菌的生長速率,在這個模型中的IAA降解率。在建模的IAA通路(3),我們發(fā)現(xiàn),IAA合成的速率確定的物種是(IAM),而不是酶IAAH,因?yàn)樯a(chǎn)的IAM被抑制本身和IAA。2.3結(jié)果與討論1。每個蛋白物種的濃度是如何隨時間變化。2。各物種的酶促反應(yīng),與O
27、 F = 1.5410 -4 M,M F = 3.7810 -4 M,E = 0.378M,色氨酸= 4.1M和所有其他= 0的初始濃度的模擬4。此外,圖2示出,IAA的表達(dá)水平為72.35M,這意味著每個細(xì)菌生產(chǎn)的7.2410 -14微摩爾每細(xì)菌在穩(wěn)定狀態(tài)下與細(xì)菌的體積等于10 -15分米3。從潮濕的實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)中,我們知道,IAA以促進(jìn)根系生長的最佳濃度為0.1 nm,和擬南芥種子的體積約等于3.610 -9米3 7 。因此,需要存在于種皮,以最大限度地提高根根系生長的細(xì)菌數(shù)為4.9710 6。詳細(xì)的計算中列出如下:1。一個單一的細(xì)菌所產(chǎn)生的摩爾數(shù)是72.35微米* 10 -18米3(7.2
28、35 * 10 -17微摩爾)。2。的IAA的摩爾數(shù),需要在一個種皮是3.6 * 10 -9米3 * 0.1 nmol。3。細(xì)菌的數(shù)量需要是發(fā)生在一個種皮(3.6 * 10 -10微摩爾)/(7.23510 -17)= 4.9710 6。 圖2(a):(的IAM)隨時間的演變。圖2(b):的IAA對時間的演變。總之,我們獲得的IAA濃度的,IAA DNA結(jié)構(gòu)(72.25M)產(chǎn)生的。從這個值,我們計算出的細(xì)菌數(shù)量,將需要輸入理想的生長條件,而忽略死亡和分裂的細(xì)菌,這被認(rèn)為是4.97x10 6 細(xì)菌擬南芥的根目錄下。此值由于在不同的植物種子大小的變化而變化。由于細(xì)菌細(xì)胞可從該植物中丟失,不是所有的
29、細(xì)菌從種皮進(jìn)入工廠,在種皮所需的細(xì)菌的數(shù)目將是高于此。此外,在接下來的部分根系生長模型幫助我們想象的根系生長。3)IAA的吸收和根系的生長3.1目標(biāo)1創(chuàng)建一個圖形程序來演示的擬南芥根系的生長過程,Lindenmayer系統(tǒng)和植物生理學(xué)的原則的基礎(chǔ)上。2使用Matlab數(shù)據(jù)擬合工具來開發(fā)IAA濃度和增長速度的分行數(shù)目之間的關(guān)系。3.2說明我們使用計算的工具,visulise根系生長的現(xiàn)象,(主要根長,分枝,根系密度等)在不同的enviromental條件下,特別是根序和根長。根為了描述一個根系統(tǒng)的分支“代”,被定義為一個零階根的根不分枝。根系生長取決于環(huán)境因素的影響,比如引力和土壤的非均質(zhì)性。3
30、.2.1向性一個根系統(tǒng)啟動的零階根單根的尖端。然后根遠(yuǎn)離植物的莖生長在一個錐形的方式10 。根系生長取決于環(huán)境因素的影響,比如引力和土壤的非均質(zhì)性。因此,兩個更多的變量被定義為描述植物適應(yīng)- 多么強(qiáng)大的根每平方厘米的增長方向的變化- 一個更大的值表示更偏轉(zhuǎn)的根和更扭曲的根系統(tǒng)- 試驗(yàn)的次數(shù),其根部,以找到最佳的角度和的旋轉(zhuǎn)的向下運(yùn)動- N可以是任意實(shí)數(shù)。如果N = 1.5,如果,N可以是1或2的裝置。圖3:不同的N值和的根系統(tǒng)之間的差異。(建模根據(jù)丹尼爾萊特納等人BOKU和代碼的修改,由倫敦帝國學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì))。3.2.2 Lindenmayer系統(tǒng)和根系的生長模型L-系統(tǒng)是
31、一個平行的重寫系統(tǒng),即一個正式的語法的一個變體,最有名的用于模擬植物發(fā)育過程中的生長,但也能夠模擬各種生物體的形態(tài),由于兩個主要性能:遞歸和自相似性11 。植物模型和自然的有機(jī)形態(tài)很容易定義,如通過增加遞歸級別的形式慢慢“長大”,并變得更加復(fù)雜。使用L-系統(tǒng),用于產(chǎn)生圖形圖像的要求,在模型中的符號是指在計算機(jī)屏幕上的圖的元素。解釋每不變的L-系統(tǒng)模型的龜命令。 3.2.3根系生長;造型的IAA攝取的預(yù)測答案的問題,如:“什么是初生根的生長率是多少?”“什么是根系統(tǒng)一段時間后的樣子嗎?”“如何擬南芥不同IAA濃度?“ 我們修改一個MATLAB程序開發(fā)丹尼爾萊特納的研究小組6展示的3D根系統(tǒng)的基礎(chǔ)
32、上的原則林登梅耶系統(tǒng)(龜?shù)拿睿?,并在根增長模型工具箱由丹尼爾萊特納等人從BOKU(Universitt獻(xiàn)給Bodenkultur維也納開發(fā)維也納的自然資源和生命科學(xué)大學(xué))12 。 3.2.4數(shù)據(jù)擬合我們采取了從文獻(xiàn)的增長速度參數(shù),我們的濕實(shí)驗(yàn)室的原始數(shù)據(jù),為我們的項(xiàng)目提供更準(zhǔn)確,更合適的參數(shù)進(jìn)行了分析。擬南芥植物種植和根的長度和數(shù)量的分支記錄每兩天從第0天到第9天。根長,每天根系生長速率和分支數(shù)量繪制了時間和IAA濃度。 3.3結(jié)果與討論3.3.1根系統(tǒng)的可視化從文獻(xiàn)中的值給外部IAA濃度之間的關(guān)系,和根的伸長為510 -5 mol / L的200m的伸長率在30分鐘內(nèi)。因此,生長速度的建模
33、參數(shù)是9.6 * 10 -3 m /天。我們觀察到真正的根的生長模式和修改我們的模擬,以提供更可靠,更準(zhǔn)確的預(yù)測根的生長。擬南芥中有一個主根與零階和它厚比分行。擬南芥一般長到20-30厘米的深度內(nèi)的土壤和分支只有一次。如下所示的3D畫面預(yù)測的根的生長具有不同伸長率(與IAA = 0.96厘米/天;未經(jīng)IAA = 0.46厘米/天10 )。它們可與一個真正的根系統(tǒng)的照片。 圖4:擬南芥根系統(tǒng)的3D visalisation。的曲線圖圖4(a)(b)表示不同IAA濃度作為我們的模擬結(jié)果中的生長時間為20天的條件下與的擬南芥根系統(tǒng)中示范。圖4(c)(d)是真正的擬南芥植物的文獻(xiàn)和我們的濕實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際
34、照片。(建模根據(jù)丹尼爾萊特納等人BOKU和代碼的修改,由倫敦帝國學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì))。(4)裝配圖。1:大會戰(zhàn)略為我們的生長素隨心結(jié)構(gòu)。(圖由倫敦帝國學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì))。我們下令iaaM和IAAH作為兩個片段的編碼序列,以減少成本和時間(片段1,2,3和4)。我們不希望使用PCR擴(kuò)增的片段,以避免引入到我們的最終構(gòu)建的突變,因此我們將我們的MlyI限制性內(nèi)切酶的合成序列兩側(cè)的鈍的一端切點(diǎn)。說穿了,Mly1(II型限制性內(nèi)切酶)削減5個堿基的識別位點(diǎn)距離。此屬性允許我們只切出各片段的編碼序列。每一個消化的片段,然后凝膠提取準(zhǔn)備組裝。pSB1C3載體的骨架載體的同時反
35、PCRd放大所需的重疊。我們計劃相結(jié)合的四個片段到pSB1C3載體由吉布森裝配,不幸的是,我們的嘗試都失敗了,我們推測,這是由于骨架載體上的同源性,使其重新退火。我們恢復(fù)到CPEC組裝結(jié)構(gòu),一種方法,需要更廣泛地使用PCR比吉布森。這就是說,通過引入MlyI的酶切位點(diǎn),我們的人數(shù)減少一半所需要的PCR步驟,從而減少了潛在的突變率。循環(huán)聚合酶延伸克?。–PEC)是一個獨(dú)立的引物PCR裝配技術(shù),它依賴于各部分之間的重疊序列進(jìn)行組裝。有了一個變性步驟中,雙鏈DNA的熔融,允許兼容的單鏈的兩端各部分加入。出于這個原因,它是必不可少的,該部件被設(shè)計為同源的端部(被設(shè)計我們所使用的片段用50 bp的重疊)
36、。退火后的重疊端,然后作為引物,聚合酶延伸的部分加入到一個無縫的構(gòu)造。CPEC的第一次嘗試是成功的。DNA由E. 大腸桿菌 DH5中菌落的組裝構(gòu)造轉(zhuǎn)化miniprepped并發(fā)送到歐陸用于測序。序列進(jìn)行了驗(yàn)證,所以我們進(jìn)行特征IAA生產(chǎn)建設(shè)。圖。2:組裝結(jié)構(gòu)限制切割骨干前綴和后綴分別用EcoRI和PstI消化,使我們能夠確定如果插入是正確的大小。1巷包含1 KB +梯作為參考。泳道2,泳道3 PstI和第4泳道都用EcoRI消化。將得到的帶的大小是約4 kb的與組裝的四個片段的大小。(數(shù)據(jù)由倫敦帝國學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì))。圖。3:甲最終生長素隨心構(gòu)造示意圖。點(diǎn)擊每個部分被定向到零件
37、注冊表的相關(guān)頁面。(圖由倫敦帝國學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì))。三:基因衛(wèi)士遏制是一個嚴(yán)重的問題,關(guān)于釋放到環(huán)境中的轉(zhuǎn)基因生物(轉(zhuǎn)基因生物)。為了防止基因水平轉(zhuǎn)移的基因表達(dá)我們的底盤,我們已經(jīng)開發(fā)出一種系統(tǒng)的基礎(chǔ)上,編碼holin,反holin和溶素的基因。我們是工程的抗holin到我們的底盤,在那里它的作用作為抗毒素,和holin和細(xì)胞內(nèi)溶素的質(zhì)粒DNA上的基因組中。在與土壤細(xì)菌的水平基因轉(zhuǎn)移事件,holin和細(xì)胞內(nèi)溶素將不含抗holin轉(zhuǎn)移,使受體細(xì)胞非可行的和有效含有生長素Xpress和植物路線基因在我們的機(jī)箱的。(1)概觀對于人類實(shí)踐告訴我們項(xiàng)目的設(shè)計,我們決定拿出新的解決方案,以
38、轉(zhuǎn)基因生物的環(huán)境釋放的風(fēng)險降到最低。我們試圖想超越遏制“殺死開關(guān)”機(jī)制,并提出了這樣的問題:“什么最壞的情況下,如果我們要釋放我們到野外的轉(zhuǎn)基因?“ 和“如何避免這些問題呢?”。轉(zhuǎn)基因生物釋放的最棘手的后果之一是水平基因轉(zhuǎn)移的非天然質(zhì)粒DNA,以現(xiàn)有的土壤細(xì)菌,經(jīng)常發(fā)生的過程?;騁uard是一種新的機(jī)制,以防止轉(zhuǎn)基因生物的遺傳物質(zhì)的交流,以防止自然發(fā)生的微生物基因的水平轉(zhuǎn)移,因此一個可行的解決方案。它將使用一個毒素/抗毒素系統(tǒng),其中反holin被整合到基因組中,我們的機(jī)箱中,將防止holin上的質(zhì)粒編碼的內(nèi)溶素,以裂解細(xì)胞。然而,如果該質(zhì)粒被轉(zhuǎn)移到任何其他細(xì)菌的物種,是不是我們改造細(xì)菌,它會
39、引起細(xì)胞裂解,從而防止包含在我們的GMO的遺傳信息的傳播。該模塊的組裝和測試的同時,我們嘗試與土壤中的細(xì)菌,看到多久,他們保留了GFP表達(dá)E.獲得的熒光 通過水平基因轉(zhuǎn)移的大腸桿菌。對于我們?nèi)祟悓?shí)踐的方法對轉(zhuǎn)基因釋放的更多信息(2)產(chǎn)品規(guī)格1。防止任何其他細(xì)胞,是不是我們自己的GMO非可行的水平基因轉(zhuǎn)移水平基因轉(zhuǎn)移(圖1)是主要的問題,我們能想到的,當(dāng)它來釋放轉(zhuǎn)基因生物在現(xiàn)場測試,后來在項(xiàng)目的實(shí)施階段。這是一個共同的問題,即使在轉(zhuǎn)基因作物,轉(zhuǎn)基因生物和自然生物之間的異花授粉是恒定的憂慮。在細(xì)菌中,基因通常轉(zhuǎn)移到其他物種通過共軛或通過從溶解的轉(zhuǎn)基因生物的遺傳物質(zhì)的攝取。由于遺傳物質(zhì)仍然可以采取其
40、他物種的裂解后我們的轉(zhuǎn)基因生物,其中一個使用一個輸入誘導(dǎo)裂解是一個傳統(tǒng)的殺開關(guān)不是一個可行的和安全的選項(xiàng)。因此,我們認(rèn)為,設(shè)備必須是內(nèi)的遺傳物質(zhì)本身,而不是自然產(chǎn)生的細(xì)菌引起的反應(yīng)。展望殺死在過去已經(jīng)使用的開關(guān),我們發(fā)現(xiàn)的T4 holin-溶素系統(tǒng)。如果我們要添加這些基因的質(zhì)粒,我們可能引起的任何有機(jī)體,我們已經(jīng)采取了質(zhì)粒的直接裂解。 圖1。水平基因轉(zhuǎn)移(格雷斯金,2006年1 )2。該模塊必須不受到傷害的我們自己的轉(zhuǎn)基因T4噬菌體必須能夠延緩其主機(jī)之前,它是可以復(fù)制和裝配的許多副本本身的裂解。為了做到這一點(diǎn)也有T4噬菌體的蛋白質(zhì)稱為抗holin結(jié)合從而防止細(xì)胞裂解的holin。本質(zhì)上,該系統(tǒng)
41、的工作原理作為定時器給噬菌體足夠的時間來復(fù)制。通過使用反holin的從這個系統(tǒng)中,我們可以防止我們自己的細(xì)胞裂解。然而,我們不能有它的質(zhì)粒否則仍可能有兩個質(zhì)粒的有機(jī)體的可能性。因此,我們必須錨定的基因組內(nèi)。為了做到這一點(diǎn),我們需要用CRIM質(zhì)粒。CRIM(復(fù)制的條件,整合和模塊化)質(zhì)粒可以集成在單一的副本到基因組的E. 大腸桿菌。3。表達(dá)的設(shè)備不會有太大的代謝負(fù)擔(dān)由于我們的最終系統(tǒng)將使用植物路線和生長素隨心模塊的,我們必須考慮,修改后的細(xì)菌就已經(jīng)是下一個巨大的代謝負(fù)擔(dān)。因此,使用必要的最低限度的資源基因警衛(wèi)促進(jìn)趨化對蘋果酸和IAA生產(chǎn)由我們的系統(tǒng)將是有益的。4。必須能夠來測試系統(tǒng)是否要做到這一
42、點(diǎn),我們必須使用報告基因。最常見的報告基因的熒光蛋白RFP和GFP等。由于質(zhì)粒CRIM,已經(jīng)有sfGFP,我們將使用,測試表達(dá)反holin。為了測試是否該質(zhì)粒是功能,我們將結(jié)合RFP到質(zhì)粒。我們希望能夠看到一個天然的細(xì)菌質(zhì)粒熒光紅色寬視場顯微鏡前裂解。(3)設(shè)計目標(biāo)是確保制定的規(guī)格,被認(rèn)為是基因衛(wèi)隊(duì)的設(shè)計。1。防止任何其他細(xì)胞,是不是我們自己的GMO非可行的水平基因轉(zhuǎn)移T4細(xì)胞內(nèi)溶素和T4 holin的是反PCRd從BBa_K112808。然而,我們必須確保接收這些基因的細(xì)胞裂解。為了確定所使用的啟動,我們模擬整個系統(tǒng)。既然有這么多的holin和溶素(高拷貝質(zhì)粒)等少數(shù)幾個副本的holin基因
43、(基因組)的副本,我們決定J23103子相對于J23100子,我們可以選擇正確的強(qiáng)度。但是,我們也有這個弱的啟動子型號是否有足夠的接收質(zhì)粒的細(xì)胞裂解。根據(jù)我們的模型,任何接收我們的holin的和溶素基因的細(xì)胞裂解。2。該模塊必須不受到傷害的我們自己的轉(zhuǎn)基因此模塊主要依賴于模型在設(shè)計過程中。我們必須考慮到一個事實(shí),即質(zhì)粒的拷貝數(shù)和基因組中的拷貝數(shù)是可變的設(shè)計時,毒素和抗毒素成分。我們發(fā)現(xiàn),該啟動子的holin-細(xì)胞內(nèi)溶素的質(zhì)粒具有弱于的holin構(gòu)建體中的基因組是有效的是40-400倍。該比率應(yīng)采取考慮到的基因的拷貝數(shù)之間的可變性,并確保不存在的至少一個為每一個反holin分子產(chǎn)生holin分子
44、??梢钥隙ǖ氖?,我們修改后的細(xì)菌會存活holin的和溶素的生產(chǎn),我們選擇了J23103的啟動子具有一定的實(shí)力在低端的啟動子強(qiáng)度范圍。這提供了以下兩種結(jié)構(gòu)的設(shè)計:3。表達(dá)的設(shè)備不會有太大的代謝負(fù)擔(dān)雖然這個規(guī)范是非常重要的,它沒有在這個版本的模塊的設(shè)計中發(fā)揮了巨大的作用。這是因?yàn)椋湍壳岸?,生長素是一種概念證明系統(tǒng)。一旦它已經(jīng)表明,基因Guard是一個可行的遏制方法,我們將修改的構(gòu)造,以實(shí)現(xiàn)具有抗holin滅活holin,而不是對細(xì)胞是一個很大的負(fù)擔(dān)之間的理想平衡。4。能夠測試系統(tǒng)的工作原理為了做到這一點(diǎn),我們決定附加RFP作為holin根據(jù)相同的啟動子和細(xì)胞內(nèi)溶素的基因的編碼序列。這將使我們能
45、夠輕松,直觀的測試細(xì)胞是否包含我們的質(zhì)粒。至于holin構(gòu)建體,CRIM質(zhì)粒已經(jīng)包含一個sfGFP的序列。將能夠區(qū)分我們完成的構(gòu)建從每一個其他的細(xì)胞,由于其卡那霉素和氨芐青霉素抗性,以及其生產(chǎn)的RFP和sfGFP。因此,我們將能夠看到我們的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到一個單元格不發(fā)出綠色熒光,應(yīng)該是能夠跟蹤是否溶解或下寬視場顯微鏡。(4)模型1)簡介基因防護(hù)裝置包括三種蛋白質(zhì):1。 Holin是一種蛋白質(zhì),形成孔隙的配合物在細(xì)菌內(nèi)膜和這些孔允許細(xì)胞內(nèi)溶素進(jìn)入的周質(zhì)空間。2 溶素是一種酶,能分解細(xì)胞壁和誘導(dǎo)細(xì)胞裂解。3。 反holin結(jié)合holin并阻止它的形成毛孔。我們的系統(tǒng)將holin和細(xì)胞內(nèi)溶素的基因一起的
46、草本-路由和生長素隨心基因的質(zhì)粒上,和反holin基因的強(qiáng)啟動子的控制下的基因組上。該生產(chǎn)的抗holin的會阻止細(xì)胞裂解的轉(zhuǎn)基因(GM)細(xì)菌通過停用holin。如果該質(zhì)粒不含抗holin它的基因組(例如任何野生型土壤細(xì)菌)轉(zhuǎn)移到一個不同的細(xì)菌,holin和細(xì)胞內(nèi)溶素的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞裂解。這將防止擴(kuò)散的生長素載體,含有植物的路線和生長素隨心基因,自然產(chǎn)生的土壤細(xì)菌。2)目標(biāo)此設(shè)備的成功的關(guān)鍵是正確的比例,這樣的反holin的,可以關(guān)閉所有holin,我們修改后的細(xì)菌中產(chǎn)生的,并holin的表達(dá)水平野生型細(xì)菌的holin和反holin的生產(chǎn)是高到足以誘導(dǎo)細(xì)胞溶解??刂苹虮磉_(dá)的啟動子強(qiáng)度和核糖體結(jié)合
47、位點(diǎn)(RBS)的實(shí)力,造型的基因警衛(wèi),重要的是要幫助我們選擇適當(dāng)強(qiáng)度的一個子和蘇格蘭皇家銀行的。3)說明基因衛(wèi)兵的建模由兩部分組成,一個是在野生型細(xì)菌的holin生產(chǎn)和其他抗holin holin的失活在我們的改性的細(xì)菌。因?yàn)樵谖覀兊南到y(tǒng)中的所有的基因組成型表達(dá),我們只考慮穩(wěn)定狀態(tài)。在野生型土壤細(xì)菌的Holin生產(chǎn)導(dǎo)出一個單一的質(zhì)粒的啟動子強(qiáng)度之間的關(guān)系,和RBS強(qiáng)度holin集中在這部分的造型。為了模擬這種情況,作如下假設(shè):1)基因衛(wèi)隊(duì)包含在一個pSB1C3質(zhì)粒含有pUC19中衍生的促進(jìn)pMB1復(fù)制起點(diǎn)(100-300分子每單元)5 。在細(xì)菌中的質(zhì)粒的數(shù)量范圍從100到300每個細(xì)胞。為了確
48、保子和蘇格蘭皇家銀行是足夠強(qiáng)大的的holin /溶素是有效的,我們低估了質(zhì)粒的土壤細(xì)菌為50,盡管他們總是至少有100。因此,我們的系統(tǒng)時,應(yīng)該工作的質(zhì)粒在土壤細(xì)菌的數(shù)目是大于50。2)該文獻(xiàn)表明,發(fā)生細(xì)胞溶解在holin等于1000個分子/細(xì)胞的濃度1,5,6 ,因此,我們用這樣的細(xì)胞裂解在我們的系統(tǒng)中的閾值濃度。3)由于所使用的結(jié)構(gòu)表征Pveg子去年包含一個突變中,我們假設(shè), 我們用于抗holin的啟動,Pveg2具有相同的強(qiáng)度,Pveg。基于這些假設(shè),野生型細(xì)菌細(xì)胞裂解的動力學(xué)模型,用普通的微分方程(ODEs)的holin表達(dá)和holin的蛋白質(zhì)(公式1)。在穩(wěn)定狀態(tài)(即 表達(dá)holin
49、 / DT = 0和d holin / DT = 0),重新整理式(1)holin = 1000,我們獲得了表達(dá)在所示為P holin K表holin的公式2。Holin抑制基因細(xì)菌在我們的細(xì)菌的基因組上的強(qiáng)度的啟動子和RBS控制表達(dá)的反holin應(yīng)該高于與holin一個單一的質(zhì)粒,例如,300的質(zhì)粒的拷貝(最大拷貝數(shù)在一個單一的細(xì)菌所產(chǎn)生的所有的holin )可以被抑制。在我們的系統(tǒng)中,抗-holin到holin結(jié)合形成二聚體,它被定義為失活的holin。由式(3)的機(jī)制,我們修改后的細(xì)菌。我們定義的啟動子和RBS強(qiáng)度的比率分別為抗-holin和holin為“m”,如公式4中看到。4)結(jié)果與
50、討論 通過改變比m的公式4中,我們發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)基因細(xì)菌holin濃度下降至零比米300(參見圖1)。然后,我們測試了米= 400與反holin啟動子(J23100),我們有與強(qiáng)度13.1皮克核糖核酸/分鐘/g的底物DNA,其結(jié)果是顯 示在圖2中。圖1:在轉(zhuǎn)基因細(xì)菌holin濃度與比m(米=(P 的抗holin 抗holin)/(P holin holin)。本圖顯示了細(xì)胞內(nèi)的濃度holin保持在零,如果m 300。(模型由英國倫敦帝國學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì))。圖2:在m = 400的不同蛋白物種隨時間的演變。所有的holin蛋白在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的抑制的holin濃度保持在所有的時間,而holin野生型細(xì)菌的濃度達(dá)到1000每單元后5000秒的模型由倫敦帝國學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì)。總之,基因后衛(wèi)的造型告訴他們,啟動子的強(qiáng)度和RBS holin和反holin的強(qiáng)度可任意選擇,只要他們的比率(即 P的反holin K表抗holin)/(holin K表holin的) 300),以使其一定,的比例值400被選擇為我們的項(xiàng)目。
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