激光掃描共聚焦顯微鏡.ppt

,激光掃描共聚焦顯微鏡在微生物研究中的應(yīng)用 劉盛榮 2011-09-09,CTC 染色,Baclight Live/Dead 染色,Baclight Live/Dead 染色,激光掃描共聚焦顯微成像,主要內(nèi)容,1、分子熒光的形成 2、微生物研究中常用的熒光染料 3、共聚焦顯微鏡基本原理 4、共聚焦顯微鏡在微生物研究中的應(yīng)用,一、分子熒光的產(chǎn)生,1.1 分子熒光產(chǎn)生的條件 1. 基態(tài)分子受到能量激發(fā)，吸收一定能量后，躍遷至激發(fā)態(tài), 通常為*、n*躍遷 2. 激發(fā)態(tài)分子在很短時(shí)間內(nèi)，以電磁輻射的形式釋放能量并返回基態(tài)，便產(chǎn)生了分子發(fā)光（熒光或磷光）,1.2 影響熒光的因素 1. 溶劑的影響 除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化 2. 溫度的影響 熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化敏感，溫度增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加 3. 溶液pH 對(duì)酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制,二、微生物研究中常用的熒光探針,熒光探針主要基于測(cè)定微生物的某一生理進(jìn)行分類(lèi),1、膜通透性（membrane integrity） 2、代謝活性(metabolic activity) 3、膜電位(membrane potential) 4、酯酶活性(esterase activity) 5、pH 梯度(pH gradient) 6、其它,微生物研究中主要的熒光探針：,1、膜通透性(membrane integrity) BacLight Live/Dead (PI/SYTO9),PI,PI,PI,PI,PI,PI,SYTO9,SYTO9,SYTO9,PI,PI,PI,PI,PI,Viable cell,Damaged cell,SYTO9,SYTO9,鏈霉菌不同發(fā)酵時(shí)期：菌絲活性及內(nèi)部結(jié)構(gòu),Example 1. Staining of Streptomyces sp. with BacLight live/dead L7007,2、代謝活性(metabolic activity),微生物代謝活性分析的熒光探針主要有： 5-Cyano-2.3-ditolyl tetrazolium chloride (CTC) 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazyl)-2,5-diphenyl-2-tetrazolium bromide (MTT) 2-(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium bromide (INT),紅色熒光分子,無(wú)色非熒光分子,Viable cell,CTC的微生物細(xì)胞還原,CTC,CTF,CTF,Example 2: Staining of Streptomyces sp. with CTC,CTC 染色,CTC 染色,3、酯酶活性(esterase activity),工作原理：在活性微生物細(xì)胞酯酶作用下，將非熒光分子水解，釋放出熒光分子并依靠膜的完整性保留于胞內(nèi) 1. Fluorescein diacetate (FDA) 2. 5(6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(CFDA-SE),熒光染料作為底物由酯酶所水解產(chǎn)產(chǎn)生熒光分子,活性微生物細(xì)胞,活性微生物細(xì)胞將其還原為熒光分子并沉淀于 微生物細(xì)胞內(nèi),4、膜電位（membrane potential）,工作原理：活性微生物細(xì)胞可維持細(xì)胞的膜電位，可作為微生物細(xì)胞活性的一個(gè)評(píng)價(jià)的生理指標(biāo) 1. 帶正電荷熒光探針 Rhodamine 123 (Rh123); DiOC6(3) 進(jìn)入活性細(xì)胞 2. 帶負(fù)電荷熒光探針 Bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)-trimethine oxonol DiBAC4(3) 進(jìn)入死細(xì)胞,5、pH熒光探針,工作原理：活性細(xì)胞可以維持胞內(nèi)外一個(gè)合適的pH梯度，因此，測(cè)定微生物細(xì)胞內(nèi)的pH可作為細(xì)胞生理狀態(tài)的一個(gè)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 1. 5(6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(CFDA-SE) 2. Pranine 3. BCECF,一些常見(jiàn)熒光染料的激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng),三、激光掃描共聚焦顯微鏡,3.1 激光掃描共聚焦顯微鏡的組成 顯微鏡光學(xué)系統(tǒng) 掃描裝置 激光光源 檢測(cè)系統(tǒng) 整套儀器由計(jì)算機(jī)控制，各部件之間的操作切換都可在計(jì)算機(jī)操作平臺(tái)界面中方便靈活地進(jìn)行。,3.2 共聚焦成像原理,More Color Possibilities,2. Less Cross Talk（串色）,3.3 激光掃描共聚焦顯微鏡與熒光顯微鏡比較,4. Three-Dimensional Reconstruction of Specimen （三維重構(gòu)）,5. Improved Resolution（更高的分辨率）,3. Optical Sectioning of Objects Without Physical Contact （光學(xué)切片）,Example 3: Comparison of confocal microscopy with fluorescent microscopy,Fluorescent microscopy,Fluorescent microscopy,Confocal microscopy,顯示的是一個(gè)光學(xué)切面,樣品的3D-重建,激光掃描共聚焦顯微鏡主要功能,1、熒光定性 2、熒光定量 3、動(dòng)態(tài)熒光監(jiān)測(cè) 4、斷層掃描 5、三維重構(gòu) 6、共聚焦圖像分析 7、熒光顯微切割,四、激光掃描共聚焦顯微鏡在微生物研究中的應(yīng)用,4.1 共聚焦在鏈霉菌研究中的應(yīng)用 1、發(fā)育分化的研究 2、內(nèi)部結(jié)構(gòu)及活性研究 3、菌體大小測(cè)量 4、產(chǎn)物合成的研究,鏈霉菌Streptomyces antibioticus 的生長(zhǎng)分化,4.2 共聚焦在真菌研究中的應(yīng)用 1、真菌浸染機(jī)制的研究 2、真菌發(fā)育分化的研究 3、真菌生長(zhǎng)的研究 4、真菌活性的研究（FDA/PI） 5、真菌的原位研究 6、真菌細(xì)胞融合的研究 7、一些機(jī)制的研究，如胞吞等,4.3 微生物的群落分析 1、環(huán)境中微生物的分布及活性的原位分析（光學(xué)切片功能） 2、食品污染分析,1、熒光原位雜交研究（In situ hybridization） 2、生物膜的研究(bioflim) 3、細(xì)菌在植物根部的定植研究 4、細(xì)菌的活性分析 5、抗菌分析,4.4 共聚焦顯微鏡的其它相關(guān)的研究,實(shí)驗(yàn)：激光掃描共聚焦顯微基本步驟,1、選擇熒光探針：主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選擇好熒光探針，目前，熒光探針的種類(lèi)已經(jīng)成千上萬(wàn)，人們可以根據(jù)所研究問(wèn)題的不同，選擇不同的熒光探針。 2、樣品染色：染色時(shí)間長(zhǎng)短與染料及微生物有關(guān)，短的幾分鐘 3、制片：與普通顯微鏡類(lèi)似，制片后盡快觀察 4、上機(jī)觀察：儀器參數(shù)設(shè)置,感謝您的關(guān)注！歡迎相互交流！,