上皮細(xì)胞激酶—2與層黏連蛋白5—γ—2在食管鱗癌細(xì)胞株的關(guān)聯(lián)性5800字

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1、上皮細(xì)胞激酶2與層黏連蛋白52在食管鱗癌細(xì)胞株的關(guān)聯(lián)性5800字 我國(guó)是食管癌的高發(fā)區(qū)，研究食管癌的發(fā)病機(jī)制、提高早期診斷率、尋找新的治療途徑是食管癌防治的關(guān)鍵1。食管癌是生長(zhǎng)迅速的腫瘤，因此食管癌組織內(nèi)常常存在著乏氧微環(huán)境。缺氧狀態(tài)可以刺激腫瘤細(xì)胞合成和分泌大量促血管生成因子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等，促進(jìn)腫瘤血管的生成，促進(jìn)惡性腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種存在于高侵襲性腫瘤的血液供應(yīng)方式，是由腫瘤細(xì)胞通過(guò)自身變形和基質(zhì)重塑產(chǎn)生血管樣通道，并與宿主血管相連，使腫瘤獲得足夠血供的一種血管化途徑。VM的存在對(duì)腫瘤浸潤(rùn)

2、、轉(zhuǎn)移有著巨大影響，與惡性腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)2-3。層黏連蛋白（laminin，LN）是一種有多種生物學(xué)功能細(xì)胞外基質(zhì)的糖蛋白，它們?cè)诨啄さ臉?gòu)建及細(xì)胞粘附、生長(zhǎng)、遷移和分化中扮演著至關(guān)重要的角色4。有研究顯示，層黏連蛋白的功能角色（5γ2鏈）在VM形成中發(fā)揮著重要功能5。細(xì)胞過(guò)表達(dá)血管生成2（angiopoie.tin-2）能使LN5-γ-2表達(dá)上調(diào)6。EphA2 是Eph亞家族成員中被發(fā)現(xiàn)的具有酪氨酸酶活性的第一個(gè)基因編碼產(chǎn)物，其功能涉及調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和遷移及血管生成。本研究組前期研究證實(shí)EphA2在食管鱗癌中是高表達(dá)的7，用EphA2 shRNA質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)

3、染人食管鱗癌細(xì)胞株Eca-109和TE13細(xì)胞后，采用Matrigel體外三維培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在有氧和缺氧條件下，抑制EphA2表達(dá)均可使腫瘤細(xì)胞管腔形成數(shù)量明顯減少8。本研究從腫瘤血管生成擬態(tài)的關(guān)鍵因子LN入手，探討EphA2與LN之間的關(guān)系，初步探討腫瘤血管生成擬態(tài)的形成環(huán)節(jié)。1?材料與方法1.1?細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)人低分化食管鱗癌細(xì)胞株TE13購(gòu)自上海細(xì)胞所，本研究組已成功構(gòu)建EphA2shRNA質(zhì)粒pcDNA6.2-GW/EmGFP shRNA，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TE13細(xì)胞，獲得TE13 EphA2/Neo細(xì)胞株和TE13 EphA2/shRNA細(xì)胞株。所有細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清RPMI-1640

4、培養(yǎng)液中，在37，5%CO2及飽和濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.2?主要試劑RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司，鼠抗人EphA2購(gòu)自RD公司，兔抗人laminin 5-γ-2抗體購(gòu)自SantaCruz公司。ProteinA瓊脂糖珠購(gòu)自Millipore公司。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自Fermentas公司。1.3?逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測(cè)TE13細(xì)胞、TE13EphA2/Neo細(xì)胞和TE13 EphA2/shRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后倒掉6孔板中的培液，每空加入1 mL的TRIZOL試劑，按照TRIZOL試劑的說(shuō)明書(shū)抽提RNA。之后取1μg的RNA，按照Taka

5、ra逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的要求將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件為：37 15 min，85 15 s，4 +∞。引物設(shè)計(jì)由上海杰瑞生物工程有限公司完成，LN的引物為：上游引物5-TGAAGCGTAACCAGCCGACGC-3’，下游引物5-CACAAACAGCACGTCCGGCTCT-3’，以GAPDH為內(nèi)參，其上游引物為5-GGGCTCTCTGCTCCTCCCTGTT-3’，下游引物為5-GCCGTTGAACTTGCCGTGG-GTAG-3’。Q-PCR的條件為95 5 min，95 15 s，60 1 min，40 cycles，其

6、中以evergreen為熒光染料。1.4?細(xì)胞免疫組化TE13細(xì)胞、TE13EphA2/Neo細(xì)胞和TE13 EphA2/shRNA細(xì)胞培養(yǎng)24 h，細(xì)胞以冰甲醇固定，兔抗人laminin 5-γ-2抗體工作濃度1200，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。DAB染色，光鏡下觀察細(xì)胞胞漿或胞核內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽(yáng)性。1.5?Western Blot檢測(cè)TE13細(xì)胞、TE13EphA2/Neo細(xì)胞和TE13 EphA2/shRNA細(xì)胞提取總蛋白，40μg蛋白上樣用5%濃縮膠、10%15%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉37封閉1 h，分別與相應(yīng)一抗4

7、孵育過(guò)夜。PBST洗膜3次后與相應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，37孵育2 h。ECL孵育3 min，暗室曝光并洗片。1.6?統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SSPS11.0處理，均以（）表示，以P0.05）。見(jiàn)圖1。2.2?EphA2對(duì)laminin5-γ-2在TE13細(xì)胞中蛋白表達(dá)的影響EphA2和laminin5-γ-2在TE13中均存在高表達(dá)。細(xì)胞免疫組化表明，laminin5-γ-2在TE13細(xì)胞和TE13 EphA2/Neo細(xì)胞胞漿內(nèi)呈陽(yáng)性表達(dá)，而laminin5-γ-2在TE13 EphA2/shRNA細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于在TE13細(xì)胞

8、和TE13 EphA2/Neo細(xì)胞中的表達(dá)。見(jiàn)圖2。Western Blot檢測(cè)表明，在TE13 EphA2/shRNA細(xì)胞中，EphA2（灰度值0.10±0.01）和laminin5-γ-2（灰度值0.01±0.00）的蛋白表達(dá)水平明顯低于在TE13細(xì)胞（灰度值1，1）和TE13 EphA2/Neo細(xì)胞（灰度值0.98±0.01，0.99±0.01）中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。見(jiàn)圖3。3?討論EphA2是Eph亞家族成員中被發(fā)現(xiàn)的具有酪氨酸酶活性的第一個(gè)基因編碼產(chǎn)物，是1990年Lindberg等6從人角化上皮

9、細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選得到的。EphA2廣泛表達(dá)于人類上皮來(lái)源的細(xì)胞，包括表皮、肺臟、腸道上皮細(xì)胞和卵巢組織等，其功能涉及調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和遷移及血管生成。近年來(lái)研究表明，EphA2 在許多腫瘤組織中呈高表達(dá)，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌和胃癌等9-13。同時(shí)臨床研究還發(fā)現(xiàn)EphA2的高表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)9-10。本研究組前期研究也證實(shí)EphA2在食管鱗癌中高表達(dá)7，而且用EphA2 miRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人食管鱗癌細(xì)胞株Eca-109和TE13細(xì)胞后，采用Matrigel體外三維培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在有氧和乏氧條件下，抑制EphA2表達(dá)均可使腫瘤細(xì)胞管腔形成數(shù)量明顯減少8，提示EphA2與食管鱗癌的VM生成密切相關(guān)。 作文 /層黏連蛋白是一種有多種生物學(xué)功能細(xì)胞外基質(zhì)的糖蛋白，它們?cè)诨啄さ臉?gòu)建及細(xì)胞粘附、生長(zhǎng)、遷移和分化中扮演著至關(guān)重 /html/zongjie/