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1、不同處理因素對(duì)呼吸道合胞病毒感染人支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮5000字 摘要目的 探討不同處理因素對(duì)呼吸道合胞病毒（RSV）感染原代培養(yǎng)的人支氣管上皮細(xì)胞（NHBE）表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）的影響。方法 通過熒光定量PCR、ELISA檢測(cè)不同處理因素對(duì)RSV感染NHBE VEGF表達(dá)的影響。結(jié)果 RSV感染NHBE后，NHBE對(duì)VEGF的表達(dá)明顯增加，呈明顯的時(shí)間依賴性和濃度依賴性，地塞米松可以顯著抑制RSV感染NHBE細(xì)胞的VEGF表達(dá)，與RSV感染組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。25羥基維生素D3單獨(dú)作用可以刺激NHBE細(xì)胞表達(dá)VEGF，但可以抑制RSV感染NHBE的V
2、EGF表達(dá)，與RSV組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。結(jié)論 RSV增加了NHBE對(duì)VEGF的表達(dá)，地塞米松和25羥基維生素D3可以減弱這種效應(yīng)。關(guān)鍵詞支氣管哮喘；呼吸道合胞病毒；血管內(nèi)皮生長因子；支氣管上皮；維生素D；地塞米松中圖分類號(hào) R593.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1674-4721（2016）09（c）-0015-04支氣管哮喘是一種以反復(fù)喘息為主要癥狀并受多種因素影響的慢性氣道性炎癥性疾病。目前認(rèn)為，哮喘的主要病理生理學(xué)特征與氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑相關(guān)。氣道在環(huán)境激發(fā)因子的作用下，最先攻擊的靶細(xì)胞是氣道上皮，而氣道上皮的損傷與氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，也是導(dǎo)致
3、氣道重塑、增加哮喘治療難度的重要因素1。氣道上皮的結(jié)構(gòu)性破壞及持續(xù)存在的炎癥反應(yīng)是多種氣道疾病尤其是哮喘的共同表現(xiàn)2。呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）作為哮喘發(fā)生的潛在起始因子，已被人們關(guān)注多年。無論在兒童或成人，80%的哮喘急性發(fā)作與呼吸道病毒感染相關(guān)3-4。預(yù)防和治療RSV感染以防治哮喘發(fā)作仍是當(dāng)前的重要課題。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是在哮喘氣道重塑中起關(guān)鍵作用的調(diào)節(jié)因子，與各種炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)相互作用，參與哮喘的氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑的形成5。本研究以
4、原代培養(yǎng)的人支氣管上皮細(xì)胞（normal human bronchial epithelial cells，NHBE）作為研究對(duì)象，通過RSV感染NHBE，觀察其對(duì)上皮細(xì)胞表達(dá)VEGF的影響，并分別以地塞米松和活性維生素D（25羥維生素D3）進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)RSV感染的氣道上皮表達(dá)VEGF的影響。探討RSV感染的機(jī)制與哮喘發(fā)生的關(guān)系，在RSV感染哮喘患者給予適當(dāng)?shù)母深A(yù)治療，減輕RSV感染后的氣道炎癥反應(yīng)，為治療和預(yù)防哮喘發(fā)作提供一定的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料RSV Long 株由廣州呼吸疾病研究所免費(fèi)饋贈(zèng)，支氣管上皮細(xì)胞培養(yǎng)基（BEGM）購自美國Clonetic公司，25羥
5、維生素D3購自美國Sigma公司，胎牛血清、MEM培養(yǎng)基、0.25%的胰酶購自美國Gibco公司，VEGF ELASA試劑盒購自美國RD公司，DEPC水購自廣州威佳生物技術(shù)公司，RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司，基因引物購于寶生物工程有限公司（大連Takara公司），細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國康寧公司。1.2方法1.2.1 RSV病毒的擴(kuò)增和滴定 按之前的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行RSV病毒的擴(kuò)增和滴定，儲(chǔ)存于-80備用6。1.2.2 NHBE的原代培養(yǎng)和鑒定 人的支氣管上皮標(biāo)本均來源于本院胸外科肺葉切除分離獲取的正常支氣管組織或纖支鏡黏膜活檢獲取的正常支氣管上皮。用組織貼塊法7原代培養(yǎng)獲取NHBE，3
6、5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。用鼠抗人的角蛋白8抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫組化鑒定。1.2.3四唑鹽（Methyltetrazolium，MTT）比色法檢測(cè)不同濃度的25羥維生素D3對(duì)NHBE活力的影響 實(shí)驗(yàn)分組：0、5、10、20 nmol/L 25羥維生素D3，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。按之前的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，最后在酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm的吸光度值（D值）6。1.2.4 real-time PCR、ELISA檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)、不同感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）RSV感染NHBE后對(duì)VEGF蛋白表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)分組：陰性對(duì)照組，RSV MOI 0.005組，MOI 0.05組
7、，MOI 0.5組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將生長良好的NHBE以5x106的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞生長達(dá)90%融合，更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基（BEBM）培養(yǎng)12 h，不同MOI的RSV吸附NHBE 4 h，棄去培養(yǎng)基，更換BEBM培養(yǎng)36 h，收集細(xì)胞上清，5000 r/min離心10 min，留取細(xì)胞上清-80凍存，留待ELISA檢測(cè)上清中VEGF的蛋白水平，同時(shí)提取細(xì)胞總RNA，用real-time PCR檢測(cè)NHBE的VEGF mRNA表達(dá)6（按試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)）。1.2.5按不同處理因素對(duì)RSV感染NHBE后對(duì)VEGF表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分組：陰性對(duì)照組，RSV組，25羥維生素D3
8、組，RSV/25羥維生素D3組，地塞米松組，RSV/地塞米松組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將生長良好的NHBE以5x106的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞生長達(dá)90%融合，更換BEBM培養(yǎng)12 h。RSV/25羥維生素D3組，25羥維生素D3組，RSV/地塞米松組，地塞米松組，分別以含10 nmol/L 25羥維生素D3、0.01 mg/ml地塞米松的BEBM預(yù)處理12 h，陰性對(duì)照組和RSV組分別加同等量的BEBM處理相同時(shí)間，除了陰性對(duì)照組、25羥維生素D3組、地塞米松組，其余病毒組均加入MOI為0.5的RSV病毒液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集各組細(xì)胞上清，5000 r/min離心10 min，細(xì)胞上
9、清-80凍存，ELISA檢測(cè)上清中VEGF的蛋白水平（按試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)）。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單變量方差分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，組間多重比較采用LSD法，以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1人的支氣管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定鏡下觀察生長成單層的支氣管上皮細(xì)胞呈鋪路鵝卵石樣分布生長，單個(gè)細(xì)胞呈扁平狀，多邊形，符合上皮細(xì)胞生長特征。細(xì)胞免疫組化見95%以上細(xì)胞胞漿呈棕黃色著色，胞漿內(nèi)角蛋白染色陽性，證實(shí)為支氣管上皮細(xì)胞。2.2 MTT比色法檢測(cè)不同濃度25羥維生素D3對(duì)細(xì)胞活力的影響細(xì)胞活力=
10、（處理組D值-空白組D值）/（對(duì)照組D值-空白組D值）x100%。結(jié)果顯示，在25羥基維生素D3濃度≤10 nmol/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞活力無明顯影響，參考實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，選擇10 nmol/L濃度的25羥維生素D3處理細(xì)胞。2.3 RSV感染NHBE后VEGF的表達(dá)增加RSV感染NHBE后，VEGF的表達(dá)增加，且呈明顯的濃度依賴性（圖1）和時(shí)間依賴性（圖2）。在MOI 0.5時(shí)最明顯，選取MOI 0.5為最佳MOI，MOI 0.5感染24 h作用最明顯，同對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）（圖3），根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)選用MOI 0.5，感染時(shí)間24 h作為RSV實(shí)驗(yàn)條件。2.4不同處理因
11、素對(duì)RSV感染NHBE VEGF蛋白表達(dá)水平的影響RSV感染NHBE后，VEGF的表達(dá)明顯增加，地塞米松可以顯著抑制RSV感染NHBE VEGF蛋白的表達(dá)，與RSV感染組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）（圖4）。25羥基維生素D3單獨(dú)作用可以刺激NHBE表達(dá)VEGF蛋白，但可以抑制RSV感染NHBE對(duì)VEGF蛋白的表達(dá)，與RSV組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）（圖5）。3討論VEGF是一個(gè)多功能的細(xì)胞因子，在免疫炎癥反應(yīng)中起重要作用，其增強(qiáng)血管通透性的作用是組胺的5000倍。VEGF在哮喘氣道重塑、血管重塑中起關(guān)鍵作用，與各種炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)相互作用，共同參與哮喘的氣道炎癥、氣道高反應(yīng)
12、性和氣道重塑的發(fā)生發(fā)展。相關(guān)研究顯示，支氣管哮喘患者無論是血中還是誘導(dǎo)痰中的VEGF水平均明顯升高，與FEV1呈明顯的負(fù)相關(guān)，與氣道血管通透性及氣道狹窄的程度呈明顯的正相關(guān)，VEGF可以作為病情評(píng)估和療效判定的一個(gè)指標(biāo)8-10。Lee等11在轉(zhuǎn)基因小鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)VEGF可以通過IL-13依賴途徑和非IL-13依賴途徑誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生類似哮喘的氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性，促進(jìn)氣道重塑，還可以增強(qiáng)氣道抗原的敏感性及Th2炎癥反應(yīng)。迄今為止，諸多研究證明VEGF在哮喘啟動(dòng)和維持中發(fā)揮著重要作用，VEGF的調(diào)節(jié)有望成為未來哮喘治療的新靶點(diǎn)。在本研究中筆者發(fā)現(xiàn)，NHBE感染RSV后對(duì)VEGF的表達(dá)明顯增加
13、，地塞米松能有效抑制RSV感染引起的NHBE VEGF的合成，說明在病毒感染誘發(fā)的哮喘加重中激素可以通過抑制上皮細(xì)胞的VEGF表達(dá)來起作用。近年來，維生素D與哮喘的關(guān)系越來越受到人們的關(guān)注，但不同研究的結(jié)果尚不一致。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，兩者存在負(fù)相關(guān)，無論是兒童哮喘還是成人哮喘，維生素D含量越低，哮喘癥狀越重，婦女妊娠期間增加維生素D的攝入可減少兒童早期患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)12-13。不同的實(shí)驗(yàn)卻得到不同的結(jié)論，王曉芳等14在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在大鼠出生后早期補(bǔ)充維生素D，與對(duì)照組相比，無論低劑量組還是高劑量組均可促進(jìn)哮喘的發(fā)生，加重氣道炎癥的病變程度，而高劑量組則更明顯。對(duì)于具有免疫調(diào)控作用的維生素D究竟
14、對(duì)哮喘的發(fā)生發(fā)展起利或弊的作用尚存在很大爭議。本研究發(fā)現(xiàn)，維生素D單獨(dú)作用可以使NHBE表達(dá)VEGF增加，這可能與維生素D激活了NHBE上的維生素D受體的啟動(dòng)子反應(yīng)元件有關(guān)，從而使NHBE表達(dá)VEGF上調(diào)15。但本研究也發(fā)現(xiàn)維生素D可以抑制RSV感染后NHBE表達(dá)VEGF，這可能與維生素D本身可以減低NHBE的通透性、增強(qiáng)氣道上皮的屏障作用有關(guān)16。此外，盡管維生素D本身無清除病毒的能力，但可以增加核轉(zhuǎn)錄因子-κB抑制劑-κB抑制蛋白α的生成，抑制了核轉(zhuǎn)錄因子下游炎癥因子的表達(dá)，從而減輕RSV感染NHBE介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)17。有關(guān)維生素D可以抑制RSV感染后的
15、NHBE表達(dá)VEGF的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究和探討。參考文獻(xiàn)1Smyth RL.The airway epithelium in health and disease： calm on the surface，paddling furiously underneathJ.Thorax，2009，64（4）：277-278.2Holgate ST.Epithelium dysfunction in asthmaJ.J Allergy Clin Immunol，2007，120（6）：1233-1244.3Okayama Y.Cellular and humoral immunity of virus-induced adthmaJ.Front Microbiol，2013，4（2）：252.4Jackson DJ，Lemanske RF Jr.The role of respiratory virus infection in childhood asthma inceptionJ.Immunol Allergy Clin North Am，2010，30（4）：513-522.5Smith R.Is VEGF a potential therapeutic target in asthma？J.Pneumologia，2014，63（4）：194-199.
不同處理因素對(duì)呼吸道合胞病毒感染人支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮5000字
