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1、全內(nèi)反射熒光顯微鏡 醫(yī)學(xué)實驗 05級 張園 鄭雪飛 宋一萌 解依荻 發(fā)展歷史 優(yōu)勢應(yīng)用 分型及結(jié)構(gòu) 基本原理 發(fā)展與展望 發(fā)展歷史 熒光顯微鏡的概念 全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)的發(fā)展歷程 細胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射 后可發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但 如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射 亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對這類物質(zhì)進行定性 和定量研究的工具之一。 發(fā)展歷史 熒光顯微鏡的概念 在細胞生物學(xué)方面，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡始終不能解決生物樣本顯 微中的幾個重要問題： 1.顯微圖像的 信噪比 不高； 2.光源對生物樣本照射的損傷； 3.光學(xué)衍射所致的 分辨極限 （ R 0. 6
2、1/nsin ）： 傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡由于受到 光瞳遠場衍射效應(yīng) 的影響 , 存在分辨極限 ,瑞利將之歸納為 R 0. 61/nsin(u/2) ,其中 R為分辨 力 , 為成像光波波長 , nsin(u/2)為物透鏡的 數(shù)值孔徑 ,即 NA 值， u為 孔徑角 ,因此光學(xué)顯微鏡空間分辨極限 250 nm。 發(fā)展歷史 全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)的發(fā)展歷程 近年來人們開發(fā)出了一系列光學(xué)顯微鏡。 其中， 全內(nèi)反射熒光顯微術(shù) (Total internal reflection fluorescence microscopy ,TIRFM)是 近年來新興的一種光學(xué)成像技術(shù)。 全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)的發(fā)展歷程 Hi
3、rsch field 完成了 第一個 全內(nèi)反射 熒光實驗 1965年 Axelrod等生物物理 學(xué)家對 TRIFM技術(shù) 及基本原理進行描 述，并探索了其生 物應(yīng)用。 20 世 紀 80年代早期 20 世 紀 90年代 新型物鏡透鏡、聚光 鏡和超靈敏探測器的 出現(xiàn)，使 TRIFM技術(shù) 得到充分發(fā)展。 1995年 Yanagida小 組用 TIRFM技 術(shù)首次在液體 溶液中得到了 熒光標記的單 個蛋白質(zhì)分子 的成像。 這是首次嘗試用全內(nèi)反射熒光 法測液體中的單個分子的熒光。 將全反射理論與生物細胞的熒 光成像技術(shù)相結(jié)合是一種全新 的突破。 肌球蛋白酶活性測量，肌收縮力的產(chǎn)生， 熒光標記驅(qū)動蛋白動態(tài)
4、研究。 1996年 Moerner小組 又用這項技術(shù) 實現(xiàn)了限制在 丙烯酰胺膠體 的納米孔中的 單分子的三維 成像。 基本原理 全內(nèi)反射熒光顯微鏡 的基本設(shè)計思路 全內(nèi)反射熒光顯微鏡 的基本原理 全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)是利用全內(nèi)反射產(chǎn)生的消逝波 激發(fā)樣品 ,從而使樣品表面數(shù)百納米厚的薄層內(nèi)的熒光團受 到激發(fā) ,熒光成像的信噪比大大提高?？梢钥吹綐悠繁砻妫?單分子的活動情況。這種方法的成像裝置簡單，極易和其 它成像技術(shù)、探測技術(shù)相結(jié)合，目前已成功的實現(xiàn) 100nm 甚至更低的空間分辨率。 基本原理 全內(nèi)反射熒光顯微鏡 的基本設(shè)計思路 全內(nèi)反射熒光顯微鏡 的基本原理 熒光激發(fā)原理 snell定律 :
5、n1sin 1=n2 sin 2 當 n1大于 n2時，全反射就可能發(fā)生 : 2=90 c=sin-1(n2/n1) 即所有的入射光線全部反射出來 ,稱為全內(nèi)反射 熒光激發(fā)原理 沿著入射面上的介質(zhì)邊界傳播 在平行界面方向以平行波場方式傳播 在垂直界面方向則是呈指數(shù)衰減。 隱失波的強度 -深度圖 熒光激發(fā)原理 非均勻波 透射強度和浸透深度公式 T12（ i） - 分界面處的透射強度 d 12 - 滲透深度 i - 入射角 - 入射光波長 對于可見光波長 380 780nm而言， 浸透深度為 100nm。 熒光激發(fā)原理 箭頭 表示激光的方向，激光被全反射，同時產(chǎn)生在 z方向成指數(shù)衰減的隱失波。 黃
6、色小圓點 表示被隱失波激發(fā)的熒光分子， 白色小圓點 表示未被激發(fā)的熒光分子。 CCD相機 CCD相機的 高靈敏度 特點使 全內(nèi)反射熒光顯微鏡利用消逝波照 射樣品并使其成像成為可能，也成 就了其高信噪比。 CCD相機的 快速成像 特點提 高了其時間分辨率，使得觀察單分 子的運動、細胞物質(zhì)的分泌、蛋白 質(zhì)的相互作用成為可能并成為這方 面的優(yōu)勢觀察儀器。 目前使用 CCD 探測 , 可達到的量子產(chǎn)率 已到 80 % ,成像 速率 200 Hz. 當對活細胞 成像時 ,為了 達到單分子 級的靈敏度 或是為了減 少曝光時間 , 需要采用圖 像增強器。 全內(nèi)反射顯微鏡的分型及其結(jié)構(gòu) 全內(nèi)反射熒光顯微鏡根據(jù)
7、其成像系統(tǒng)的不 同可分為棱鏡型和物鏡型兩種類型 兩種類型的全內(nèi)反射熒光顯微鏡成像系統(tǒng)， 1）為棱鏡型， 2）為物鏡型。 （一）棱鏡型全內(nèi)反射熒光顯微鏡 利用激光經(jīng)過棱鏡并產(chǎn)生 全內(nèi)反射 ，其消逝 波照射已被熒光標記的生物樣品，其激發(fā)光 從另一側(cè)進入物鏡并被 CCD相機捕捉。 棱鏡型全內(nèi)反射熒光顯微鏡光路示意圖 評價 棱鏡型系統(tǒng)在實現(xiàn)上更加容易，它只需要激光 光源、棱鏡和顯微鏡。 在探測上，它也不容易受到入射光信號的干擾。 放置樣品的空間受到棱鏡的限制。 （二）物鏡型全內(nèi)反射顯微鏡 收集樣品熒光信號的接收器 顯微鏡的物鏡 發(fā)生全內(nèi)反射的光學(xué)器件。 由于細胞的典型折射率為 1. 33 1. 38
8、, 因此要想實現(xiàn)全內(nèi)反射 ,物鏡的 NA 必須大 于 1. 38 。表達式為： NA = nsin（ u/2） nsin（ u/2） nsinc NA 為物鏡的數(shù)值孔徑 , n ,u分別為物鏡的 折射率 (浸沒油 ) 和孔徑角。 c 為發(fā)生全 反射的臨界角。 二者比較 棱鏡型全內(nèi)反 射熒光顯微鏡 物鏡型全內(nèi)反射熒光顯微鏡 05級醫(yī)學(xué)實驗 宋一萌 90513111 全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)利用全內(nèi)反射產(chǎn)生 的消逝波激發(fā)樣品，由于消逝波強度成指 數(shù)衰減，使激發(fā)區(qū)域限定在樣品表面的一 薄層范圍內(nèi)，因此具有其它光學(xué)成像技術(shù) 無法比擬的高信噪比。 當今世界上研究單分子科學(xué)最具前途的新 型生物光學(xué)顯微技術(shù)之一
9、 可用來實現(xiàn)對單個熒光分子的直接探測。 全內(nèi)反射熒光顯微鏡里用 消 逝波 作為樣品的激發(fā)光源， 并用有著高靈敏度和高時間 分辨率的 CCD相機 (成像速率 200Hz)捕捉樣品熒光，因此 具有如下優(yōu)點： 1：信噪比高（相對共聚焦顯微鏡） 2：分辨率高（相對其他的光學(xué)顯微鏡） 3：對生物樣本損傷?。ㄏ鄬﹄婄R）可 以進行活體物質(zhì)的研究和單分子的動 態(tài)研究。 全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)正是憑借其獨特的優(yōu) 勢 (它的熒光激發(fā)深度只在 100 nm 的薄 層范圍內(nèi) ),從而成為研究 細胞表面科學(xué) 如生 物化學(xué)動力學(xué)、單分子動力學(xué)的最有前途 的光學(xué)成像技術(shù)。 全內(nèi)反射熒光顯微成像法不再采用掃描成 像 ,大大提高了
10、成像速度 ,可以滿足實時成像 的要求 ;另一方面它的圖像解釋相對于近場 , 干涉顯微成像來說也較簡單。 現(xiàn)在全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)已被廣泛用于 實時觀察單個肌漿球蛋白分子的運動 單個蛋白分子對之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移 ( FRET) ATP 酶的翻轉(zhuǎn) 聚合物內(nèi)單個分子的結(jié)構(gòu)變化 生物質(zhì)膜附近的神經(jīng)分泌腺的顆粒運動 全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)的發(fā)展一方面會 在加強傳統(tǒng)優(yōu)勢的基礎(chǔ)上，即 動態(tài) 觀 察生物大分子的結(jié)構(gòu)、相互作用、物 質(zhì)的分泌，同時在不斷的改進物鏡和 CCD相機的性能基礎(chǔ)上進一步同其他 儀器的結(jié)合，更多的用在生物細胞活 體方面的研究。 1. 全內(nèi)反射熒光顯微術(shù) 在生物單分子科學(xué)中的應(yīng)用 單分子熒光探
11、測主要有三個問題： （ 1）單分子發(fā)出的熒光信號通常是很 微弱 的，所以要尋找一個足夠靈敏的探測器。 （ 2）由于拉曼散射，瑞利散射和雜質(zhì)熒光 等產(chǎn)生的背景光，極大的 干擾 了信號光的 探測。所以應(yīng)該盡量降低背景激發(fā)光。 （ 3）本體溶液產(chǎn)生的焦點熒光之外的 背景 光 。 這些問題都可以利用全內(nèi)反射熒光顯微成 像系統(tǒng)來解決 全內(nèi)反射熒光顯微鏡可以直接對細胞表面的 過程進行觀測，而不受到來自細胞內(nèi)深層 區(qū)域信號的干擾。 全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)是研究細胞表面科學(xué) 如生物化學(xué)動力學(xué)、單分子動力學(xué)的最有 前途的光學(xué)成像技術(shù) 利用物鏡型全內(nèi)反射熒光顯微鏡觀察活細胞表面示意圖。 單個的生物大分子的熒光分子特征
12、和動態(tài) 構(gòu)像變化要運用到 棱鏡型 的全內(nèi)反射熒光 顯微術(shù)。 如用環(huán)境敏感熒光基團標記的肌球蛋白， 然后用分光鏡檢測。肌球蛋白分子上熒光 基團發(fā)出的熒光光譜隨著時間的起伏現(xiàn)象， 說明了自發(fā)的肌球蛋白單分子構(gòu)像改變。 2.蛋白分子相互作用 通過熒光標記的分子共同定位運用全內(nèi)反 射熒光顯微鏡對分子間相互作用可以直接 觀察，熒光共聚焦能量轉(zhuǎn)移也能夠檢測到。 分子伴侶蛋白 GroEL和伴侶輔助分子 (co- chaperon)GroES或者其底物乳球蛋白的相 互作用已經(jīng)在單分子水平進行了很好的研 究。 單配對熒光共聚焦也可以用在單分子水平 生物大分子相互作用的成像。 3.離子通道研究 離子通道通過負責(zé)神
13、經(jīng)，肌肉興奮性細胞的質(zhì)膜 調(diào)節(jié)離子電流和電化學(xué)勢。 單分子水平通道電流記錄可以通過使用膜片鉗方 法來檢測各種通道的電特性。 目前，已經(jīng)發(fā)展了一種同時可以測電流和熒光信 號的實驗系統(tǒng)。熒光標記的離子通道蛋白包埋到 平面脂雙層中，然后用物鏡型全內(nèi)反射熒光顯微 鏡觀察。利用全內(nèi)反射熒光顯微鏡結(jié)合后來發(fā)展 的熒光共振能量轉(zhuǎn)移或者雙視角的光鏡可以看到 離子通道與其配基或者調(diào)節(jié)子之間的相互作用， 同時可以在體內(nèi)跟蹤構(gòu)像變化與離子電流。 4.吸附 用于 DNA大分子在液 -液、固 -液界面的單分 子吸附行為 。 全內(nèi)反射熒光顯微鏡下拍到 的位于表面的 Actin-YFP和 Tubulin-YFP蛋白分子圖
14、分別在全內(nèi)反射熒光顯微鏡下（左）和 一般熒光顯微鏡（右）拍到的 Dil-stainedneuron,細 胞。 全內(nèi)反射熒光顯微鏡（ TIRFM）是研究 緊貼固體 平面支撐物的細胞膜 的技術(shù)，但是正因為膜與固 體支撐物具有相互作用，以及消逝波強度的指數(shù) 性下降而導(dǎo)致單分子信號的指數(shù)性下降，使得對 結(jié)果的解釋具有一定的困難性。 因此將全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)與其它的顯微成像技 術(shù)相結(jié)合來研究將是未來發(fā)展的一個新的方向。 The application of the total internal reflection fluorescence microscopy 解依荻 全內(nèi)反射應(yīng)用的核心問題 全內(nèi)反射
15、應(yīng)用的核心問題是 制作與電子顯微術(shù)（ EM）切 片尺寸相當?shù)墓鈱W(xué)切片。 共焦技術(shù) VS.全內(nèi)反射技術(shù) 共焦技術(shù)：單光子或雙光子的共焦系統(tǒng)層析深 度分別為 500 800nm。 全內(nèi)反射顯微術(shù) : 典型的垂直照明深度 100nm。 結(jié)論：薄的光學(xué)層析層切片信噪比強； 細胞的光損傷和光漂白影響也很小。 全內(nèi)反射的應(yīng)用 在生物單分子研究中的應(yīng)用 直接觀察細胞表面的生命活動 ,而不受細胞深層區(qū)域信 號的干擾 . 全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)的熒光激發(fā)深度只在 200 的薄層范圍內(nèi) ,從而成為研究細胞表面科學(xué)如生物化學(xué) 動力學(xué)、單分子動力學(xué)的最有前途的光學(xué)成像技術(shù)。 全內(nèi)反射的應(yīng)用比較 與其他生物單分子研究技術(shù)的
16、比較 全內(nèi)反射熒光顯微鏡（ TIRFM） 共聚焦激光掃描顯微鏡（ CLSM） 雙光子激光掃描顯微鏡（ TPLSM） 全內(nèi)反射的應(yīng)用比較 全內(nèi)反射熒光顯微鏡（ TIRFM） 全內(nèi)角反射熒光顯微鏡（ total internal reflection fluorescence microscope， TIRFM），利用光線全 反射后在介質(zhì)另一面產(chǎn)生衰逝波的特性，激發(fā)熒光分 子以觀察熒光標定樣品的極薄區(qū)域，觀測的動態(tài)范圍 通常在 200 nm以下。因為激發(fā)光呈指數(shù)衰減的特性， 只有極靠近全反射面的樣本區(qū)域會產(chǎn)生熒光反射，大 大降低了背景光噪聲干擾觀測標的，故此項技術(shù)廣泛 應(yīng)用于細胞表面物質(zhì)的動態(tài)觀察
17、。 全內(nèi)反射的應(yīng)用比較 共聚焦激光掃描顯微鏡（ CLSM） 和 雙光子激光掃描顯 微鏡（ TPLSM） 則是可以檢測細胞質(zhì)內(nèi)熒光的技術(shù)。 CLSM的重要優(yōu)勢在于，它提供了僅從單光學(xué)薄層收集 光波的可能性。與聚焦平面共軛的針孔定位（即共焦） 可避免來自檢測器之外的光，即從聚焦平面以外的其它 地方反射 /發(fā)射過來的光。但是這個光學(xué)薄層的厚度大 約為 500-800nm，要大于全內(nèi)反射熒光顯微鏡的光學(xué)薄 層的厚度（ 200nm）。 TPLSM對生物系統(tǒng)和體內(nèi)細胞性質(zhì)具有高的分辨率，如 細胞器，細胞連接，細胞內(nèi)鈣離子濃度，細胞膜流動性。 生物單分子熒光檢測技術(shù)的比較 共聚焦激光掃描顯微 （ CLSM）
18、 雙光子激光掃描顯微 鏡（ TPLSM） 全內(nèi)反射熒光顯微 鏡（ TIRFM） 共同點 檢測細胞熒光物質(zhì)的技術(shù) 空間分辨熒光分析技術(shù) 區(qū)別點 CLSM提供了僅從單 光學(xué)薄層收集光波的 可能性。與聚焦平面 共軛的針孔定位（即 共焦）可避免來自檢 測器之外的光，即從 聚焦平面以外的其它 地方反射 /發(fā)射過來 的光。 不要求高于衍 射極限的分辨率 TPLSM對生物系統(tǒng)和 體內(nèi)細胞性質(zhì)具有高 的分辨率。 雙光子激 發(fā) 能 探索活細胞內(nèi)各 種分子的實時動態(tài)， 能實現(xiàn)在樣品中的高 度精確定位。 減少了 光損傷，特別對需要 條件溫和的生物體系 有利 TIRFM具有高度的 界面（表面）特異 性，可有效排除本
19、體干擾，獲取界面 信息。 縱向分辨力 極高，特別適用于 表面或界面單分子 的測定。 全內(nèi)反射 熒光法相對簡單， 費用低廉 。 表面 或界面單分子的測 定 展望前景 不論是對物理成像學(xué)家還是對細胞生物 學(xué)家而言，全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)均是一 項新的技術(shù)。它的未來發(fā)展將是怎樣的 呢？ 它將向著兩個前沿方向發(fā)展：技術(shù)上的進一步創(chuàng)新和在新的細胞 生命科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。這意味著在一方面全內(nèi)反射熒光顯微術(shù) 將繼續(xù)和其它的顯微成像技術(shù)，如熒光相關(guān)光譜技術(shù)，熒光壽命 成像技術(shù)以及原子力顯微術(shù)相結(jié)合；另一方面，繼續(xù)尋求成像原 理上的突破，這也正是目前有待積極探索的課題。 全內(nèi)反射熒光顯微鏡的改進 1. 光電探測設(shè)備
20、探測效率和探測速度的提高 新型的物鏡透鏡、聚光器和其它材料的引入 2. 單分子染色技術(shù)的發(fā)展 新型的物鏡透鏡、聚光器和其它 材料的引入 超高的信噪比，能夠得到完美的 圖像 嶄新的 UIS2物鏡的信噪比優(yōu)越，高于現(xiàn)有物鏡 50%。這種物鏡的新特性還包括精選了低自發(fā)熒 光玻璃（通過全反射鍍膜和連接材料，顯著減少 了自發(fā)熒光），提高了數(shù)值孔徑，增強了信號亮 度。 UIS2系統(tǒng)在弱激發(fā)光下，能夠有效探測極 弱熒光，從而建立了活細胞熒光成像的新標準。 新型的物鏡透鏡、聚光器和其它 材料的引入 擁有更寬波長范圍內(nèi)的高透過率 內(nèi)置物鏡采用 UW多層鍍膜技術(shù)，能有效消除超寬 譜帶上的反射，在可見光到近紅外光的
21、波長范圍 內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)平坦的高透過率，在近紅外和紫外范 圍內(nèi)的透過率顯著提高。提高較寬波長范圍內(nèi)的 性能使它非常適合當今最需要的研究用途。 新型的物鏡透鏡、聚光器和其它 材料的引入 有效消除直到近紅外范圍的色差 杰出的超級復(fù)消色差特點有效地消除了從可見光譜直 到 1000nm范圍內(nèi)的色差 , 意味著從紫外到紅外范圍內(nèi) 的成像都可以只用一個物鏡實現(xiàn)。這一系列物鏡在使 用覆蓋很寬譜帶的熒光進行多色觀察時，可以獲得出 色的清晰圖像而不產(chǎn)生顏色偏移。 新型的物鏡透鏡、聚光器和其它 材料的引入 雙層多光口設(shè)計保證了輸入 /輸出靈活性 新型的物鏡透鏡、聚光器和其它 材料的引入 后上光口 后上光口不改變載物臺
22、高度，所以不影響鏡架穩(wěn)定性 這一光口可做光路輸入口，可裝一個附加熒光照明器 右側(cè)光口 右側(cè)光口裝置（ IX2-RSPC-2:可選件，視場數(shù)： 16）帶有一 個結(jié)像透鏡，可以安裝一個 C型接口 CCD照相機。 后下光口 能夠安裝冷 CCD DP30BW與同類設(shè)備。 左側(cè)光口 在這一光口上，原始圖像平面距顯微鏡鏡架 102mm，具有很 大的靈活性，用以安裝濾色鏡轉(zhuǎn)盤或者超低 0.25X或 5X照相 機適配器。 與雙光口視頻適配器結(jié)合，能夠獲得兩個原始圖像。（可選 件） 底光口 使用 IX2-TVR （ T型接口），獲得原始圖像。 新型的物鏡透鏡、聚光器和其它 材料的引入 提高了近紅外透過率 IX2
23、系列采用 UIS2 光學(xué)系統(tǒng)，提高了側(cè)光口、 后光口和底光口的紅外透過率，能夠提供多方 面的高性能，以適應(yīng)未來研究的需要。 展望前景 雙色和多色全內(nèi)反射熒光激發(fā)在國際上剛嶄露頭角。 在生物學(xué)的應(yīng)用上 ,由于全內(nèi)反射熒光成像的獨特優(yōu)勢， 它將成為細胞基底接觸區(qū)域內(nèi)的豐富的細胞生命活動， 如細胞膜內(nèi)蛋白質(zhì)的動力學(xué)過程，基底附近的細胞骨 架，細胞運動等最強有力的探測方法。 如細胞膜內(nèi)蛋 白質(zhì)的動力學(xué)過程，基底附近的細胞骨架，細胞運動 等。 我們有理由相信隨著光電探測設(shè)備探測效率和探測速 度的提高以及單分子染色技術(shù)的發(fā)展，全內(nèi)反射熒光 成像技術(shù)將越來越生動的把細胞內(nèi)的生物世界展現(xiàn)在 我們面前。 http:/
全內(nèi)反射熒光顯微鏡
