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1、,激光掃描共聚焦顯微鏡在微生物研究中的應用 劉盛榮 2011-09-09,CTC 染色,Baclight Live/Dead 染色,Baclight Live/Dead 染色,激光掃描共聚焦顯微成像,主要內(nèi)容,1、分子熒光的形成 2、微生物研究中常用的熒光染料 3、共聚焦顯微鏡基本原理 4、共聚焦顯微鏡在微生物研究中的應用,一、分子熒光的產(chǎn)生,1.1 分子熒光產(chǎn)生的條件 1. 基態(tài)分子受到能量激發(fā)，吸收一定能量后，躍遷至激發(fā)態(tài), 通常為*、n*躍遷 2. 激發(fā)態(tài)分子在很短時間內(nèi)，以電磁輻射的形式釋放能量并返回基態(tài)，便產(chǎn)生了分子發(fā)光（熒光或磷光）,1.2 影響熒光的因素 1. 溶劑的影響 除一般
2、溶劑效應外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化 2. 溫度的影響 熒光強度對溫度變化敏感，溫度增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加 3. 溶液pH 對酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴格控制,二、微生物研究中常用的熒光探針,熒光探針主要基于測定微生物的某一生理進行分類,1、膜通透性（membrane integrity） 2、代謝活性(metabolic activity) 3、膜電位(membrane potential) 4、酯酶活性(esterase activity) 5、pH 梯度(pH gradient) 6、其它,微生物研究中主要的熒光探針：,1、膜通透性(mem
3、brane integrity) BacLight Live/Dead (PI/SYTO9),PI,PI,PI,PI,PI,PI,SYTO9,SYTO9,SYTO9,PI,PI,PI,PI,PI,Viable cell,Damaged cell,SYTO9,SYTO9,鏈霉菌不同發(fā)酵時期：菌絲活性及內(nèi)部結(jié)構(gòu),Example 1. Staining of Streptomyces sp. with BacLight live/dead L7007,2、代謝活性(metabolic activity),微生物代謝活性分析的熒光探針主要有： 5-Cyano-2.3-ditolyl tetrazoli
4、um chloride (CTC) 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazyl)-2,5-diphenyl-2-tetrazolium bromide (MTT) 2-(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium bromide (INT),紅色熒光分子,無色非熒光分子,Viable cell,CTC的微生物細胞還原,CTC,CTF,CTF,Example 2: Staining of Streptomyces sp. with CTC,CTC 染色,CTC 染色,3、酯酶活性(esterase activity),工作原理
5、：在活性微生物細胞酯酶作用下，將非熒光分子水解，釋放出熒光分子并依靠膜的完整性保留于胞內(nèi) 1. Fluorescein diacetate (FDA) 2. 5(6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(CFDA-SE),熒光染料作為底物由酯酶所水解產(chǎn)產(chǎn)生熒光分子,活性微生物細胞,活性微生物細胞將其還原為熒光分子并沉淀于 微生物細胞內(nèi),4、膜電位（membrane potential）,工作原理：活性微生物細胞可維持細胞的膜電位，可作為微生物細胞活性的一個評價的生理指標 1. 帶正電荷熒光探針 Rhodamine 123 (Rh123
6、); DiOC6(3) 進入活性細胞 2. 帶負電荷熒光探針 Bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)-trimethine oxonol DiBAC4(3) 進入死細胞,5、pH熒光探針,工作原理：活性細胞可以維持胞內(nèi)外一個合適的pH梯度，因此，測定微生物細胞內(nèi)的pH可作為細胞生理狀態(tài)的一個評價標準 1. 5(6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(CFDA-SE) 2. Pranine 3. BCECF,一些常見熒光染料的激發(fā)與發(fā)射波長,三、激光掃描共聚焦顯微鏡,3.1 激光掃描共聚焦顯微鏡的組成 顯微鏡
7、光學系統(tǒng) 掃描裝置 激光光源 檢測系統(tǒng) 整套儀器由計算機控制，各部件之間的操作切換都可在計算機操作平臺界面中方便靈活地進行。,3.2 共聚焦成像原理,More Color Possibilities,2. Less Cross Talk（串色）,3.3 激光掃描共聚焦顯微鏡與熒光顯微鏡比較,4. Three-Dimensional Reconstruction of Specimen （三維重構(gòu)）,5. Improved Resolution（更高的分辨率）,3. Optical Sectioning of Objects Without Physical Contact （光學切片）,Exa
8、mple 3: Comparison of confocal microscopy with fluorescent microscopy,Fluorescent microscopy,Fluorescent microscopy,Confocal microscopy,顯示的是一個光學切面,樣品的3D-重建,激光掃描共聚焦顯微鏡主要功能,1、熒光定性 2、熒光定量 3、動態(tài)熒光監(jiān)測 4、斷層掃描 5、三維重構(gòu) 6、共聚焦圖像分析 7、熒光顯微切割,四、激光掃描共聚焦顯微鏡在微生物研究中的應用,4.1 共聚焦在鏈霉菌研究中的應用 1、發(fā)育分化的研究 2、內(nèi)部結(jié)構(gòu)及活性研究 3、菌體大小測量 4
9、、產(chǎn)物合成的研究,鏈霉菌Streptomyces antibioticus 的生長分化,4.2 共聚焦在真菌研究中的應用 1、真菌浸染機制的研究 2、真菌發(fā)育分化的研究 3、真菌生長的研究 4、真菌活性的研究（FDA/PI） 5、真菌的原位研究 6、真菌細胞融合的研究 7、一些機制的研究，如胞吞等,4.3 微生物的群落分析 1、環(huán)境中微生物的分布及活性的原位分析（光學切片功能） 2、食品污染分析,1、熒光原位雜交研究（In situ hybridization） 2、生物膜的研究(bioflim) 3、細菌在植物根部的定植研究 4、細菌的活性分析 5、抗菌分析,4.4 共聚焦顯微鏡的其它相關(guān)的研究,實驗：激光掃描共聚焦顯微基本步驟,1、選擇熒光探針：主要依據(jù)實驗目的，選擇好熒光探針，目前，熒光探針的種類已經(jīng)成千上萬，人們可以根據(jù)所研究問題的不同，選擇不同的熒光探針。 2、樣品染色：染色時間長短與染料及微生物有關(guān)，短的幾分鐘 3、制片：與普通顯微鏡類似，制片后盡快觀察 4、上機觀察：儀器參數(shù)設置,感謝您的關(guān)注！歡迎相互交流！,
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