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1、兔角膜上皮細胞體外原代培養(yǎng)方法的研究 目的:建立體外原代培養(yǎng)兔角膜上皮細胞簡單經(jīng)濟實用的方法,并觀察其體外生長的生物學(xué)特性。方法:采用消化法、組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)兔角膜上皮細胞并進行傳代培養(yǎng),分別測定細胞分裂指數(shù)及細胞貼壁率,MTT比色法測定細胞生長曲線。結(jié)果:兩種方法培養(yǎng)的細胞在原代、第1代形態(tài)相似，消化法培養(yǎng)的細胞代數(shù)維持低于組織塊法；對數(shù)生長期時，組織塊培養(yǎng)法的細胞具有更好的活力且分裂旺盛（P角膜； 上皮細胞； 原代細胞培養(yǎng)； 兔角膜細胞成分培養(yǎng)是現(xiàn)代角膜病研究和治療的基礎(chǔ)，近年來，隨著研究深入，對角膜細胞成分培養(yǎng)提出了更高要求。在此，我們探索了體外原代培養(yǎng)兔角膜上皮細胞的兩種方法，以期建立
2、一種簡單、經(jīng)濟、實用的兔角膜上皮細胞培養(yǎng)方法，現(xiàn)將實驗結(jié)果報告如下。1材料和方法1.1實驗材料1.1.1實驗動物健康新西蘭白兔6只，雌雄不限，體重2.02.5 kg,由東南大學(xué)實驗動物中心提供與飼養(yǎng)。眼部經(jīng)裂隙燈顯微鏡檢查顯示屈光間質(zhì)透明，無眼前節(jié)病變。1.1.2主要試劑和儀器DMEM/F12（Gibco,USA)，胎牛血清（中美合資蘭州民海生物），胰蛋白酶（Gibco,USA），EDTA（乙二胺四乙酸二鈉，AMRESCO 分裝），MTT（Sigma，USA），CO2培養(yǎng)箱（Heal Force HF121UV），倒置相差顯微鏡（OLYMPUS CKX41，Japan），酶標儀（Bio-rad
3、 Model 860）。1.1.3培養(yǎng)液的制備采用DMEM/F12=11的混合液，內(nèi)含10 mmo1L-1HEPES、20%胎牛血清、100103 UL-1青霉素和100103 UL-1鏈霉素，pH值7.27.4。1.2實驗方法1.2.1取材取新西蘭白兔6只，共12眼，以空氣栓塞法處死兔，無菌條件下迅速摘取眼球，用PBS反復(fù)沖洗后浸泡于含青、鏈霉素1 000103 UL-1 4 PBS中10 min,待用。1.2.2消化法原代培養(yǎng)角膜上皮細胞在超凈工作臺上將眼球用PBS沖洗23次，沿角膜緣取下完整角膜，用DMEM/F12培養(yǎng)液沖洗12次；在50 mm培養(yǎng)皿中加0.25%胰蛋白酶或0.1胰蛋白酶
4、0.02EDTA混合消化液約1 ml，將上述處理過的兔眼角膜上皮面朝下置于消化液中，培養(yǎng)箱中消化2030 min后翻轉(zhuǎn)角膜片，輕輕沖洗上皮面，將沖洗液移至加有適量胎牛血清的離心管終止消化；在培養(yǎng)皿中再次加入消化液，置培養(yǎng)箱中消化10 min后終止消化；將兩次消化的細胞懸液離心68 min(1 000 rmin-1)，棄上清，加入全培養(yǎng)液（內(nèi)含10 mmo1L-1HEPES、20%胎牛血清、100103 UL-1青霉素、100103 UL-1鏈霉素，pH值7.27.4），吹打混勻。計數(shù)制成51051106 ml-1細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中。置37 、5%CO2 和95%空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后
5、首次換液，以后每周更換23次。1.2.3組織塊貼壁法原代培養(yǎng)角膜上皮細胞在超凈工作臺上，將眼球用PBS沖洗23次后沿角膜緣取下完整角膜，放入加有培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中；在體式顯微鏡下完整撕下角膜上皮面，剪成約1 mm3大小角膜上皮片，均勻平鋪于培養(yǎng)瓶中，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶加入全培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)液慢慢浸過組織塊；或?qū)⒔悄ど掀て鶆蚱戒佊?4孔板中，置于培養(yǎng)箱中24 h，然后緩緩加入全培養(yǎng)液。將培養(yǎng)瓶或24孔板置于37 、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后首次換液，以后每周更換23次。1.2.4角膜上皮細胞的傳代原代培養(yǎng)至上皮細胞80融合后用PBS沖洗2次，加入0.25胰
6、蛋白酶-0.02EDTA 1 ml沖洗1次，再加入消化液12 ml，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，待細胞變圓，細胞間隙變大或少量細胞脫壁時加入含血清的培養(yǎng)液終止消化，收集細胞懸液，離心68 min (1 000 rmin-1)，計數(shù)，接種于培養(yǎng)瓶中（按12或13傳代），3 d后首次換液，以后每周更換23次，直至細胞融合。1.2.5觀察方法1.2.5.1形態(tài)觀察每日用倒置顯微鏡觀察活細胞生長情況，拍照記錄。1.2.5.2MTT法測定細胞生長曲線取生長狀態(tài)良好的上皮細胞，采用上述傳代方法消化，制成細胞懸液，計數(shù)，以103 ml-1接種于96孔板，每板設(shè)復(fù)孔且每孔的細胞數(shù)保持一致，加入等量培養(yǎng)液（200
7、 l孔-1）置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每天取出1塊板，每孔加入MTT溶液（5 mgml-1）20 l，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，小心吸棄培養(yǎng)上清液，每孔加入150 l二甲亞砜，室溫振蕩10 min；在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光密度值（OD570 nm），記錄結(jié)果，繪制生長曲線。1.2.5.3細胞分裂指數(shù)測定用上述傳代方法消化，將細胞懸液接種于放有小蓋玻片的6孔板中，每12 h取出1個蓋玻片，95酒精固定，HE染色、封片；選擇細胞密度適中的區(qū)域觀察分裂細胞，計數(shù)，繪制細胞分裂指數(shù)曲線圖。1.2.5.4細胞貼壁率測定取對數(shù)生長期細胞，消化法制成細胞懸液，計數(shù)，接種于培養(yǎng)皿中，每2 h取出一皿，消化已
8、貼壁細胞，計數(shù)，計算貼壁率，繪制貼壁率曲線圖。1.2.6統(tǒng)計學(xué)方法上述各實驗重復(fù)4次，應(yīng)用SPSS14.0 for Windows軟件的獨立樣本T檢驗對OD570 nm、分裂指數(shù)、貼壁率進行統(tǒng)計學(xué)分析。2結(jié)果2.1培養(yǎng)細胞的形態(tài)學(xué)結(jié)果2.1.1原代細胞的形態(tài)觀察2.1.1.1消化法接種后6 h可見細胞貼壁生長，呈圓形或多角形，核呈圓形，位于細胞中央或旁中央?yún)^(qū)，胞質(zhì)豐富，可見少數(shù)細胞體積較大的老化細胞，同時可見部分懸浮生長的細胞（圖1）；培養(yǎng)3 d后細胞呈膜狀生長，且伸出板層偽足；培養(yǎng)1周后細胞分裂增殖旺盛，全部呈膜狀生長，伸出板層偽足，且細胞已達基本融合狀態(tài)，并可呈復(fù)層生長。圖1消化法培養(yǎng)6
9、h倒置顯微鏡1002.1.1.2組織塊貼壁法接種后24 h可見從組織塊中伸出細胞偽足（圖2）；48 h可見從組織塊邊緣有細胞游出呈暈狀生長，形成典型的“沙灘樣”移行帶（圖3）；72 h后大部分組織塊上的細胞從移行帶向外長出生長暈，細胞核呈圓形，位于細胞中央或旁中央?yún)^(qū)，胞質(zhì)豐富，細胞相互緊密連接呈膜狀生長，生長界限明顯；5 d后迅速旺盛生長，接近組織塊的區(qū)域可呈復(fù)層生長，同時可見懸浮生長的細胞，換液后仍然存在；培養(yǎng)1周后相鄰組織塊之間細胞暈相接，鋪滿瓶底，形成良好的單層。圖2組織塊貼壁法培養(yǎng)24 h倒置顯微鏡100箭頭所示為組織塊邊緣伸出細胞偽足圖3組織塊貼壁法培養(yǎng)48 h倒置顯微鏡100細胞生長界限明顯，箭頭所示為“沙灘樣移行帶”2.1.2傳代細胞的形態(tài)觀察組織塊培養(yǎng)法：第1、2代細胞接種后12 d貼壁生長，形態(tài)與原代相似，細胞呈多角形鑲嵌排列，1周形成良好的單層鋪滿瓶底（圖4）。第3、4代細胞胞體逐漸變大，形狀不規(guī)則，10 d可形成單層。第5、6代逐漸出現(xiàn)較大的形狀不規(guī)則的衰老細胞，胞質(zhì)內(nèi)可見空泡、顆粒樣物質(zhì)，細胞間隙增大，并可見細胞凋亡，此時很難形成融合的單層細胞。圖4第1代培養(yǎng)5 d倒置顯微鏡100消化法：第1代與原代相似，第3代細胞形態(tài)開始變化，第5代細胞衰老很難形成單層。
兔角膜上皮細胞體外原代培養(yǎng)方法的研究
