共焦顯微鏡剖析

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1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),樣品要求,原理,功能,在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用,The techniques and application of Confocal Laser Scanning Microscopy,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),人眼區(qū)分率：0.2mm,光學(xué)顯微鏡區(qū)分率：0.25mm,電子顯微鏡區(qū)分率：0.2nm,共焦顯微鏡區(qū)分率：0.18mm,二、原理,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),原理小結(jié):,Confocal 利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測器前的探測針孔實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明和點(diǎn)探測，

2、來自光源的光通過照明針孔放射出的光聚焦在樣品焦平面的某個(gè)點(diǎn)上，該點(diǎn)所放射的熒光成像在探測針孔上，該點(diǎn)以外的任何放射光均被探測針孔阻擋。照明針孔與探測針孔對被照射點(diǎn)或被探測點(diǎn)來說是共軛的，因此被探測點(diǎn)即共焦點(diǎn)，被探測點(diǎn)所在的平面即共焦平面。計(jì)算機(jī)以像點(diǎn)的方式將被探測點(diǎn)顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上，為了產(chǎn)生一幅完整的圖像，由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像。只要載物臺沿著Z軸上下移動(dòng)，將樣品新的一個(gè)層面移動(dòng)到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著Z軸的不斷移動(dòng)，就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像。,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),

3、激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)分,1.抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)分,2.具有更高的軸向區(qū)分率，并可獵取連續(xù)光學(xué)切片,conventional,confocal,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)分,3.增加側(cè)向區(qū)分率,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)分,4.由于點(diǎn)對點(diǎn)掃描去除了雜散光的影響,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),三.激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計(jì)特點(diǎn):,1.點(diǎn)照明,2.具有照明pinhole和探測pinhole,3.照明pinhole和探測pinhole共軛(共焦),共焦點(diǎn)即被探測點(diǎn)，被探

4、測點(diǎn)所在的平面為共焦平面,4.具有掃描系統(tǒng) 逐點(diǎn)掃描成像,5.具有多個(gè)四個(gè) 熒光通道，可同時(shí)探測多個(gè)被標(biāo)記物,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),技術(shù)指標(biāo)Leica TCS SP2):,1.xy區(qū)分率比傳統(tǒng)顯微鏡小1.4x,傳統(tǒng)顯微鏡:Rxy=0.61/NA 0.25 m),Confocal:Rxy=0.4/NA0.18 m),2.樣品的最大厚度:,取決于:物鏡的NA、物鏡的工作距離,激光的穿透力、樣品的透亮度,Z軸的最大移動(dòng)范圍(166m、Z-wide),3.樣品的最小光切厚度:(載物臺最小移動(dòng)距離為40nm,取決于:物鏡的NA、針孔大小,Z軸的最小移動(dòng)步距:40nm,Z軸的區(qū)分率:0.35 m,激光掃

5、描共焦顯微鏡技術(shù),4.激光器,Ar激光器:458nm,476nm,488nm,514nm,GreNe:543nm;HeNe:633nm,Ar激光器(UV):361nm,激光器的特點(diǎn):,1)方向性好:激光根本延直線傳播,2)單色性好:=10-8nm,3)高亮度:激光方向性好,其在空間上的能量分布是高度,集中的。,4)偏振性:激光為平面偏振光,光纖耦合,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),5.四個(gè)熒光通道,一個(gè)透射光通道,即除了可同時(shí)采集多標(biāo)記熒光圖像外,還可以同時(shí)采集透射光圖像,但透射光,圖像為,非共焦圖像,。,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),6.掃描速度:slow 220lines/s 512512 2-3秒,s

6、low2 440lines/s2：雙向掃描,medium 450lines/s 512512 1.7秒,medium2 900lines/s,fast 1000lines/s 512512 0.7秒,128128 0.2秒,fast2 2023lines/s,7.掃描密度:,6464,128128,512512,10241024,20482048,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用,The application of Confocal Laser Scanning Microscopy,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,功能.,1.多熒光標(biāo)記樣品的高清晰度、高區(qū)分率圖像采集,2.無損傷、連續(xù)光學(xué)切片，顯微“

7、CT”,3.真正的三維重組,4.假三維圖的顯示,5.可沿Z軸xy平面和Y軸xz平面方向進(jìn)展光切,6.定量分析,7.時(shí)間序列掃描:xyt、xyzt 和 xt 掃描,8.圖像處理,9.旋轉(zhuǎn)掃描,10.感興趣區(qū)域掃描,11.光譜掃描,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,應(yīng)用,定位、定量,三維重組,動(dòng)態(tài)測量,活細(xì)胞或組織內(nèi)游離Ca,2+,分布和濃度的變化,測量(Mg,2+,、Zn,+,、Na,+,、K,+,),自由基的檢測,藥物進(jìn)入細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過程、定位分布及定量,蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)位,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,活細(xì)胞內(nèi)H+濃度 pH值的測量,線粒體膜電位的測量,熒光漂白恢復(fù)FRAP的測量,籠鎖解籠鎖的測量,熒光能量共振轉(zhuǎn)移

8、FRET的測量,其他應(yīng)用,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,一、定位、定量,免疫熒光標(biāo)記單標(biāo)、雙標(biāo)或三 標(biāo)的定位、定量：如：細(xì)胞膜受體或抗原的分布，,微絲、微管的分布、兩種或三種蛋 白的共存與共定位、蛋白與細(xì)胞器的 共定位、核轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位和干細(xì)胞的 增值、分化,細(xì)胞凋亡:AnnexinV-fitc+PI,末端原位雜交-fitc+PI,熒光原位雜交：染色體基因定位,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,定位、定量爭論中常用熒光探針,1.Amine-Reactive Probes,與抗體耦聯(lián)、與配體耦聯(lián)、與肽耦聯(lián)、與人工合成的寡聚核苷酸耦聯(lián)的探針，可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標(biāo)記等,Green Red Fura-r

9、ed,FITC 494/518 TRITC 544/572 Cy5 650/690,(異硫氰基熒光素)(四甲基異硫氰基羅丹明),Alexa Fluor 488 488/530 PE 565/578,(藻紅蛋白),Texas Red 595/615,(德州紅),Cy3 558/568,BODIPY FL 503/512 BODIPY TMR 543/569 BODIPY TR,592/618,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,1)細(xì)胞外表抗原、胞內(nèi)某種蛋白,免役熒光標(biāo)記：與抗體耦聯(lián),直標(biāo):一抗+熒光探針,間標(biāo):二抗+熒光探針,如:微管蛋白tublin(抗 tublin抗體+熒光探針),肌動(dòng)蛋白actin(

10、Palloidine+熒光探針),2)細(xì)胞膜外表受體,配體+熒光探針,如:nAchR、mAchR、多巴胺受體(D1,D2),標(biāo)記 Gm1:霍亂毒素受體,霍亂毒素+FITC,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,2.標(biāo)記細(xì)胞器熒光探針,1)線粒體 Mitochondria,Rodamin 123 505/534，可染活細(xì)胞，陽離子,可檢,測線粒體膜電位,且在多數(shù)細(xì)胞中停留,時(shí)間短,JC1 線粒體膜電位低時(shí)為單體 490/527 發(fā)綠光,線粒體膜電位高時(shí)為多聚體 490/590 發(fā)紅光,可標(biāo)記活細(xì)胞線粒體，且為檢測線粒體膜電位最,佳探針,Mitotracker Green FM 490/516,染活細(xì)胞或固定細(xì)

11、胞,穩(wěn)定不漏出,Mitotracker Orange CMTMRos 551/576,(氧化型),Mitotracker Orange 復(fù)原型,只能染活細(xì)胞,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,2)溶酶體 Lysosome,中性紅 541/640:微偏堿性,可標(biāo)記溶酶體等酸官,為非特異性,AO:,LysoTracker Green DND-26 504/511,染活細(xì)胞,LysoTracker Blue,LysoTracker Red,3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Endoplasmic Reticulum,DiOC6 484/500:非特異性,較高濃度標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng),較低濃度標(biāo)記線粒體,4)高爾基體 Golgi appara

12、tus,NBD C6-ceramie 466/536,可染活或死細(xì)胞,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,細(xì)胞器的單克隆抗體,5)細(xì)胞核,PI propidium iodide 536/617 DNA/RNA 死細(xì)胞,碘化丙啶,EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死細(xì)胞,Hochest 33342,352/,461 DNA A-T,活細(xì)胞,Hochest 33258,352/,461 DNA A-T,活細(xì)胞,DAPI,358,/461 DNA A-T 半通透細(xì)胞,Chromomycin A3 450/470 DNA G-C,AO 500/526 DNA 活細(xì)胞,560/

13、650 RNA,TOTO-1 514/533 DNA 死細(xì)胞,SYTO1116 2024 488/520 活細(xì)胞,SYTO1116 2024 521/556,活細(xì)胞,SYTO 17 621/634 活細(xì)胞,3.GFP 綠色熒光蛋白,GFP的的覺察：60年月，Shimomura等首先從水母中分別出一種水母發(fā)光蛋白(aequoren)，該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)生藍(lán)色熒光。然而水母整體幾提取的顆粒都呈綠色，后經(jīng)證明在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白 GFP,后經(jīng)爭論說明，在水母體內(nèi)Ca2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后，水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍(lán)色熒光，GFP在藍(lán)光的激發(fā)下，產(chǎn)生綠色熒光。,將

14、外源基因與GFP DNA 相連,GFP可作為外源基因的報(bào)告基因?qū)崟r(shí)監(jiān)測外源基因的表達(dá).,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,GFP主要應(yīng)用:,對活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)展準(zhǔn)確定位及動(dòng)態(tài)觀看,可實(shí)時(shí)原位跟蹤特定蛋白在細(xì)胞生長、分裂、分化過程中或外界刺激因子的作用下的時(shí)空表達(dá),如某種轉(zhuǎn)錄因子的核轉(zhuǎn)位、蛋白激酶C的膜轉(zhuǎn)位等。,GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉(zhuǎn)染細(xì)胞,可動(dòng)態(tài)觀看 該分泌蛋白分泌到細(xì)胞外的過程,GFP基因與定位于某一細(xì)胞器特殊蛋白基因相連,就能顯 示活細(xì)胞中細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細(xì)胞器的構(gòu)造及病理過程,可用于觀看分子的運(yùn)動(dòng)FRAP,蛋白之間的相互作用FRET,激光掃描共

15、焦顯微鏡應(yīng)用,三.動(dòng)態(tài)測量,Physiology:細(xì)胞內(nèi)離子動(dòng)態(tài)變化測量,1).游離Ca2+測量,檢測游離Ca2+變化熒光探針的原理：這類探針多為Ca2+螯合劑，不與Ca2+結(jié)合時(shí)不發(fā)熒光，通常也不能進(jìn)入細(xì)胞膜，只有與乙酰甲酯AM相連方可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解后并與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后發(fā)出熒光。Kd值為Ca2+解離常數(shù)，說明檢測Ca2+濃度的范圍:0.1xKd-10 xkd,Kd和很多因素有關(guān)，如pH、Mg2+、與蛋白的結(jié)合、溫度等。細(xì)胞內(nèi)生理Ca2+濃度值(10-100n M)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載濃度值根底Ca2+濃度的10倍左右,熒光探針 激發(fā)波長放射波長 Kd,FLuo3-AM,K+,

16、dextran 506nm 525nm 390nM,Fluo4 506nm 525nm,Calcium Green-1 507nm 530nm 190nM,Calcium Green-2 507nm 535nm 550nM,Fura red 420/480nm 637nm 140nM,Oregon Green 488 494nm520nm 20,000nM,Calcium Crimson 583nm 602nm 328nM,Indo-1 356nm 405/458nm 230nM,Fura-2 340/380 476nm 145nM,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,程序化測量：用timelapse中的編程按鈕可進(jìn)展不同時(shí)間序列的掃描測 量。,F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG),Ca2+濃度確定測量,1單波長公式法,Fluo3:530nm Kd=450nM,Ca2+I=Kd(F-Fmin)/(Fmax-F),Fmin:細(xì)胞內(nèi)無鈣時(shí)的熒光強(qiáng)度(MnCl2),Fmax：細(xì)胞內(nèi)鈣飽和時(shí)的熒光強(qiáng)度(A23187),測量時(shí)切記細(xì)胞內(nèi)靜息Ca2+濃度的相對熒光強(qiáng)度值不能太低F值不低于40,激