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1、大黃素對(duì)白蛋白誘導(dǎo)人腎小管 上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響 主講:房向東 The effect of Emodin on the human renal tubular epithelial to mesenchymal transition induced by albumin 研究背景 1 技術(shù)路線與方法 2 結(jié) 果 3 討 論 4 結(jié) 論 5 概 要 蛋白尿不僅僅是腎臟損傷的生物學(xué)標(biāo)志,還 是加速腎臟疾病向終末期腎衰進(jìn)展的主要 危險(xiǎn)因素之一。 研究背景 腎臟損傷 蛋白尿 臨床表現(xiàn) 反作用 物理?yè)p傷 誘導(dǎo)化學(xué)趨化因子、炎癥因子 激活補(bǔ)體 促進(jìn)細(xì)胞凋亡 損 傷 及 加 速 纖 維 化 機(jī) 制 1、正常
2、腎單位的丟 失和腎結(jié)構(gòu)的破壞 2、成纖維細(xì)胞及肌成 纖維細(xì)胞的大量增生 3、細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生 和積聚 病理變化 腎臟纖維化 研究背景 腎間 質(zhì)纖 維化 腎小 球硬 化 腎間質(zhì)纖維化是關(guān)鍵! 間質(zhì)纖維化的程度更能預(yù)測(cè) 腎功能的變化! 研究背景 腎小管上皮細(xì)胞 -肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化( TEMT) 在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用,它 被定義為 腎小管上皮細(xì)胞丟失了上皮表型,而獲得 新的肌成纖維細(xì)胞特征的過(guò)程 。 研究背景 轉(zhuǎn)分化 ECM ECM ECM 上皮細(xì)胞 肌成纖維細(xì)胞 化學(xué)名: 3-甲基 -1, 3, 8-三羥基蒽醌 大黃素 傳統(tǒng)的生物學(xué) 作用:抗菌消 炎、抗腫瘤、 免疫抑制、保
3、肝、 護(hù)腎 研究背景 保護(hù)腎臟作用: 清除氧自由基及 炎癥因子、抗細(xì) 胞增殖、促細(xì)胞 外基質(zhì)降解、阻 滯 TEMT 體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)大黃素可延緩糖尿病腎病、 梗阻性腎病等腎臟纖維化發(fā)生,其中阻滯 TEMT過(guò)程發(fā)揮重要地位。 研究背景 研究目的 白蛋白能否誘導(dǎo) HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)發(fā)生轉(zhuǎn)分化過(guò)程 、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成 大黃素對(duì)白蛋白產(chǎn)生的上述過(guò)程是否產(chǎn)生影響 技術(shù)路線與分組 空白對(duì)照組 大黃素對(duì)照組 大黃素干預(yù)組 白蛋白誘導(dǎo)組 HK-2細(xì)胞 無(wú)處理因素 20g/ml大黃 素作用 0、 12、 24、 48h 5mg/ml白蛋白 刺激時(shí)同時(shí)加入 20g/ml 大黃素作用 0、 12、 24、 48h 觀察
4、各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,收集細(xì)胞總 RNA半定量檢測(cè) -SMA、 E-cadherin、 FNmRNA的表達(dá) 5mg/ml白蛋 白作用 0、 12、 24、 48h 各組 實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次,所有數(shù)據(jù)以 x s表示,行 方差齊性檢驗(yàn) ,多 組間 計(jì)量資料 采用單因素 方差分析 用 SPSS12.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理 以 P 0.05為有顯著性差異 , P 0.01有非常 顯著性差異 RT-PCR 正常 HK-2細(xì)胞僅表達(dá)少量的 -SMA、 FNmRNA, 而 E-cadherinmRNA的表達(dá)較強(qiáng)。 E-cadherin -SMA FN M 0 12 24 48h 大黃素對(duì)照組上述因子的表達(dá) 與正常對(duì)
5、照組無(wú)差異 結(jié) 果 白蛋白誘導(dǎo) HK-2細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及大黃素干預(yù)后的效果 白蛋白可誘導(dǎo) HK-2細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化,即 E-CadherinmRNA的表達(dá)下調(diào), -SMAmRNA的表達(dá)上調(diào),與 0h比較, 12h后即有差異, 48h后差異顯著, p 0.01。而同時(shí)加入 20g/ml大黃素作用后,其變化趨勢(shì)明顯減弱。 -SMA 白蛋白誘導(dǎo) 大黃素干預(yù) M 0 12 24 48h 0 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 1 1 . 2 0h 12h 24h 48h 白蛋白誘導(dǎo) 大黃素干預(yù) 結(jié) 果 白蛋白誘導(dǎo) HK-2細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及大黃素干預(yù)后的效果 E-cadherin 大黃素干預(yù) 白
6、蛋白誘導(dǎo) M 0 12 24 48h M 0 12 24 48h 0 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 1 1 . 2 0h 12h 24h 48h 白蛋白誘導(dǎo) 大黃素干預(yù) 白蛋白誘導(dǎo) HK-2細(xì)胞分泌纖維連接蛋白( FN)的情況及 大黃素干預(yù)后的效果 FN的表達(dá)隨白蛋白刺激時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增多,在大黃素干預(yù) 后其表達(dá)上調(diào)趨勢(shì)亦明顯減緩。 FN 白蛋白誘導(dǎo) 大黃素干預(yù) M 0 12 24 48h 0 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 1 1 . 2 0h 12h 24h 48h 白蛋白誘導(dǎo) 大黃素干預(yù) 討 論 蛋白尿與腎小管間質(zhì)損傷 蛋白尿的水平反映了腎小球損傷的程度
7、 MDRD試驗(yàn) 把蛋白尿基礎(chǔ)排出量作為獨(dú)立的危險(xiǎn)因素納入 加速慢性腎臟病進(jìn)展的研究 臨床研究發(fā)現(xiàn) CKD患者在應(yīng)用 ACEI、 ARB類(lèi)藥物可非依賴(lài) 降壓作用減少尿蛋白量的排泄而延緩慢性腎臟病惡化速度 降尿蛋白和延緩 GFR下降之間有著緊密的聯(lián)系,蛋白尿的程 度對(duì) CKD預(yù)后具有很強(qiáng)的預(yù)測(cè)價(jià)值 。 討 論 蛋白尿與腎小管間質(zhì)損傷 我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn), 5mg/ml人純化白蛋白刺激 HK-2細(xì)胞一段時(shí)間內(nèi)后,上皮細(xì)胞表型標(biāo)志物 E- cadherinmRNA表達(dá)下調(diào),肌成纖維細(xì)胞表型物 - SMAmRNA表達(dá)上調(diào),且隨白蛋白作用時(shí)間的延長(zhǎng) 表達(dá)水平逐漸增強(qiáng)。 結(jié)果表明 HK-2細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)變,
8、介導(dǎo)了腎小管 間質(zhì)纖維化的發(fā)生。 討 論 TEMT與腎小管間質(zhì)纖維化 TEMT在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要 作用 TEMT過(guò)程包括:腎小管上皮細(xì)胞的黏附屬性缺失 (E-鈣粘蛋白減少 ),腎小管基底膜的破壞,表達(dá) - SMA的肌成纖維細(xì)胞增多及其向間質(zhì)遷移最終導(dǎo)致 間質(zhì)纖維化。 。 腎間質(zhì)纖維化的另一決定因素是 ECM合成與降解 平衡的調(diào)節(jié) 肌成纖維細(xì)胞分泌 FN參與 ECM構(gòu)成。 本研究選擇 FN作為觀察 ECM聚積的評(píng)價(jià)指標(biāo) TEMT與腎小管間質(zhì)纖維化 討 論 我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常腎小管上皮細(xì)胞因未發(fā)生 明顯轉(zhuǎn)分化,其 FNmRNA的分泌甚微, 而 5mg/ml人白蛋白誘導(dǎo) HK-
9、2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的發(fā)生同 時(shí),檢測(cè)到 FNmRNA表達(dá)呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性增強(qiáng), 進(jìn)一步參與腎間質(zhì)纖維化的形成。 TEMT與腎小管間質(zhì)纖維化 討 論 討 論 大黃素阻滯 TEMT在腎間質(zhì) 纖維化中的作用 實(shí)驗(yàn)中,我們通過(guò)使用 20g/ml大黃素與白蛋白共 同作用 HK-2細(xì)胞制造干預(yù)模型。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)大黃素干預(yù)后 HK-2細(xì)胞后其 E- cadherinmRNA的表達(dá)亦有漸降趨勢(shì), -SMA mRNA表達(dá)上升,但在 48h內(nèi)其下降 /上升趨勢(shì)呈明 顯減緩,較白蛋白誘導(dǎo)組有明顯差異。 大黃素部分阻滯了 HK-2細(xì)胞的 TEMT過(guò)程。 討 論 大黃素阻滯 TEMT在腎間質(zhì) 纖維化中的作用 而通過(guò)對(duì) FNmRNA表達(dá)情況的檢測(cè)發(fā)現(xiàn):經(jīng)大黃 素干預(yù)后, FNmRNA表達(dá)亦受到部分抑制。 原因可能為: 1、大黃素阻滯了 HK-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化 發(fā)生,使得 Myof細(xì)胞生成減少,進(jìn)而減少了 FN的 表達(dá)和分泌來(lái)源; 2、大黃素可抑制 Myof細(xì)胞對(duì) FN 的表達(dá)和分泌過(guò)程。 ! 20g/ml大黃素可在 48h內(nèi)呈時(shí)間依賴(lài)性的減輕白蛋白誘導(dǎo)的 HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分 化過(guò)程,延緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。