《組織切片技術(shù)》PPT課件

《《組織切片技術(shù)》PPT課件》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《《組織切片技術(shù)》PPT課件（72頁珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、組織學(xué)切片技術(shù),大多數(shù)的生物材料，在自然狀態(tài)下是不適合顯微觀察的，也無法看到其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。因?yàn)椴牧陷^厚，光線不易透過，另外由于細(xì)胞內(nèi)各個(gè)結(jié)構(gòu)的折射率相差很小，即使光線可透過，也難以辯明。 組織學(xué)技術(shù)是教學(xué)和科研中常用的方法。組織在經(jīng)過固定，脫水，透明，包埋等手續(xù)后，用切片機(jī)切成較薄的切片，再經(jīng)不同的染色就可以顯示不同細(xì)胞組織的形態(tài)及其中某些化學(xué)成份含量的變化，組織切片也便于保存。 組織學(xué)標(biāo)本的制作技術(shù)是組織學(xué)，胚胎學(xué)，生物學(xué)、病理學(xué)、腫瘤學(xué)、法醫(yī)學(xué)及臨床診斷學(xué)等學(xué)科研究觀察細(xì)胞、組織的生理、病理形態(tài)變化的一種主要手段。,組織學(xué)技術(shù)包括： 組織學(xué)制片技術(shù) 組織化學(xué)技術(shù) 熒光組化及免疫組化技術(shù) 各種

2、特殊顯微技術(shù) 電鏡組織學(xué)技術(shù) 組織培養(yǎng)技術(shù)等,一、概 述,二、組織學(xué)制片技術(shù)的分類,組織學(xué)制片技術(shù)有很多不同的制片方法，一般可分為切片法與非切片法兩大類： 切片法：石蠟切片、火棉膠切片、冰凍切片等。 非切片法：鋪片、涂片、壓片、磨片、整裝片等。,即不用切片機(jī)，不經(jīng)切片手續(xù)而制成切片的方法，根據(jù)材料性質(zhì)的不同，有不同的處理方法，該類方法操作簡單快捷，其中鋪片法，封藏法可使原有組織結(jié)構(gòu)不被破壞，涂片法，壓片法彌補(bǔ)了用包埋，切片法所不可能觀察清楚的不足，因此是組織標(biāo)本制備中常用的手段。,1、非切片法,1.1 涂片法 主要用于血液、精液、尿液、痰液、微生物等不能切片的液態(tài)顆粒性材料，可在載玻片上涂成單

3、層細(xì)胞，再經(jīng)固定，脫水，染色等手段制成永久標(biāo)本。 1.2 鋪片法 主要用于動(dòng)、植物組織的表皮層觀察，可活體取待觀察組織，用尖鑷子迅速將組織平鋪在載玻片上。如: 疏松結(jié)締組織鋪片標(biāo)本的制備。,1.3 壓片法 一些較幼嫩，柔軟的材料可將其置載玻片上，用小解剖刀將其分散，加染料一滴，再蓋上蓋玻片，用拇指垂直用力擠壓，使組織散成一薄片，再進(jìn)行觀察，如骨骼肌運(yùn)動(dòng)終版的制備。 1.4 磨片(Ground section) 用于很堅(jiān)硬的組織，如骨和牙。,血涂片,骨磨片,疏松結(jié)締組織鋪片,鋪片,上皮組織鋪片,切片法是必須依靠切片機(jī)將組織切成薄片來進(jìn)行觀察的方法。為了能清晰地觀察到組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)，必須先經(jīng)過

4、一系列步驟將組織內(nèi)滲入某些支持物質(zhì)，使組織變硬以利于切成薄片，根據(jù)所用支持劑的種類不同，主要分為石蠟切片法，火棉膠切法，冰凍切片法等類型，切成薄片后還需要脫蠟，染色，脫水，透明等步驟，將其制成永久標(biāo)本。,2、切片法,石蠟切片是最基本的切片技術(shù)，冰凍切片和超薄切片等都是在石蠟切片基礎(chǔ)上發(fā)展起來的?，F(xiàn)以石蠟切片為例，介紹切片標(biāo)本的制備方法。,組織學(xué)制片步驟：,取材 固定 沖洗 脫水 透明 浸蠟 包埋 修塊 切片 貼片 烤片 染色 封片 觀察結(jié)果,根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選擇相應(yīng)的材料，材料要求新鮮、準(zhǔn)確、完整，材料要避免擠壓、挫傷、干枯。 所采集材料應(yīng)立即放入固定劑，并編號(hào)，注明采集時(shí)間、地點(diǎn)、名稱、

5、組織部位，所取組織塊要大小適當(dāng)，即要能說明問題，又要考慮固定劑的穿透能力。 一般組織學(xué)取材稍大，細(xì)胞學(xué)取材稍小，動(dòng)物組織取材要稍大，植物組織取材稍小。,2.1 取材,手術(shù)切除標(biāo)本，各種活檢穿刺標(biāo)本和尸體解剖標(biāo)本。 手術(shù)切除標(biāo)本的取材： 病灶在組織中的分布常存在不均一性，取材要有代表性，取材部位要兼顧：主要病灶，病灶與正常組織交界處，遠(yuǎn)離病灶的正常組織。 組織大?。洪L1cm寬1cm厚0.20.3cm。 各種組織的活檢取材： 活檢取材體積小，取材困難，不易取到主要病灶，因此對(duì)標(biāo)本的處理應(yīng)特別慎重，及時(shí)固定，包埋時(shí)要平整。,2.1.1 人體組織標(biāo)本的取材,2.1.2 動(dòng)物組織標(biāo)本的取材,動(dòng)物的處死方

6、式一般為活殺，組織標(biāo)本來源較新鮮，10min內(nèi)即可完成固定和冷凍保存，腦組織和神經(jīng)組織應(yīng)采用灌注固定后，再進(jìn)行后固定。,制片所需的材料要求越新鮮越好，尤其是細(xì)胞學(xué)方面的研究對(duì)材料的新鮮程度要求更嚴(yán)。因此，要從活的動(dòng)物體上采取材料，在一般情況下，要對(duì)動(dòng)物施行麻醉，然后再割取材料加以固定。所用的麻醉藥品，必須以不影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)為原則。,動(dòng)物的選擇,動(dòng)物的選擇是組織切片取材的第一步,在組織學(xué)中以人的組織為理想，但人的組織不易得到，根據(jù)研究的需要，大都以動(dòng)物的組織來代替。有些動(dòng)物的組織器官比人的組織更為典型，如：豬的肝臟；豚鼠胰腺、內(nèi)耳；貓的肋間肌顯示運(yùn)動(dòng)終板；兔的皮下組織和腸系膜作活體染色較為理想等。

7、,動(dòng)物的處死,（1）吸入麻醉法：將浸透乙醚的棉花放入玻璃缸內(nèi),將 動(dòng)物放入玻璃缸內(nèi),蓋上玻璃蓋，觀察動(dòng)物麻醉情況，放血處死，此法用于小動(dòng)物。 （2）注射麻醉法：用3%戊巴比妥鈉按每公斤體重12ml靜 脈注射或腹腔注射，麻醉后立即放血處死，此法用于大動(dòng)物。 （3）直接處死法：用金屬器械猛擊動(dòng)物的后腦部或直接斷頭放血處死，此法適合于小動(dòng)物。,2.1.3 組織取材注意事項(xiàng),1.組織要求離體后30min內(nèi)浸入固定液，尤其是開展分子生物學(xué)研究。動(dòng)物放血處死后立即取材，最好在心臟還在跳動(dòng)時(shí)立即取材，馬上投入固定液中； 2.注意防止人為因素的影響 切取組織的刀剪必須鋒利，刀要足夠長。切分組織塊時(shí)，不可來回切

8、割。夾取組織時(shí)，鑷子要輕，切勿擠壓。以免損傷組織； 3.組織塊的大小 厚為0.20.5cm，大小可根據(jù)需要而定。柔軟組織不易切小,可先取稍大的組織塊固定2 3h，等組織稍硬后再切成薄的小塊繼續(xù)固定。,4.取材應(yīng)注意清潔，組織塊上如有血液、污物和粘液沾著，應(yīng)用生理鹽水洗滌后再入固定液。 5.取材時(shí)間：原則上，應(yīng)盡快取材，但比較大的手術(shù)標(biāo)本如胃、肺、腸等器官，最好先固定后取材。 6.注意確定取材部位和包埋切面的方向，切除不需要的部分。 7.明確編號(hào)，登記,新鮮的組織被割取后,由于細(xì)胞內(nèi)酶的作用和細(xì)菌的繁殖，可引起組織的自溶和腐敗。因此，割取組織塊后，應(yīng)立即采用一種方法，將組織盡可能保持原有的形態(tài)結(jié)

9、構(gòu)，且有利于保存和適于制片的操作，這一步驟稱為固定?；瘜W(xué)固定法就是用化學(xué)試劑配制成固定液使組織固定。 固定是制片極為關(guān)鍵的一個(gè)步驟，制片質(zhì)量的優(yōu)劣，除與材料的新鮮程度有關(guān)外，還取決于最初的固定是否適當(dāng)和完全。,2.2 組織標(biāo)本的固定, 防止組織自溶和腐??； 使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、糖、脂肪等各種成分沉淀保存下來從而保存細(xì)胞的各種組成成分使其保持與生活時(shí)相近似的形態(tài)和結(jié)構(gòu)； 因沉淀及凝固的關(guān)系，使細(xì)胞內(nèi)不同的成分產(chǎn)生不同的折光率，造成光學(xué)上的差別使原來在生活情況下看不清楚的結(jié)構(gòu)變得清晰易見，且有的固定劑還有助染作用(如醋酸、苦味酸)，從而使細(xì)胞各部易于染色； 固定劑還兼有硬化作用，使柔軟組織硬化而不易

10、變形，有利于操作。,固定的目的和作用在于：,（1）小塊組織固定：從人體或動(dòng)物取出組織，切成小塊投入固定液中固定。 （2）局部注射固定：某些組織和器官其固定液不易滲透或滲透較慢，滲透不均勻，還有些器官為保持外型或卷縮，可采取局部注射固定方法，固定46小時(shí)后，再將組織切成小塊繼續(xù)投入固定液中固定。 （3）整體注射固定：此法主要用于科研和大體解剖，亦可用于組織學(xué)教學(xué)制片。,固定的方法,固定液的種類很多?？煞譃閮纱箢悾簡渭児潭ㄒ汉突旌瞎潭ㄒ?。 單純固定液：是用一種化學(xué)試劑作為固定液，如乙醇、甲醛溶液、冰醋酸等,它們只是對(duì)細(xì)胞的某種成分固定得較好；不能將細(xì)胞所有的成分都保存下來。如升汞固定蛋白質(zhì)、冰醋酸

11、固定核蛋白、無水乙醇可固定糖原等，單純固定液有一定局限性。 混合固定液：是用幾種化學(xué)試劑，按一定的比例混合配制而成的，由于各種試劑的優(yōu)缺點(diǎn)互相彌補(bǔ)，因此可產(chǎn)生較好的效果。,固定液的選擇,（1）甲醛固定液： 是一種還原劑，呈酸性，原液濃度為37%40%，配成固定液的濃度為4%，習(xí)慣上稱為10%，配制時(shí)取甲醛原液10ml，加蒸餾水（D.W）或緩沖液至100ml，為甲醛固定液（10福爾馬林） 。 甲醛滲透力強(qiáng)，固定均勻。但脫水后有較大收縮，在某些方法中要求中性甲醛，可在原裝瓶內(nèi)放入碳酸鎂，pH為7.6，能長期保持中性。甲醛固定后，通常需在流水中沖洗24-48小時(shí),否則影響染色效果。,(2) 4多聚甲

12、醛固定液 最好是動(dòng)物經(jīng)灌注固定取材后，繼續(xù)固定2-24h。該固定劑較為溫和，適用于組織標(biāo)本的長期保存。 (3) BouinS液 苦味酸飽和水溶液 75ml 甲醛 25ml 冰醋酸 5ml 是常用的良好固定液，滲透速度快，收縮小，組織固定均勻，不使組織變硬變脆，保持結(jié)構(gòu)完整，適合于各種胚胎連續(xù)切片，對(duì)于肝、皮、胰腺特殊染色效果好。固定為1224小時(shí)，但固定過久，對(duì)堿性染料著色不利。,（4）Carnoy氏液 純酒精 60ml 氯仿 30ml 冰醋酸 10ml 此固定液滲透速度快，2mm以下小塊組織固定時(shí)間24小時(shí)，它是細(xì)胞極好的固定液，適合于細(xì)胞分裂、RNA、DNA及糖元等固定。固定后直接入純酒精

13、脫水。,(5) PLP固定液： 過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛固定液。該固定劑較適合于富含糖類組織，對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。 (6) Methacarn固定液 甲醇60ml，氯仿30ml，醋酸10ml，混均后4保存?zhèn)溆?，?duì)核內(nèi)抗原的保存效果較好。 (7)丙酮及醇類固定劑 丙酮、乙醇類固定劑其固定原理主要是對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀而發(fā)生固定作用。酒精是一種還愿劑，用于組織固定以95%的濃度為宜，酒精固定后的組織細(xì)胞核著色不良，一般用于糖元的固定。甲醇、丙酮常用于細(xì)胞固定。,注意事項(xiàng)：,1. 根據(jù)材料的性質(zhì)和制片的目的選擇固定液。 2. 一般固定液都以新配為好，有些混合固定液的成份之間會(huì)發(fā)生氧化還原

14、作用，一定要在使用前才混合。配好后應(yīng)貯存在陰涼處，不宜放在日光下，以免引起化學(xué)變化，失去固定作用。 3. 固定材料時(shí)，固定液必須充足，一般為材料塊的20-30倍，有些水分多的材料，中間應(yīng)更換1-2次固定液。 4. 材料固定完畢后，保存于嚴(yán)密緊塞或加蓋的容器里，同時(shí)在容器外上標(biāo)簽，以免相互混淆。 5. 標(biāo)簽上注明固定液、材料來源、日期等。標(biāo)簽上的文字，應(yīng)用黑色鉛筆或繪圖黑墨水書寫。,2.3 組織脫水、透明,脫水(Dehydration): 由于石蠟不溶于水，因而，組織經(jīng)固定和水洗后含大量水分，需先用乙醇類試劑進(jìn)行脫水。脫水是用一種既能與水又能與透明液混合的液體來逐漸置換樣品中游離的水。如用濃度逐

15、漸升高的酒精 (70-100%)將組織中的水完全置換出來。,現(xiàn)最常采用的脫水劑是乙醇，進(jìn)行梯度脫水，此外， 丙酮、正丁醇、松脂醇等也可作為脫水劑。脫水的時(shí)間，可根據(jù)組織的類型，大小而定。 脫水的過程： 50%乙醇70%乙醇80%90%100% 100%乙醇 脫水應(yīng)逐步進(jìn)行，否則將引起組織強(qiáng)烈的收縮或變形，在經(jīng)無水乙醇處理時(shí)，應(yīng)保證試劑的純度。,注意事項(xiàng)： 1. 在低濃度或純酒精中，每級(jí)停留不宜太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體。 2. 在高濃度或純酒精中，每級(jí)停留的時(shí)間也不宜太長，否則會(huì)使組織變脆，影響切片。 3. 如需過夜，應(yīng)停留在70%酒精中。 4. 脫水必須徹底，否則不易透明，甚至使

16、透明劑內(nèi)出現(xiàn)白色混濁現(xiàn)象,透明（Clearing）: 脫水后，組織內(nèi)含有大量的乙醇。由于石蠟不溶于水，也不溶于醇類試劑。因此，必須用一種既能與乙醇又能與包埋介質(zhì)互溶的液體來置換樣品中的乙醇，從而為最終的包埋創(chuàng)造一個(gè)有利的條件，該過程即透明?，F(xiàn)采用的透明劑一般是二甲苯，甲苯，氯仿等。 二甲苯是使用最廣泛的一種透明劑，它具有滲透力強(qiáng)，溶解石蠟量大，又易揮發(fā)的優(yōu)點(diǎn)，其缺點(diǎn)是易使組織收縮，變硬，變脆，因此透明時(shí)間應(yīng)根據(jù)組織塊大小及質(zhì)地酌情而定,注意事項(xiàng)： 1.使用透明劑時(shí)，要隨時(shí)蓋緊蓋子，以免空氣中的水分進(jìn)入。 2.更換每級(jí)透明劑，動(dòng)作要迅速，一方面為了不使材料塊干涸，另一方面能避免吸收濕氣。 3.在

17、透明過程中，如果材料周圍出現(xiàn)白色霧狀，說明材料中的水未被脫凈，應(yīng)退回純酒精中重新脫水，然后再透明。,浸蠟（Infiltration）: 目的：除去組織中的透明劑（如二甲苯等），使石蠟滲透到組織內(nèi)部達(dá)到飽和程度以便包埋。 方法：將完成透明步驟的組織塊浸入透明劑與石蠟混合液中，不斷提高石蠟的比例，直至用液態(tài)石蠟完全置換出組織塊中的透明劑，最后，組織細(xì)胞內(nèi)被大量石蠟支撐，室溫時(shí)石蠟?zāi)坛晒虘B(tài)，使組織能用于石蠟切片。,2.4 浸蠟,注意事項(xiàng)： 1. 盡量保持在較低溫度中進(jìn)行，以石蠟不凝固為度； 透蠟溫度要恒定，不可忽高忽低； 2. 操作要迅速，力求在最短的時(shí)間內(nèi)完成石蠟透入過程，以免引起組織變硬、變脆

18、、收縮等。 3. 透蠟時(shí)間根據(jù)組織的薄厚、大小來進(jìn)行。透蠟應(yīng)在恒溫箱內(nèi)進(jìn)行，并保持箱內(nèi)溫度在5560左右，注意溫度不要過高，以免組織發(fā)脆。,水和酒精可以相溶。 酒精和二甲苯相溶。 二甲苯和石蠟可以相溶。 因?yàn)橐陨舷噜彶襟E所使用的液體均可以互溶，所以保證每一步驟液體能置換完全。 水和二甲苯不能相溶，乙醇和石蠟不能相溶，所以如果有一個(gè)步驟的處理不徹底，殘留的液體帶到下一個(gè)步驟將不能互溶，最終帶到滲蠟步驟中，成為細(xì)小的空洞，以至不能成為質(zhì)地致密的石蠟塊，也就切不成良好的切片。,我們可以看到：,2.5 包埋,將透蠟的組織連同熔化的石蠟，一起倒入包埋盒內(nèi)，然后包埋盒底部接觸冷水中，使其立刻降溫凝固成蠟塊

19、。 用于包埋的石蠟的熔點(diǎn)在5060之間，包埋時(shí)應(yīng)根據(jù)組織材料、切片厚度、氣候條件等因素，選擇不同熔點(diǎn)的石蠟。一般動(dòng)物材料常用的石蠟熔點(diǎn)為5256。 操作過程： 包埋時(shí)，將紙盒放在已經(jīng)加熱的溫臺(tái)上，從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入包埋用的紙盒中，取出存放材料的蠟杯3，迅速輕輕地用鑷子夾取材料平放于紙盒底部（注意切面朝下放置），再用溫鑷子輕輕撥動(dòng)材料，使之排列整齊。待石蠟完全凝固（約30min）后即可取出備用。,常規(guī)石蠟包埋過程,(1)固定：10%福爾馬林24h48h，流水沖洗 (2)脫水：75、85乙醇，95乙醇、，無水乙醇、。 (3)透明：二甲苯、二甲苯、二甲苯 (4)浸蠟：二甲苯/石蠟、石

20、蠟、石蠟 (5)石蠟包埋：修蠟塊，標(biāo)號(hào),修塊：切片前需修整蠟塊，即將包埋好的一大塊蠟塊切開，使每一小塊都含有一塊組織，從切面看組織周圍的石蠟相等。 固著：將修好的蠟塊粘在大小適宜的樣品臺(tái)上，以便于固定在切片機(jī)上。 切片：一手持毛筆，一手轉(zhuǎn)動(dòng)切片機(jī)，切片的蠟片連成一長條蠟帶。切下的蠟帶放在一干凈黑紙上。 貼片：用小刀根據(jù)需要切成數(shù)段，分別用粘片劑貼在干凈載玻片上。在恒溫展片臺(tái)上展平，烘干。,2.6 切片,切片: 用切片機(jī)將組織切成510m厚的蠟片，然后將其放到溫水上，待其完全展開后，裱到有粘附劑的載玻片上。,切片前的準(zhǔn)備工作,(1)載玻片的清潔： 市售載玻片需經(jīng)清潔液泡24h，流水沖洗，系列乙醇

21、浸泡，涼干涂粘合劑。如需開展原位雜交，還需將玻片240烤2h。 (2)切片粘合劑的種類 多聚賴氨酸（分子量300KD）：0.5%濃度。 APES試劑（3-氨基、丙基三氧基硅烷）： 干凈載玻片丙酮5min APES（1ml+ 50ml丙酮）：用鑷子夾住浸入APES試劑13次純丙酮洗二次干燥玻片用鋁箔包好，室溫或4保存?zhèn)溆谩?鉻礬明膠液： 鉻礬0.5g 明膠5g H2O 1000ml 蛋白甘油：,切片要求及注意事項(xiàng)：,(1)切片刀要快，切片厚510m。 (2)切片按序貼在玻片的下1/3。 (3)5260烤片。 (4)編號(hào) (5)切片可在4保存數(shù)年（石蠟切片） (6)冰凍切片后需涼干后立即固定 (7

22、)冰凍切片分固定和新鮮組織，固定組織需經(jīng)庶糖處理24h后冰凍切片。,組織學(xué)制片技術(shù)雖是生物學(xué)中很基本的操作技術(shù)，但由于生物材料的個(gè)體差異，化學(xué)試劑的多樣性，因此操作技術(shù)相當(dāng)細(xì)致而復(fù)雜，方法也很多，每一步驟的失誤都可導(dǎo)致整體的失敗，因此需要耐心細(xì)致，不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，才能得到較好的結(jié)果。,2.7 染色,根據(jù)來源分 (l)天然染色劑 此類染色劑是從動(dòng)、植物體中提取的，為天然產(chǎn)物，產(chǎn)量少。目前常用的有蘇木精、洋紅、地衣紅和靛藍(lán)等。其中最常用的為蘇木精和洋紅。 (2)合成染色劑 全是由芳香環(huán)或具有芳香性的雜環(huán)化合物所構(gòu)成。最早是由煤焦油蒸餾產(chǎn)物合成而得的，所以又稱為煤焦油染料。 除上述兩類外，在生物染色中

23、還使用一些無機(jī)化合物，如硝酸銀、氯化金、鋨酸等。,2.7.1 染色劑的分類,根據(jù)用途分為： (l)細(xì)胞核染色劑 用于細(xì)胞核的染色劑有天然染色劑的蘇木精、洋紅以及合成染色劑中的番紅、結(jié)品紫、硫堇、甲苯胺藍(lán)、甲基綠、美藍(lán)、孔雀綠和焦油紫等。 (2)細(xì)胞質(zhì)染色劑 用于細(xì)胞質(zhì)的染色劑有合成染色劑中的曙紅、亮綠、橘黃G、酸性品紅、苦味酸和水溶性苯胺藍(lán)等。 (3)脂質(zhì)染色劑 用于顯示脂質(zhì)的染色劑有合成染色劑中的蘇丹III、蘇丹Iv、硫酸尼羅藍(lán)及油紅等。,根據(jù)染色劑的化學(xué)性質(zhì)分為： 堿性染色劑、酸性染色劑和中性染色劑。 堿性、酸性和中性染色劑都是由一種酸和一種堿所構(gòu)成的鹽類。 堿性染色劑和酸性染色劑的主要區(qū)

24、別，就在于染色劑的主要有色部分是陽離子還是陰離子。若染色劑電離后，其分子的主要部分成陽離子為堿性染色劑；若電離后，其分子的主要部分為陰離子即為酸性染色劑。,染色的物理作用 此理論認(rèn)為組織細(xì)胞的染色主要是依靠下列三種物理作用的一種或全部，使染色劑進(jìn)入組織或細(xì)胞內(nèi)。 (1)毛細(xì)管作用及滲透作用 但染色劑與組織細(xì)胞沒有牢固的結(jié)合 (2)吸收作用 又稱溶解學(xué)說。這種學(xué)說認(rèn)為組織細(xì)胞所以能被染色，主要是吸收作用所致。組織吸收染色劑，牢固的結(jié)合。組織的著色與溶液的顏色相同。,2.7.2染色原理,(3)吸附作用 吸附作用是固體物質(zhì)的特性，即較大的物體能從周圍溶液(染液)中吸附一些小顆粒(化合物或離子)到自身

25、的特性。細(xì)胞中各種蛋白質(zhì)或膠體有不同的吸附面，因此能選擇性地吸收不同的離子，即某種蛋白質(zhì)對(duì)某種染色劑有吸附作用,而對(duì)別種染色劑無吸附作用，這就可以解釋鑒別染色現(xiàn)象。,染色的化學(xué)作用 化學(xué)作用的主要理論根據(jù) 是染色劑的性質(zhì)可分為酸性、堿性和中性染色劑，而動(dòng)、植物的細(xì)胞內(nèi)般也可區(qū)分為酸性(陰離子)和堿性(陽離子)部分。當(dāng)堿性染色劑溶液中的有色部分成為陽離子時(shí)，就能與細(xì)胞的陰離子(酸件部分)較牢固地結(jié)合，當(dāng)酸性染色劑溶液中的有色部分成為陰離子時(shí)，就能與細(xì)胞內(nèi)的陽離子(堿性部分)較牢固地結(jié)合。 例如，細(xì)胞核，尤其是核內(nèi)的染色質(zhì)，主要由核酸組成，是酸性的組成成分故和堿性染色劑(蘇木精)的親和力很強(qiáng)，易于

26、著色。細(xì)胞質(zhì)含堿性物質(zhì)，故和酸性染色劑(伊紅)的親和力很大，易于著色。,HE染色基本技術(shù),蘇木素與伊紅對(duì)比染色法（簡稱HE對(duì)染法）是組織切片最常用的染色方法。這種方法適用范圍廣泛，對(duì)組織細(xì)胞的各種成分都可著色，便于全面觀察組織構(gòu)造，而且適用于各種固定液固定的材料，染色后不易褪色可長期保存。經(jīng)過HE染色，細(xì)胞核被蘇木素染成藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)被伊紅染色呈粉紅色。,一、石蠟切片脫蠟至水,在染色前，需要脫蠟入水，因?yàn)槿玖鲜撬苄缘?。冰凍切片?80取出，涼干或電吹風(fēng)吹干后可直接進(jìn)行染色。 石蠟切片需經(jīng)如下脫蠟：,脫蠟步驟： 二甲苯 10min， 37二甲苯 10min，37 無水乙醇 2min，無水乙醇

27、2min， 95乙醇 2min，85乙醇 2min，75乙醇 2min， 流水沖洗。,二、染色,染色(Staining): 染料可以將微觀結(jié)構(gòu)顯示不同的顏色以便觀察鑒別。,染色方法,即蘇木精和伊紅染色（簡稱 H E 染色） 蘇木精(hematoxylin)： 紫藍(lán)色，堿性染料，可使細(xì)胞核和胞質(zhì)內(nèi)的嗜堿性物質(zhì)（RER、游離核糖體）著藍(lán)紫色。 伊紅(eosin)： 紅色，酸性染料，可使細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、溶酶體等大多數(shù)細(xì)胞器，以及細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)的膠原纖維等著紅色。,1、普通染色,染色方法,HE染色,蘇木精,伊 紅,嗜堿性結(jié)構(gòu)： 細(xì)胞核 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 游離核糖體等,嗜酸性結(jié)構(gòu)： 細(xì)胞質(zhì)基質(zhì) 溶酶體、線粒體等細(xì)胞器

28、 膠原纖維等,在染色后，重新進(jìn)入酒精和二甲苯，最后用中性樹膠封片，以便長期保存。 * 切片: 固定 梯度酒精上行 二甲苯 石蠟。 * 染色: 石蠟 二甲苯梯度酒精下行 水。 * 保存: 水 梯度酒精 二甲苯中性樹膠。,最常用的染料是蘇木素(Hematoxylin, H)和伊紅(Eosin, E)。 * 蘇木素是堿性染料，藍(lán)紫色，可以使細(xì)胞核等著色。被蘇木素著色的結(jié)構(gòu)本身為酸性，具有嗜堿性(Basophilic)。,* 伊紅是酸性染料，粉紅色?？梢詫⒋蠖鄶?shù)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)染成紅色。被伊紅著色的結(jié)構(gòu)本身為堿性，具有嗜酸性(Acidophilic)。 * 不易被蘇木素和伊紅著色的結(jié)構(gòu)具有嗜中性(Neut

29、rophilic)。,石蠟切片&HE染色,其他染色法: 硝酸銀神經(jīng)細(xì)胞(黑), 醛復(fù)紅彈性纖維(紫), 甲苯胺藍(lán)肥大細(xì)胞(紫紅色),PAS染色：糖分子過碘酸乙二醛基Schiff試劑紫紅色,蘇木精 4g 無水酒精 25ml 10銨明礬(硫酸鋁銨)水溶液 400m1 配制時(shí)先將蘇木精溶于無水酒精，待先全溶解后加入10銨明礬水溶液，充分?jǐn)噭?dòng)混合后，注入細(xì)口瓶內(nèi)，瓶口用紗布封住。然后將瓶置于溫暖有光處34天后過濾，濾后再加入100m1甘油和100ml甲醇，混合均勻后，瓶口仍用紗布封口，再置于光線充足處12月使之成熟。待顏色變成紫褐色時(shí)即為成熟。成熟后過濾，塞緊瓶口置于陰涼處貯存，可長期保存，多年不壞。此液著色力較強(qiáng)，染數(shù)分鐘即可。也可用染液l份加蒸餾水35份稀釋后使用，染色時(shí)間需延長一至數(shù)小時(shí)。此液染細(xì)胞核及嗜堿顆粒效果良好。染植物細(xì)胞的纖維壁比用其它任何染液著色更好。,附：染色劑和染色液的配制,步驟如下： 二甲苯二甲苯1/2二甲苯+1/2乙醇混合液100%乙醇95%乙醇85%乙醇70%乙醇蘇木精染液0.01%鹽酸自來水70%乙醇85%乙醇伊紅染液95%乙醇100%乙醇100%乙醇1/2二甲苯+1/2乙醇混合液二甲苯二甲苯封片,