結(jié)核分枝桿菌實驗室檢測方法

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1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,結(jié)核分枝桿菌實驗室檢測方法,分枝桿菌屬,一類細(xì)長略帶彎曲,有時呈分枝狀的桿菌,本屬細(xì)菌多具有抗酸性,又稱抗酸桿菌(,acid-fast bacillus,),細(xì)菌體內(nèi)含有分枝菌酸,細(xì)胞壁含有大量脂類,這與分枝桿菌的染色性、抵抗力和致病性等密切相關(guān)。,本屬細(xì)菌已經(jīng)被鑒定的有,70,多種,可分為三大類:,結(jié)核分枝桿菌、非典型分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌,;,按生長速度可分為三類,即緩慢生長菌、迅速生長菌和不能培養(yǎng)菌三種類型,結(jié)核分

2、枝桿菌群,結(jié)核分枝桿菌,是人和動物結(jié)核病的病原體,包括人結(jié)核分枝桿菌(,Mycobacterium tuberculosis,)、牛分支桿菌(,M.bovis,)、非洲分支桿菌(,M.africanum,)和田鼠分枝桿菌(,M.microti,),前三種對人類治病,其中人型結(jié)核分枝桿菌感染發(fā)病率最高。,結(jié)核分枝桿菌屬于緩慢生長分支桿菌,非典型分枝桿菌,偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌龜,/,膿腫、胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌、戈登分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶然分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、土分枝桿菌、草分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、海,-,潰瘍分枝桿菌、金色分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌等,偶

3、發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌龜亞種、龜分枝桿菌膿腫亞種屬于迅速生長型,雞蛋培養(yǎng)基上,3-5,天可見菌落,其他非典型分枝桿菌多為緩慢生長型,麻風(fēng)分枝桿菌,麻風(fēng)分枝桿菌(,M.leprae,)是麻風(fēng)病的病原體,也是抗酸桿菌,但較結(jié)核分枝桿菌,短而粗,兩端尖細(xì),,抗酸染色著色均勻,呈,束狀或團(tuán)狀,排列,結(jié)核分枝桿菌多散在,偶有聚集。為典型的胞內(nèi)寄生菌,有麻風(fēng)桿菌存在的細(xì)胞胞漿呈泡沫狀,稱麻風(fēng)細(xì)胞。,體外不能培養(yǎng)。,全球約有,1/3,的人口已經(jīng)感染結(jié)核分枝桿菌,有,2000,萬活動性肺結(jié)核患者,每年新發(fā)病例,900,萬人,每秒鐘有,1,人感染結(jié)核,每年有,300,萬人死于結(jié)核病。,隨著抗結(jié)核藥物的不斷發(fā)展和

4、衛(wèi)生生活狀況的改善,結(jié)核的發(fā)病率和死亡率曾一度大幅下降,20,世紀(jì),80,年代后,由于艾滋病和結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株的出現(xiàn)、免疫抑制劑的應(yīng)用、吸毒、貧困及人口流動等因素,全球范圍內(nèi)結(jié)核病的疫情驟然惡化,結(jié)核分枝桿菌,6,生物學(xué)形狀,結(jié)核分枝桿菌為,細(xì)長略帶彎曲的桿菌,,有時可見,分枝狀,無芽孢和鞭毛,因衰老或抗結(jié)核藥物的,作用可出現(xiàn)多形態(tài),如球狀、串珠狀或絲狀,,大小為,1,4X0.4m,。,細(xì)胞壁中含有大量脂質(zhì)而不易著色,特別是有,大量分枝菌酸包圍在肽聚糖層的外面,一般,用抗酸染色。,萋尼染色呈紅色,,背景為藍(lán)色,;,熒光染料金胺“,O”,染色,熒光顯微鏡下為橘黃色,培養(yǎng)特性,8,實驗室檢測方

5、法,萋尼染色,+,熒光染色,羅氏培養(yǎng),+,分枝桿菌快速培養(yǎng),抗原抗體檢測,細(xì)胞因子檢測,熒光定量,PCR,芯片雜交,病原學(xué),免疫學(xué),分子生物學(xué),涂片鏡檢,-,抗酸染色,抗酸染色是目前為止最快的結(jié)核檢出方法,可用來檢測病情進(jìn)展,為感染控制提供參考依據(jù),可確證培養(yǎng)物為陽性,萋尼染色法,紅色,普通顯微鏡(高倍),熒光染色,黃或橘色,熒光顯微鏡(低倍),聯(lián)染法:敏感性高,特異性好,速度快!,抗酸染色局限性,抗酸染色對分枝桿菌非特異,其他如,Nocardia,(奴卡)、,Rhodococcus,(紅球菌屬)、,Legionella micdadei,(軍團(tuán)菌)、,cryptosporidium,(隱孢子

6、蟲)、,Isospora,(等孢球蟲)等有抗酸菌特點,不能區(qū)分結(jié)核和非結(jié)核分枝桿菌,不能區(qū)分活菌和死菌,敏感性差,一般,1mL,痰中有,5000-10000,條菌時可檢出,而培養(yǎng)可檢出,10-100,條菌,.,發(fā)光二極管熒光顯微鏡(,LED,),熒光顯微鏡成本高、易損壞、耗電量大、光源壽命短、顯微鏡價格昂貴且需要在暗室內(nèi)工作等,熒光染色法一直沒有在結(jié)核病痰涂片診斷中得到廣泛的應(yīng)用。,只需將二極管替換普通光學(xué)顯微鏡的目鏡就相當(dāng)于一臺熒光顯微鏡,組裝的“熒光顯微鏡”結(jié)合金胺,O,染色在結(jié)核病痰涂片檢查中有一定的應(yīng)用價值。,田斌等,發(fā)光二極管熒光顯微鏡在基層實驗室診斷結(jié)核分枝桿菌的應(yīng)用評價,.,實用

7、預(yù)防醫(yī)學(xué),2012,年,10,月第,19,卷第,10,期,.,分枝桿菌培養(yǎng)技術(shù),結(jié)核菌培養(yǎng)仍是目前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)尤其是藥敏試驗結(jié)果在指導(dǎo)臨床用藥及耐藥性檢測等方面具有重要作用,是鑒定是否為活菌的可靠方法,1,、傳統(tǒng)的固態(tài)培養(yǎng)法,需要,4,6,周才能檢測到結(jié)核菌的生長而且陽性率也只有,30,-40,;特異性差各種分枝桿菌均可生長。要確定是否為結(jié)核菌需結(jié)合分枝桿菌菌種鑒定和藥物敏感性試驗。,2,、,分枝桿菌快速液體培養(yǎng)技術(shù),BD,公司推出的,BACTECMGIT 960,全自動分枝桿菌培養(yǎng),鑒定藥敏系統(tǒng),操作簡便,陽性標(biāo)本檢出時間平均為,9d,:鑒定、藥敏試驗時間平均為,4d,:陽性標(biāo)本檢出率比傳統(tǒng)

8、固體培養(yǎng)提高,10,左右,固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)優(yōu)缺點,固體培養(yǎng):污染少,易于進(jìn)行菌落形態(tài)觀察,但是培養(yǎng)時間長,液體培養(yǎng):菌體與培養(yǎng)基充分接觸,生長迅速,但易受到污染,血清學(xué)試驗,免疫學(xué)檢測方法,1,、結(jié)核菌素試驗,凡感染過結(jié)核桿菌的機(jī)體,會產(chǎn)生相應(yīng)的致敏淋巴細(xì)胞,具有對結(jié)核桿菌的識別能力,當(dāng)再次遇到通過皮膚注入的少量的結(jié)核菌素時,致敏 淋巴細(xì)胞受相同抗原再次刺激會在,48-72,小時內(nèi),產(chǎn)生局部炎癥反應(yīng),出現(xiàn)紅腫硬節(jié)即為陽性反應(yīng)。,對活動性結(jié)核的診斷靈敏度高達(dá),77,,,局限性:,假陰性:,小兒結(jié)核、老年人結(jié)核、免疫缺陷或免疫功能低下患者(如合并,HIV,感染、接受免疫抑制劑治療的患者,),假陽

9、性:,接種過卡介苗的人也會產(chǎn)生陽性反應(yīng),干擾素釋放試驗,被認(rèn)為是近十年來結(jié)核診斷史上取得的最重要成就,該檢測方法的原理是:結(jié)核感染后體內(nèi)長期存在抗原特異性的記憶性 細(xì)胞,當(dāng)再次遇到抗原刺激時,能迅速活化增值,釋放,干擾素。,目前市售兩種,,QFT-G,和,T-SPOT.TB,,比較兩種方法,,T-SPOT.TB,更靈敏但,QFT-G,更特異,但均優(yōu)于結(jié)核菌素試驗,同時也被推薦用于潛伏結(jié)核診斷。,分子生物學(xué)檢測方法,近年來核酸擴(kuò)增技術(shù)和雜交分析技術(shù)的發(fā)展,為分枝桿菌的檢測、鑒定和藥敏實驗提供了極大的方便,可將診斷時間從幾周降低到幾天。研究、應(yīng)用報道較多的結(jié)核病基因診斷技術(shù)主要包括聚合酶鏈反應(yīng),(

10、PCR),、核酸探針雜交、,DNA,序列測定、基因芯片、基因分型等。,MDR,早期診斷,分枝桿菌分子診斷系統(tǒng)(協(xié)和醫(yī)院),菌種鑒定,篩查、鑒別診斷,實時熒光,PCR,基因芯片快速檢測平臺,高 效: 一個樣本可,同時,檢測結(jié)核分枝桿菌和,NTM,快 速:,4,周(菌培),3,小時,靈 敏:,10,個菌,/,反應(yīng)(,TB,);,10,2,個菌,/,反應(yīng)(,NTM,),22,分枝桿菌核酸檢測,功能:,TB,快速篩查;,TB/NTM,鑒別診斷,高 效,:,同時檢測,17,種分枝桿菌(包括,TB,),快 速:,4,周(菌種鑒定),6,小時,靈 敏:,10,3,個菌,/,反應(yīng),檢測范圍,:結(jié)核、胞內(nèi)、鳥、

11、戈登、堪薩斯、偶然、瘰疬、淺黃、土、龜,-,膿腫、草、不產(chǎn)色、海,-,潰瘍、金色、蘇爾加、蟾蜍、恥垢。,23,分枝桿菌菌種鑒定(,DNA,微陣列芯片法),通 量:,兩個一線抗結(jié)核藥(,MDR,),速 度,:,8,周(藥敏),6,小時,靈敏度:,10,3,個菌,/,反應(yīng),基于,rpoB,(利福平)和,katG/inhA,(異煙肼),的基因突變,對,耐多藥結(jié)核病,做出快速診斷。,24,結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒,高會霞等,五種結(jié)核病實驗室檢測方法對結(jié)核病診斷價值的效果評價,.,實用檢驗醫(yī)師雜志,,2012,,,4,(,3,):,157-160.,五種結(jié)核檢測方法效果評價,結(jié)核組:,1260,例,非結(jié)核組:,100,例,改良羅氏培養(yǎng),熒光,PCR,涂片法,MGIT 960,快速培養(yǎng),結(jié)果比較,斑點層析法,敏感性、特異性比較,羅氏培養(yǎng)和快速培養(yǎng),快速培養(yǎng)和熒光PCR,總結(jié):,涂片簡單快速但陽性率較低、難以區(qū)分結(jié)核和非結(jié)核分枝桿菌,培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn),但需時較長,血清學(xué)試驗檢測結(jié)核抗原或抗體不太理想,干擾素釋放試驗?zāi)茌^好地為臨床服務(wù),熒光,PCR,檢測結(jié)核分枝桿菌具有較好的敏感性和特異性,可結(jié)合傳統(tǒng)方法綜合分析,Thank You!,

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