2019高考生物大二輪復(fù)習 專題十五 生物技術(shù)實踐學案.doc

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專題十五　生物技術(shù)實踐 考點 考情 1．微生物的分離和培養(yǎng) 2．培養(yǎng)基對微生物的選擇利用 3．運用發(fā)酵加工食品的基本方法及利用微生物進行發(fā)酵來生產(chǎn)特定的產(chǎn)物 4．從生物材料中提取某些特定的成分 　　1．近五年的考題中，對微生物的分離和培養(yǎng)的考查尤為突出，側(cè)重考查微生物的分離純化技術(shù)，對傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的發(fā)酵原理、制作流程等的考查頻度也在不斷提高。對胡蘿卜素的提取僅有2015年卷Ⅰ進行了考查，側(cè)重考查胡蘿卜素的萃取劑的選擇等。 2．常借助某一特定的微生物的分離和培養(yǎng)考查微生物的營養(yǎng)、接種方法等；對于生物技術(shù)在食品加工中的應(yīng)用，常借助發(fā)酵實例考查，填充內(nèi)容多為教材中一些結(jié)論性語句等。植物有效成分的提取的考查也多以教材基礎(chǔ)知識為主。 3．備考時，從以下5個方面來把握： (1)掌握大腸桿菌的純化原理、主要方法及菌種的保存方法。 (2)認真分析教材中兩個微生物分離與計數(shù)的實例，并掌握微生物的篩選及技術(shù)方法。 (3)利用比較法歸納總結(jié)并掌握常見傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的原理、流程及影響因素等。 (4)列表比較玫瑰精油、橘皮精油及胡蘿卜素的提取方法、原理、實驗步驟等異同。 H　 (1)研究和培養(yǎng)微生物的關(guān)鍵是防止雜菌入侵，獲得純凈的培養(yǎng)物。(√) (2)選擇培養(yǎng)基是微生物選擇培養(yǎng)中常用的，它允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他微生物生長。(√) (3)對用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等要進行滅菌，而對實驗操作空間、操作者的衣著等要進行消毒。(√) (4)篩選微生物時要根據(jù)微生物對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋我，如篩選分解尿素的細菌要用尿素作為唯一氮源。(√) (5)統(tǒng)計菌落數(shù)目對細菌進行計數(shù)時可用稀釋涂布平板法進行接種，也可用平板劃線法接種。() (6)篩選纖維素分解菌常用剛果紅染色法，根據(jù)顏色反應(yīng)進行直接篩選。(√) (7)酵母菌是兼性厭氧微生物，在有氧條件下，能進行有氧呼吸，大量繁殖；在無氧條件下，能進行酒精發(fā)酵。(√) (8)制作果酒或果醋的發(fā)酵液和發(fā)酵瓶要嚴格滅菌。() (9)制作腐乳所加的鹽和鹵湯都能抑制微生物的生長，因此制作腐乳不需要嚴格的滅菌操作。(√) (10)常用比色法測定泡菜中亞硝酸鹽含量。(√) (11)橘皮精油主要貯藏在橘皮部分，橘皮精油的有效成分在水蒸氣蒸餾時會發(fā)生部分水解，而使用水中蒸餾又會產(chǎn)生原料焦糊問題，所以一般采用壓榨法。(√) (12)胡蘿卜素易溶于有機溶劑，可以采用萃取的方法進行提取。(√) (13)通過花藥培養(yǎng)產(chǎn)生花粉植株一般有兩種途徑，這兩種途徑之間沒有絕對的界限，主要取決于培養(yǎng)基中激素的種類及其濃度配比。(√) (14)利用DNA溶液遇二苯胺沸水浴加熱變藍的特性對DNA進行鑒定。(√) 考向一　微生物的培養(yǎng)利用 Z　 1．(2018全國卷Ⅰ)將馬鈴薯去皮切塊，加水煮沸一定時間，過濾得到馬鈴薯浸出液。在馬鈴薯浸出液中加入一定量蔗糖和瓊脂，用水定容后滅菌，得到M培養(yǎng)基。 回答下列問題： (1)M培養(yǎng)基若用于真菌的篩選，則培養(yǎng)基中應(yīng)加入鏈霉素以抑制__細菌__的生長，加入了鏈霉素的培養(yǎng)基屬于__選擇__培養(yǎng)基。 (2)M培養(yǎng)基中的馬鈴薯浸出液為微生物生長提供了多種營養(yǎng)物質(zhì)，營養(yǎng)物質(zhì)類型除氮源外還有__碳源、無機鹽__(答出兩點即可)。氮源進入細胞后，可參與合成的生物大分子有__蛋白質(zhì)、核酸__(答出兩點即可)。 (3)若在M培養(yǎng)基中用淀粉取代蔗糖，接種土壤濾液并培養(yǎng)，平板上長出菌落后可通過加入顯色劑篩選出能產(chǎn)淀粉酶的微生物。加入的顯色劑是__碘液__，該方法能篩選出產(chǎn)淀粉酶微生物的原理是__淀粉遇碘液顯藍色，產(chǎn)淀粉酶的菌落周圍淀粉被水解，形成透明圈__。 (4)甲、乙兩位同學用稀釋涂布平板法測定某一土壤樣品中微生物的數(shù)量，在同一稀釋倍數(shù)下得到以下結(jié)果： 甲同學涂布了3個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是110、140和149，取平均值133； 乙同學涂布了3個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是27、169和176，取平均值124。 有人認為這兩位同學的結(jié)果中，乙同學的結(jié)果可信度低，其原因是__乙同學的結(jié)果中，1個平板的計數(shù)結(jié)果與另2個相差懸殊，結(jié)果的重復(fù)性差__。 [解析]　(1)鏈霉素是抗生素，可抑制細菌生長，故在M培養(yǎng)基中加入鏈霉素作為選擇培養(yǎng)基，可篩選出真菌。 (2)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分一般包括碳源、氮源、水和無機鹽等。細胞中含有氮元素的生物大分子有蛋白質(zhì)、核酸等，故所加入的氮源可參與以上物質(zhì)的合成。 (3)能產(chǎn)生淀粉酶的微生物可將淀粉分解成麥芽糖，淀粉遇碘變藍，向加有淀粉的培養(yǎng)基中加入碘液后培養(yǎng)基呈現(xiàn)藍色，產(chǎn)淀粉酶的菌落周圍的淀粉被水解，形成透明圈，可根據(jù)透明圈的大小判斷產(chǎn)生淀粉酶的多少。 (4)統(tǒng)計菌落數(shù)時一般選擇菌落數(shù)在30～300個的平板，甲同學統(tǒng)計的3個平板中的菌落數(shù)在正常范圍內(nèi)且差距不大，比較準確；乙同學統(tǒng)計的3個平板中，1個平板的計數(shù)結(jié)果與另2個相差懸殊，結(jié)果的重復(fù)性差。 2．(2018全國卷Ⅱ)在生產(chǎn)、生活和科研實踐中，經(jīng)常通過消毒和滅菌來避免雜菌的污染。 回答下列問題： (1)在實驗室中，玻璃和金屬材質(zhì)的實驗器具__可以__(填“可以”或“不可以”)放入干熱滅菌箱中進行干熱滅菌。 (2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高溫瞬時消毒法，與煮沸消毒法相比，這兩種方法的優(yōu)點是__在達到消毒目的的同時，營養(yǎng)物質(zhì)損失較少__。 (3)密閉空間內(nèi)的空氣可采用紫外線照射消毒，其原因是紫外線能__破壞DNA結(jié)構(gòu)__。在照射前，適量噴灑__消毒液__，可強化消毒效果。 (4)水廠供應(yīng)的自來水通常是經(jīng)過__氯氣__(填“氯氣”“乙醇”或“高錳酸鉀”)消毒的。 (5)某同學在使用高壓蒸汽滅菌鍋時，若壓力達到設(shè)定要求，而鍋內(nèi)并沒有達到相應(yīng)溫度，最可能的原因是__未將鍋內(nèi)冷空氣排盡__。 [解析]　(1)干熱滅菌是指將物品放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170℃條件下加熱1～2h。耐高溫、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培養(yǎng)皿)和金屬用具等，可采用干熱滅菌的方法。 (2)巴氏消毒法是在70～75℃條件下煮30min或在80℃條件下煮15min，可以殺死牛奶中的微生物，并且使牛奶的營養(yǎng)物質(zhì)損失較少。 (3)接種室、接種箱或超凈工作臺在使用前，可以用紫外線照射30min，紫外線能破壞微生物的DNA結(jié)構(gòu)，以殺死物體表面或空氣中的微生物。在照射前，適量噴灑石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以強化消毒效果。 (4)自來水通常是用氯氣進行消毒的。 (5)在使用高壓蒸汽滅菌鍋時，若壓力達到設(shè)定要求，而鍋內(nèi)并沒有達到相應(yīng)溫度，最可能的原因是鍋內(nèi)原有的冷空氣沒有排盡。 3．(2017全國卷Ⅰ)某些土壤細菌可將尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列問題： (1)有些細菌能分解尿素，有些細菌則不能，原因是前者能產(chǎn)生__脲酶__。能分解尿素的細菌不能以尿素的分解產(chǎn)物CO2作為碳源，原因是__分解尿素的細菌是異養(yǎng)生物，不能利用CO2來合成有機物__。但可用葡萄糖作為碳源，進入細菌體內(nèi)的葡萄糖的主要作用是__為細胞生命活動提供能量，為其他有機物的合成提供原料__(答出兩點即可)。 (2)為了篩選可分解尿素的細菌，在配制培養(yǎng)基時，應(yīng)選擇__尿素__(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作為氮源，不選擇其他兩組的原因是__其他兩組都含有NH4NO3，能分解尿素的細菌和不能分解尿素的細菌都能利用NH4NO3，不能起到篩選作用__。 (3)用來篩選分解尿素細菌的培養(yǎng)基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有__為細菌生長提供無機營養(yǎng)，作為緩沖劑保持細胞生長過程中pH穩(wěn)定__(答出兩點即可)。 [解析]　(1)土壤中的某些細菌之所以能夠分解尿素，是因為它們能產(chǎn)生脲酶。尿素分解菌是異養(yǎng)生物，不能利用CO2來合成有機物，必須利用現(xiàn)成的有機物(如葡萄糖)作為碳源；葡萄糖通過呼吸作用被分解時，能為細胞生命活動提供能量，同時，葡萄糖還可以轉(zhuǎn)化成脂肪、某些氨基酸等物質(zhì)，所以進入細菌體內(nèi)的葡萄糖能為其他有機物的合成提供原料。(2)選擇培養(yǎng)基是只允許特定種類的微生物(目的微生物)生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。本實驗的目的菌是可分解尿素的細菌，因此，配制的培養(yǎng)基應(yīng)只允許尿素分解菌生長，NH4NO3以作為所有細菌的氮源，培養(yǎng)基中如含有NH4NO3，將不能起到篩選作用。(3)KH2PO4和Na2HPO4能為細菌生長提供鉀鹽、鈉鹽和磷酸鹽，而H2PO/HPO可以使培養(yǎng)基中pH保持相對穩(wěn)定。 4．(2017全國卷Ⅱ)豆豉是大豆經(jīng)過發(fā)酵制成的一種食品。為了研究影響豆豉發(fā)酵效果的因素，某小組將等量的甲、乙兩菌種分布接入等量的A、B兩桶煮熟大豆中并混勻，再將兩者置于適宜條件下進行發(fā)酵，并在32h內(nèi)定期取樣觀測發(fā)酵效果?；卮鹣铝袉栴}： (1)該實驗的自變量是__菌種__、__發(fā)酵時間__。 (2)如果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵容器內(nèi)上層大豆的發(fā)酵效果比底層的好，說明該發(fā)酵菌是__好氧菌__。 (3)如果在實驗后，發(fā)現(xiàn)32h內(nèi)的發(fā)酵效果越來越好，且隨發(fā)酵時間呈直線上升關(guān)系，則無法確定發(fā)酵的最佳時間；若要確定最佳發(fā)酵時間，還需要做的事情是__延長發(fā)酵時間，觀測發(fā)酵效果，最好的發(fā)酵效果所對應(yīng)的時間即為最佳發(fā)酵時間__。 (4)從大豆到豆豉，大豆中的成分會發(fā)生一定的變化，其中，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)開_氨基酸和肽__，脂肪轉(zhuǎn)變?yōu)開_脂肪酸和甘油__。 [解析]　(1)實驗使用甲、乙兩種菌種，并在32h內(nèi)定期取樣觀測發(fā)酵效果，所以該實驗的自變量是菌種和發(fā)酵時間。(2)如果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵容器內(nèi)上層大豆的發(fā)酵效果比底層的好，說明該發(fā)酵菌是好氧型微生物。(3)如果在實驗后，發(fā)現(xiàn)32h內(nèi)的發(fā)酵效果越來越好，且隨發(fā)酵時間呈直線上升關(guān)系，則無法確定發(fā)酵的最佳時間；若要確定最佳發(fā)酵時間，還需要做的事情是延長取樣觀測時間，觀測發(fā)酵結(jié)果，最好的發(fā)酵效果所對應(yīng)的時間即為最佳發(fā)酵時間。(4)從大豆到豆豉，在相關(guān)微生物的作用下，大豆中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)殡暮桶被?，脂肪轉(zhuǎn)變?yōu)楦视秃椭舅帷? H　 1．理清微生物培養(yǎng)的五種基本方法(填空) (1)培養(yǎng)基的制備：計算→__稱量__→溶化→__滅菌__→倒平板。 (2)無菌技術(shù)：主要包括__消毒__和__滅菌__。 (3)倒平板操作：待培養(yǎng)基冷卻至__50℃__左右時，在__酒精燈火焰__附近倒平板。 (4)平板劃線操作：平板劃線法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面__連續(xù)劃線__的操作，將聚集的菌種__逐步稀釋__分散到培養(yǎng)基的表面。劃線時應(yīng)注意劃線的方法(如圖)。 (5)稀釋涂布平板法：先將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成__單個的菌落__。 2．熟記微生物分離與計數(shù)的兩個實例(填空) (1)土壤中分解尿素細菌的分離、計數(shù)： ①篩選：選擇培養(yǎng)基。 ②分離：土壤取樣→__樣品稀釋__→微生物的培養(yǎng)與觀察。 ③計數(shù)：__活菌計數(shù)法__和顯微鏡直接計數(shù)法。 (2)分解纖維素的微生物的分離： ①篩選原理： ②流程： 土壤取樣→選擇培養(yǎng)→梯度稀釋→涂布平板→挑選菌落 3．比較記憶果酒、果醋、腐乳和泡菜的制作(填表) 項目 內(nèi)容 果酒和果醋 的制作 腐乳制作 制作泡菜并檢測 亞硝酸鹽含量 作用 菌種 果酒：①__酵母菌__ 果醋：②__醋酸菌__ ③__毛霉__ ④__乳酸菌__ 原理 (1)酵母菌在無氧條件下將葡萄糖氧化成乙醇 (2)醋酸菌在有氧條件下將乙醇氧化為醋酸 毛霉將蛋白質(zhì)、脂肪分解成⑤__小分子有機物__ 乳酸菌將葡萄糖分解為乳酸 原料 選擇 ⑥__新鮮葡萄__(或蘋果) ⑦__豆腐__ 大白菜、花椰菜等新鮮干凈的蔬菜 實驗流程 挑選葡萄 ↓ ⑧__沖洗__ ↓ ⑨__榨汁__ ↓ 酒精　醋酸 → 發(fā)酵　發(fā)酵 ↓　↓ 果酒　果醋 讓豆腐長出 ⑩__毛霉__ ↓ 加鹽腌制 ↓ 加鹵湯裝瓶 ↓ 密封腌制 T　 題型1　微生物的培養(yǎng)和應(yīng)用 1．(2016全國卷Ⅰ)空氣中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小組欲用平板收集教室空氣中的微生物，以了解教室內(nèi)不同高度空氣中微生物的分布情況。實驗步驟如下： ①配置培養(yǎng)基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)； ②制作無菌平板； ③設(shè)置空白對照組和若干實驗組，進行相關(guān)操作； ④將各組平板置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)一段時間，統(tǒng)計各組平板上菌落的平均數(shù)。 回答下列問題： (1)該培養(yǎng)基中微生物所需的氮來源于__牛肉膏、蛋白胨__。若要完成步驟②，該培養(yǎng)基中的成分X通常是__瓊脂__。 (2)步驟③中，實驗組的操作是__將實驗組平板分別放置在教室不同高度的位置上，開蓋暴露一段時間__。 (3)若在某次調(diào)查中，某一實驗組平板上菌落平均數(shù)為36個/平板，而空白對照組的一個平板上出現(xiàn)了6個菌落，這種結(jié)果說明在此次調(diào)查中出現(xiàn)了__污染__現(xiàn)象。若將30(即36－6)個/平板作為本組菌落數(shù)的平均值，該做法__不正確__(填“正確”或“不正確”)。 [解析]　(1)牛肉膏、蛋白胨都含有N，可為微生物的生長提供氮源。制作無菌平板所用培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基，因此X應(yīng)為瓊脂。(2)由實驗?zāi)康目芍?，該實驗的自變量為教室的不同高度，因變量為微生物的分布情況，故實驗組的操作應(yīng)為將實驗組平板分別放置在教室不同高度的位置上，開蓋暴露一段時間。(3)空白培養(yǎng)基上出現(xiàn)菌落，說明培養(yǎng)基被污染了，即調(diào)查中出現(xiàn)了污染現(xiàn)象。實驗過程中若培養(yǎng)基被污染，必須將其拋棄，重新制作新的培養(yǎng)基進行實驗。 2．(2018鄭州二模)臨床實驗表明，服用乳酸菌及其制品具有減少人體血清膽固醇含量、降低心腦血管發(fā)病率的功效。下面是從酸奶中篩選出高效降低膽固醇的乳酸菌的實驗，請回答下列問題： (1)制備固體培養(yǎng)基(MRS)：在普通的液體培養(yǎng)基中添加碳酸鈣和__瓊脂__，加熱使其熔化，然后轉(zhuǎn)移到錐形瓶中。經(jīng)__高壓蒸汽滅菌__法處理后，待其冷卻至50℃左右，在酒精燈火焰附近倒平板。 (2)將少量酸奶制成1︰10稀釋液，再將梯度稀釋到10－6的稀釋液涂布于添加了碳酸鈣的乳酸菌培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)平板上，在__無氧__(填“有氧”或“無氧”)條件下37℃恒溫培養(yǎng)72h。挑取__有__(填“有”或“無”)溶鈣圈(或透明圈)的菌落，用__平板劃線__法接種在MRS培養(yǎng)基上反復(fù)純化至純種備用。 (3)在普通的MRS液體培養(yǎng)基中添加適量__膽固醇__并用超聲波振蕩乳化20min，調(diào)pH至7.0，然后將純化后的乳酸菌菌株接種到高膽固醇培養(yǎng)液中培養(yǎng)，一段時間后用特定顯色劑分光光度法離心測定上清液中__膽固醇__的含量，以__未接種的高膽固醇培養(yǎng)液__作為對照，測定菌株降低膽固醇的能力，篩選出目的菌株。 [解析]　(1)在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑瓊脂后，制成瓊脂固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基應(yīng)使用高壓蒸汽滅菌法。(2)乳酸菌是厭氧微生物，需在無氧條件下培養(yǎng)。乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物為乳酸，乳酸溶解碳酸鈣，產(chǎn)生透明圈，所以能產(chǎn)生透明圈的菌落為乳酸菌菌落，挑取后，用平板劃線法接種純化培養(yǎng)。(3)要從酸奶中篩選出高效降低膽固醇的乳酸菌，需在培養(yǎng)基中添加適量的膽固醇，接種培養(yǎng)后測定膽固醇的含量，并與未接種的高膽固醇培養(yǎng)液比較，測定菌株降低膽固醇的能力，篩選出目的菌株。 易錯警示 有關(guān)選擇培養(yǎng)基選擇方法的3個錯混點 (1)在培養(yǎng)基中加入某種化學物質(zhì)。例如，加入青霉素可以分離出酵母菌和霉菌；加入高濃度的食鹽可以得到金黃色葡萄球菌。這里的加入是在主要營養(yǎng)成分完整的基礎(chǔ)上進行的。 (2)改變培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分。例如缺乏氮源時可以分離出固氮微生物；石油作為唯一碳源時，可以分離出能消除石油污染的微生物。 (3)改變微生物的培養(yǎng)條件。例如，將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境下培養(yǎng)，可以得到耐高溫的微生物。 題型2　傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用 3．(2016天津卷)天津獨流老醋歷史悠久、獨具風味，其生產(chǎn)工藝流程如下圖。 (1)在糖化階段添加酶制劑需要控制反應(yīng)溫度，這是因為酶__在最適溫度條件下催化能力最強__。 (2)在酒精發(fā)酵階段，需添加酵母菌。在操作過程中，發(fā)酵罐先通氣，后密閉。通氣能提高__酵母菌__的數(shù)量，有利于密閉時獲得更多的酒精產(chǎn)物。 (3)在醋酸發(fā)酵階段，獨流老醋采用獨特的分層固體發(fā)酵法，發(fā)酵30天。工藝如下。 ①發(fā)酵過程中，定期取樣測定醋酸桿菌密度變化，趨勢如下圖。據(jù)圖分析，與顛倒前相比，B層醋酸桿菌在顛倒后密度變化的特點是__先快速增長后趨于穩(wěn)定__，由此推測，影響醋酸桿菌密度變化的主要環(huán)境因素是__氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)、pH__。 ②乳酸含量高是獨流老醋風味獨特的重要成因。發(fā)酵過程中，發(fā)酵缸中__顛倒前的B層和顛倒后的A(或不翻動，或下)__層醋醅有利于乳酸菌繁殖，積累乳酸。 ③成熟醋醅中乳酸菌的種類明顯減少，主要原因是發(fā)酵后期營養(yǎng)物質(zhì)消耗等環(huán)境因素的變化，加劇了不同種類乳酸菌的__種間競爭(或競爭)__，淘汰了部分乳酸菌種類。 [解析]　(1)酶在最適溫度、最適pH等條件下催化能力最強，所以添加酶制劑需要控制溫度。(2)酵母菌在有氧條件下能大量繁殖，增加酵母菌數(shù)量，有利于密閉階段在無氧條件下獲得更多酒精產(chǎn)物，因而發(fā)酵初期應(yīng)先通氣。(3)①由圖示可知與顛倒前相比，第15天A、B層顛倒后，B層醋酸桿菌先快速增長后趨于穩(wěn)定，顛倒后B層不斷翻動，與顛倒前相比，能接觸更多氧氣，醋酸桿菌大量繁殖，說明影響醋酸桿菌密度變化的環(huán)境因素有氧氣，后來隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗及pH的降低，醋酸桿菌數(shù)量趨于穩(wěn)定，說明影響醋酸桿菌密度變化的主要環(huán)境因素有營養(yǎng)物質(zhì)、pH等。②顛倒前的B層和顛倒后的A層(即下層)缺氧，有利于乳酸菌繁殖，積累乳酸。③發(fā)酵后期營養(yǎng)物質(zhì)的消耗使不同種類的乳酸菌種間競爭加劇，淘汰了部分種類的乳酸菌。 4．(2018遼寧部分重點中學模擬)近年來，紀錄片《舌尖上的中國》引發(fā)全民關(guān)注美食的熱潮，其中講述了利用不同微生物的發(fā)酵作用制作的各種各樣的美味食品。請分析回答下列問題。 (1)在果醋制作時，醋酸菌在__氧氣__和糖源都充足時，將糖分解成醋酸；在糖源不充足時，也可以利用酒精生成醋酸，請寫出該過程的化學反應(yīng)式：__C2H5OH＋O2→CH3COOH＋H2O__。 (2)腐乳制作的流程：讓豆腐上長出毛霉→加鹽腌制→加鹵湯裝瓶→密封腌制。用鹽腌制時，應(yīng)注意控制__鹽的用量__；配制鹵湯時，要使鹵湯中酒的含量控制在__12__%左右。 (3)制作泡菜的原理是__乳酸菌在無氧的環(huán)境下大量繁殖，將葡萄糖分解成乳酸__。蔬菜在腌制過程中，會產(chǎn)生亞硝酸鹽，在__鹽酸酸化__條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸發(fā)生__重氮化__反應(yīng)后，與N－1－萘基乙二胺鹽酸鹽結(jié)合形成__玫瑰紅__色染料。 易錯警示 有關(guān)果酒和果醋的制作步驟的3個錯混點 (1)材料的選擇與處理 選擇新鮮的葡萄，榨汁前先沖洗后除去枝梗，以避免去除枝梗時引起葡萄破損，增加被雜菌污染的機會。 (2)防止發(fā)酵液被污染 需要從發(fā)酵制作的過程進行全面的考慮，因為操作的每一步都可能混入雜菌。為避免雜菌污染：榨汁機要洗凈并晾干；發(fā)酵裝置要洗凈并用70%的酒精消毒；果酒制作時封閉充氣口；若用簡易的發(fā)酵裝置，每隔一定時間排氣時只需擰松瓶蓋，不要完全揭開瓶蓋等。果醋制作時，要通過充氣口不斷通入無菌空氣。 (3)控制好發(fā)酵時間與溫度，果酒制作時適時放氣。 考向二　植物有效成分的提取 Z　 　(2017全國卷Ⅲ)綠色植物甲含有物質(zhì)W，該物質(zhì)為無色針狀晶體，易溶于極性有機溶劑，難溶于水，且受熱、受潮易分解。其提取流程為：植物甲→粉碎→加溶劑→振蕩→收集提取液→活性炭處理→過濾去除活性炭→蒸餾(含回收溶劑)→重結(jié)晶→成品?；卮鹣铝袉栴}： (1)在提取物質(zhì)W時，最好應(yīng)選用的一種原料是__晾干__(填“高溫烘干”“晾干”或“新鮮”)的植物甲，不宜選用其他兩種的原因是__高溫烘干過程中，植物甲中的物質(zhì)W易被破壞；新鮮的植物甲含水量高，用于提取的極性有機溶劑會被水稀釋，進而降低對物質(zhì)W的提取效果__。 (2)提取物質(zhì)W時，振蕩的作用是__使原料和溶劑充分混勻__。 (3)活性炭具有很強的吸附能力，在提取過程中，用活性炭處理提取液的目的是__去除提取液中的色素__。 (4)現(xiàn)有丙酮(沸點56℃)、乙醇(沸點約78℃)兩種溶劑，在提取物質(zhì)W時，應(yīng)選用丙酮作為提取劑，理由是__丙酮沸點低于乙醇，蒸餾時物質(zhì)W分解較少__。 (5)該實驗操作過程中應(yīng)注意的事項是__在溫度較低的情況下操作，防火__(答出兩點即可)。 [解析]　(1)依據(jù)題于信息，物質(zhì)W受熱、受潮易分解，因此不宜選擇高溫烘干，而新鮮的植物甲含水量高，用于提取的極性有機溶劑會被水稀釋，進而降低對物質(zhì)W的提取效果，故不應(yīng)選用新鮮的植物甲。(2)提取物質(zhì)W時，振蕩可以使原料和所加有機溶劑充分混勻。(3)利用活性炭的吸附能力，可以去除提取液中植物甲所含的色素，從而得到較為純凈的物質(zhì)W與有機溶劑的混合物。(4)丙酮沸點低于乙醇，蒸餾時物質(zhì)W分解較少。(5)物質(zhì)W容易受熱分解，因此蒸餾操作適宜在較低的溫度下進行，同時因?qū)嶒炛惺褂昧擞袡C溶劑，要注意防火。 H　 1．植物有效成分提取的3種方法的比較 提取方法 實驗原理 適用范圍 水蒸氣 蒸餾法 利用水蒸氣將揮發(fā)性較強的植物芳香油攜帶出來，形成油水混合物，冷卻后，混合物又會重新分出油層和水層 適用于提取玫瑰油、薄荷油等__揮發(fā)性__強的芳香油 壓榨法 通過機械加壓，壓榨出果皮中的芳香油 適用于柑橘、檸檬等易__焦糊__原料中芳香油的提取 有機溶 劑萃取 使芳香油溶解在有機溶劑中，蒸發(fā)溶劑后就可獲得芳香油 適用范圍廣，要求原料的顆粒要盡可能細小，能充分溶解在有機溶劑中 2．識記植物有效成分提取的實驗流程 (1)提取玫瑰精油的實驗流程鮮玫瑰花＋清水(1︰4)→水蒸氣蒸餾→油水混合物分離油層除水玫瑰油。 (2)提取橘皮精油的實驗流程 石灰水浸泡橘皮→漂洗→__壓榨__→__過濾__→靜置→再次過濾→橘皮油。 (3)提取胡蘿卜素的實驗流程 胡蘿卜→粉碎→干燥→__萃取__→__過濾__→濃縮→胡蘿卜素。 T　 題型1　考查植物有效成分提取的原理和方法 1．(2018重慶一中月考)研究發(fā)現(xiàn)柚皮精油具有抑菌、抑制腫瘤等作用，是一種具有廣闊開發(fā)前景的芳香油資源。青蒿素是目前公認的最有效治療瘧疾的藥物，易溶于有機溶劑，60℃以上易分解。回答下列問題。 (1)柚皮精油可采用水蒸氣蒸餾法提取，它是利用__水蒸氣__將__揮發(fā)性__較強的柚皮精油攜帶出來，形成油水混合物。在油水混合物中，加入__NaCl__可使油水出現(xiàn)明顯分層；分離得到的油層應(yīng)加入__無水Na2SO4__進行除水。 (2)水蒸氣蒸餾易使柚皮精油的有效成分部分水解，為避免此缺點，可采用__壓榨__法提取柚皮精油。為提高出油率，需先對柚皮進行的處理是__用石灰水浸泡__，以分解果膠。 (3)青蒿素宜采用萃取法提取，現(xiàn)有四氯化碳(沸點76.5℃)和乙醚(沸點34.5℃)兩種溶劑，應(yīng)選用__乙醚__作為萃取劑，不選用另外一種的理由是__青蒿素在60_℃以上易分解，應(yīng)選擇低沸點的萃取劑__。 題型2　結(jié)合其他生物技術(shù)考查植物有效成分提取及應(yīng)用 2．已知天然胡蘿卜素是防癌抗癌食品、保健品和藥品。作為保健品食用，可醫(yī)治維生素A缺乏癥、皮膚病、抗光敏癥等疾病?？茖W研究證明，胡蘿卜素能防治或延緩癌癥，是具有增強免疫功能的藥物和飲料添加劑。請根據(jù)上述材料及所學知識，回答下列問題。 (1)胡蘿卜葉中也有胡蘿卜素，胡蘿卜素在光合作用中主要吸收的光是__藍紫光__，用紙層析法分離綠葉中的色素時，胡蘿卜素在濾紙條的位置是從下至上的第__4__條。為了提高胡蘿卜營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，炒胡蘿卜時最好多放一些油，主要原因是__胡蘿卜素是脂溶性色素，易溶于有機溶劑中__。 (2)新鮮的胡蘿卜含有大量的水分，在胡蘿卜素的提取過程中，要對新鮮的胡蘿卜進行干燥，但是干燥溫度過高會導(dǎo)致__胡蘿卜素分解__。 (3)胡蘿卜素的萃取劑應(yīng)該具有的特點是__較高的沸點__，所以不選用酒精和丙酮；同時還應(yīng)該具有的特點是__不與水混溶__，所以一般選擇石油醚而不選擇乙醚。 1．某研究小組嘗試制作藍莓果酒和藍莓果醋，并探討提取花青素的方法。請回答下列問題： (1)為提高果酒的品質(zhì)，需先獲得純凈的酵母菌菌種。吸取1mL酵母菌樣液，在105稀釋倍數(shù)下統(tǒng)計各平板上生長的平均菌落數(shù)為32，涂布時所用稀釋液體積為0.1mL，則每mL樣液中的菌株數(shù)＝__3.2107__個。 (2)釀制藍莓果酒前不需要對藍莓進行嚴格的消毒以除去雜菌，這是因為在__缺氧、呈酸性__條件下，絕大多數(shù)微生物因無法適應(yīng)這一環(huán)境而受抑制。發(fā)酵時一般要先通氣，其目的是__酵母菌可在有氧條件下大量繁殖__。果汁發(fā)酵后是否有酒精產(chǎn)生，可在酸性條件下用橙色的__重鉻酸鉀__進行檢驗，若溶液顏色變成__灰綠色__證明有酒精存在。 (3)釀制成功的藍莓果酒如果暴露在空氣中酒味會逐漸消失而出現(xiàn)酸味，尤其是氣溫高的夏天，其原因是__醋酸菌在有氧條件下，產(chǎn)生大量醋酸(合理敘述給分)__。 (4)查閱資料得知，花青素是水溶性色素。在pH小于3.0條件下比較穩(wěn)定，在60℃以下熱穩(wěn)定性較好。溶劑萃取法是最常用提取方法，萃取劑宜選用__乙醇__(乙醇/乙醚)，將萃取相關(guān)過程的pH控制在__3__左右可有效地保障萃取成功。 [解析]　(1)為提高果酒的品質(zhì)，需先獲得純凈的酵母菌菌種。吸取1mL酵母菌樣液，在105稀釋倍數(shù)下統(tǒng)計各平板上生長的平均菌落數(shù)為32，涂布時所用稀釋液體積為0.1mL，則每mL樣液中的菌株數(shù)＝320.1105＝3.2107個。(2)釀制藍莓果酒前不需要對藍莓進行嚴格的消毒以除去雜菌，這是因為在缺氧、呈酸性條件下，絕大多數(shù)微生物因無法適應(yīng)這一環(huán)境而受抑制。發(fā)酵時一般要先通氣，其目的是酵母菌可在有氧條件下大量繁殖。果汁發(fā)酵后是否有酒精產(chǎn)生，可在酸性條件下用橙色的重鉻酸鉀進行檢驗，若溶液顏色變成灰綠色證明有酒精存在。(3)釀制成功的藍莓果酒如果暴露在空氣中酒味會逐漸消失而出現(xiàn)酸味，尤其是氣溫高的夏天，其原因是醋酸菌在有氧條件下，產(chǎn)生大量醋酸。(4)花青素是水溶性色素。在pH小于3.0條件下比較穩(wěn)定，在60℃以下熱穩(wěn)定性較好。溶劑萃取法是最常用提取方法，萃取劑宜選用乙醇，將萃取相關(guān)過程的pH控制在3左右可有效地保障萃取成功。 2．(2018河北省衡水中學一模)為了分離和純化高效分解石油的細菌，科研人員利用被石油污染過的土壤進行如圖A所示的實驗。請回答下列問題： (1)配制好的培養(yǎng)基通常使用__高壓蒸汽滅菌__法滅菌。步驟③與步驟②中培養(yǎng)基成分相比，最大的區(qū)別是__步驟③的培養(yǎng)基中石油是唯一碳源__。 (2)同學甲進行步驟④的操作，其中一個平板經(jīng)培養(yǎng)后的菌落分布如圖B所示。該同學的接種方法是__稀釋涂布平板法__，出現(xiàn)圖B結(jié)果可能的操作失誤是__涂布不均勻__。 (3)同學乙也按照同學甲的接種方法進行了步驟④的操作：將1mL樣品稀釋100倍，在3個平板上分別接入0.1mL稀釋液；經(jīng)適當培養(yǎng)后，3個平板上的菌落數(shù)分別為56、58和57。據(jù)此可得出每升樣品中的活菌數(shù)為__5.7107__個。 (4)步驟⑤需要振蕩培養(yǎng)，原因是__使石油分布均勻，與細菌充分接觸，有利于細菌的繁殖(答案合理即可)__。 (5)步驟⑤后取樣測定石油含量的目的是__篩選出分解石油能力最強的細菌__。 [解析]　(1)培養(yǎng)基的滅菌方法常采用高壓蒸汽滅菌法。步驟③的培養(yǎng)基中石油是唯一的碳源，步驟②會有其他有機物作為碳源。(2)圖B中的菌落不是呈線形分布，所以采用的接種方法應(yīng)是稀釋涂布平板法。圖B中的菌落分布不均勻，應(yīng)是操作中涂布不均勻引起的。(3)三個平板中的菌落數(shù)分別是56、57、58，取平均值得57，每升樣品中的活菌數(shù)目＝57101001000＝5.7107(個)。(4)步驟⑤應(yīng)進行振蕩培養(yǎng)，其目的是使加入的石油分布均勻，石油與細菌充分接觸，有利于細菌的繁殖。(5)步驟⑤后取樣測定石油的含量，可以得到被細菌分解的情況，如果含石油越少，則說明細菌分解的石油越多，這樣可以篩選出分解石油能力最強的細菌。 3．我國最早的詩集《詩經(jīng)》中有“田中有廬，疆場有瓜是剝是菹”的詩句，其中“廬”和“瓜”是蔬菜，“剝”和“菹”是腌制加工的意思。泡菜是一種歷史悠久、深受群眾喜愛的傳統(tǒng)美食。某興趣小組的同學進行了制作泡菜的實踐活動。 回答下列問題： (1)按清水與鹽質(zhì)量比為4︰1的比例制好鹽水后，需將鹽水煮沸，其作用是__除去鹽水中的氧氣和殺菌__。 (2)為測定泡菜中亞硝酸鹽含量，首先要配制__亞硝酸鹽__標準顯色液，并與樣品進行比較。泡菜制作的第3～5天亞硝酸鹽含量較高不宜食用，原因是__適宜的pH、溫度和一定微生物作用下亞硝酸鹽轉(zhuǎn)變成致癌物質(zhì)亞硝胺__。 (3)若將稀釋105倍的某細菌菌液，用直接計數(shù)法和稀釋涂布平板法進行計數(shù)。 ①直接計數(shù)法：用吸管吸取0.1mL該菌液，滴于血球計數(shù)板上的__蓋玻片__邊緣，待該細菌全部沉降到計數(shù)室底部，用顯微鏡直接計數(shù)。并計算出每升菌液的細菌數(shù)目。 ②稀釋涂布平板法計數(shù)：在五個固體培養(yǎng)基上分別接種0.1mL該細菌菌液，適宜條件下培養(yǎng)一段時間后，培養(yǎng)基上的菌落數(shù)分別為：20、40、152、154、156，則每升菌液中細菌數(shù)量為__1.2551011__個。 ③正常操作情況下，上述兩種計數(shù)法中，__直接計數(shù)法__統(tǒng)計獲得的數(shù)目偏多，原因是__直接計數(shù)法無論菌體死活均被計數(shù)，而稀釋涂布平板法當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落(合理答案給分)__。 [解析]　(1)按清水與鹽質(zhì)量比為4︰1的比例制好鹽水后，需將鹽水煮沸，其作用是除去鹽水中的氧氣和殺菌。(2)為測定泡菜中亞硝酸鹽含量，首先要配制亞硝酸鹽標準顯色液，并與樣品進行比較，泡菜制作的第3～5天亞硝酸鹽含量較高不宜食用，原因是適宜的pH、溫度和一定微生物作用下亞硝酸鹽轉(zhuǎn)變成致癌物質(zhì)亞硝胺。(3)若將稀釋105倍的某細菌菌液，用直接計數(shù)法和稀釋涂布平板法進行計數(shù)。①直接計數(shù)時，應(yīng)先蓋蓋玻片，再在蓋玻片的邊緣滴加培養(yǎng)液。②稀釋涂布平板法計數(shù)時，為了保證結(jié)果準確，一般選擇菌落數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)，因此每升菌液中細菌數(shù)量＝(40＋154＋156＋152)40.1105103＝1.2551011個。③由于直接計數(shù)法無論菌體死活均被計數(shù)，而稀釋涂布平板法當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落，上述兩種計數(shù)法中，直接計數(shù)法統(tǒng)計獲得的細菌數(shù)量偏多，而稀釋涂布平板法統(tǒng)計獲得的細菌數(shù)量偏少。 4．(2018東北三省三校一模)為了對柑橘綜合利用，某研究人員做以下實驗： 請回答以下問題： (1)橘皮精油__無__色，主要成分是__檸檬烯__。本實驗用到的植物芳香油提取方法為__水蒸氣蒸餾和壓榨__。 (2)若要計算提取精油的出油率，需要稱量__芳香油和原料__的質(zhì)量。對比發(fā)現(xiàn)方法1的出油率稍低，但是發(fā)現(xiàn)其香氣、色澤更接近于鮮橘，原因是方法2會使__原料焦糊和有效成分水解__，所以通常先采用方法1提取，并將方法1之后的殘渣用方法2進一步提取。 (3)通常使用方法1時，可以提前使用__石灰水__浸泡。浸泡的時間通常是__10h__以上。 (4)使用方法2提取時發(fā)現(xiàn)，柑橘皮的破碎度越高，即顆粒越小，出油率越高，原因是__原料(相對表)面積大，隨水蒸汽蒸餾速度快。(與溶劑接觸的面積越大)(橘皮香精油從果皮內(nèi)部逐漸擴散至固體表面所通過的距離越短，故容易滲出。)__。 [解析]　(1)橘皮精油無色，主要成分是檸檬烯。本實驗用到的植物芳香油提取方法為水蒸氣蒸餾和壓榨。(2)若要計算提取精油的出油率，需要稱量芳香油和原料的質(zhì)量。對比發(fā)現(xiàn)方法1的出油率稍低，但是發(fā)現(xiàn)其香氣、色澤更接近于鮮橘，原因是方法2會使原料焦糊和有效成分水解。(3)通常使用方法1時，用石灰水浸泡檸檬皮可破壞細胞結(jié)構(gòu)，分解果膠，防止壓榨時滑脫，提高出油率。浸泡的時間通常是10h以上。(4)使用方法2(水蒸氣蒸餾法)提取時發(fā)現(xiàn)，柑橘皮的破碎度越高，即顆粒越小，出油率越高，原因是原料(相對表)面積大，隨水蒸汽蒸餾速度快。 5．大腸桿菌是與我們?nèi)粘Ｉ盥?lián)系非常密切的細菌，請回答有關(guān)檢測飲用水中大腸桿菌的問題： (1)檢測飲用水中大腸桿菌的含量時，通常將樣品進行一系列的梯度稀釋，將不同稀釋度的水樣用涂布器分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面進行培養(yǎng)，然后記錄菌落數(shù)量，這種方法稱為__稀釋涂布平板法__。判斷下圖所示的4個菌落分布圖中，不可能是用該方法得到的是__D__。 (2)用上述方法統(tǒng)計樣本中菌落數(shù)時是否需要設(shè)置對照組？__需要__，其原因是需要判斷培養(yǎng)基__是否被雜菌污染(滅菌是否合格)__，對于固體培養(yǎng)基應(yīng)采用的檢測方法是將__未接種__的培養(yǎng)基在適宜的溫度下放置一段時間，觀察培養(yǎng)基上是否有菌落產(chǎn)生。 (3)在微生物培養(yǎng)操作過程中，為防止雜菌污染，需對培養(yǎng)基和培養(yǎng)器皿進行__滅菌__(填“消毒”或“滅菌”)處理；操作者的雙手需要進行清洗和__消毒__；靜止空氣中的細菌可用紫外線殺滅，其原因是紫外線能使其內(nèi)蛋白質(zhì)變性，還能損傷它的__DNA__的結(jié)構(gòu)。 (4)檢測大腸桿菌實驗結(jié)束后，使用過的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物必須經(jīng)過__滅菌__處理才能丟棄，以防止培養(yǎng)物的擴散。 [解析]　D中菌落分布情況為利用平板劃線法所得。為判斷培養(yǎng)基滅菌是否合格，本實驗需要設(shè)置對照。要判斷固體培養(yǎng)基是否被污染，可將未接種的培養(yǎng)基在適宜的溫度下培養(yǎng)一段時間，若發(fā)現(xiàn)有菌落說明培養(yǎng)基已被污染。消毒是指使用較溫和的物理或化學方法殺死物體表面或內(nèi)部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。滅菌是指使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。對人的手不能進行滅菌處理。對培養(yǎng)基和培養(yǎng)器皿要進行滅菌處理，對操作者的雙手需要進行清洗和用酒精消毒。 6．(2018全國卷Ⅲ)回答下列與酵母菌有關(guān)的問題： (1)分離培養(yǎng)酵母菌通常使用__麥芽汁瓊脂__(填“牛肉膏蛋白胨”“MS”或“麥芽汁瓊脂”)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基應(yīng)采用__高壓蒸汽__滅菌法滅菌。若將酵母菌劃線接種在平板上，培養(yǎng)一段時間后可觀察到菌落，菌落的含義是__由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體__。 (2)酵母菌液體培養(yǎng)時，若通入氧氣，可促進__菌體快速增殖__(填“菌體快速增殖”“乙醇產(chǎn)生”或“乳酸產(chǎn)生”)；若進行厭氧培養(yǎng)，可促進__乙醇產(chǎn)生__(填“菌體快速增殖”“乙醇產(chǎn)生”或“乳酸產(chǎn)生”)。 (3)制作面包時，為使面包松軟通常要在面粉中添加一定量的酵母菌，酵母菌引起面包松軟的原因是__酵母菌分解葡萄糖會產(chǎn)生CO2，CO2使面包松軟__。 [解析]　(1)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用廣泛的細菌培養(yǎng)基；MS培養(yǎng)基是滿足植物細胞的營養(yǎng)和生理需要的培養(yǎng)基；麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基通常用于酵母菌(真菌)的培養(yǎng)、鑒定及菌種保存。培養(yǎng)基的滅菌方法為高壓蒸汽滅菌法。菌落是指由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體。 (2)酵母菌為兼性厭氧型微生物，在有氧條件下進行有氧呼吸為酵母菌的繁殖提供能量，在無氧條件下，酵母菌進行無氧呼吸產(chǎn)生乙醇。 (3)面包松軟是因為制作過程中加入的酵母菌可以分解葡萄糖產(chǎn)生大量的CO2，CO2遇熱膨脹，使得制作的面包松軟多孔。 7．(2018江蘇卷)酵母的蛋白質(zhì)含量可達自身干重的一半，可作為飼料蛋白的來源。有些酵母可以利用工業(yè)廢甲醇作為碳源進行培養(yǎng)，這樣既可減少污染又可降低生產(chǎn)成本。研究人員擬從土壤樣品中分離該類酵母，并進行大量培養(yǎng)。下圖所示為操作流程，請回答下列問題： (1)配制培養(yǎng)基時，按照培養(yǎng)基配方準確稱量各組分，將其溶解、定容后，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的__pH__，及時對培養(yǎng)基進行分裝，并進行__高壓蒸汽(濕熱)__滅菌。 (2)取步驟②中不同梯度的稀釋液加入標記好的無菌培養(yǎng)皿中，在步驟③中將溫度約__50℃__(在25℃、50℃或80℃中選擇)的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿混勻，冷凝后倒置培養(yǎng)。 (3)挑取分離平板中長出的單菌落，按步驟④所示進行劃線。下列敘述合理的有__a、b、d____。 a．為保證無菌操作，接種針、接種環(huán)使用前都必須滅菌 b．劃線時應(yīng)避免劃破培養(yǎng)基表面，以免不能形成正常菌落 c．挑取菌落時，應(yīng)挑取多個菌落，分別測定酵母細胞中甲醇的含量 d．可以通過逐步提高培養(yǎng)基中甲醇的濃度，獲得甲醇高耐受株 (4)步驟⑤中，為使酵母數(shù)量迅速增加，培養(yǎng)過程中需保證充足的營養(yǎng)和__氧氣__供應(yīng)。為監(jiān)測酵母的活細胞密度，將發(fā)酵液稀釋1000倍后，經(jīng)等體積臺盼藍染液染色，用2516型血細胞計數(shù)板計數(shù)5個中格中的細胞數(shù)，理論上__無__色細胞的個數(shù)應(yīng)不少于__30__，才能達到每毫升3109個活細胞的預(yù)期密度。 [解析]　(1)配制培養(yǎng)基時，進行計算、稱量、溶化后，需先調(diào)pH再分裝到錐形瓶中進行高壓蒸汽滅菌。 (2)倒平板時的培養(yǎng)基溫度約為50℃，冷凝后倒置培養(yǎng)。 (3)平板劃線時，接種針、接種環(huán)使用前和每次劃線后都需要進行灼燒滅菌，以免造成雜菌污染，a正確；劃線時不能劃破培養(yǎng)基表面，否則不能形成正常菌落，b正確；挑取菌落時，應(yīng)挑取多個不同的菌落，分別測定酵母細胞中蛋白質(zhì)含量，c錯誤；逐步提高培養(yǎng)基中甲醇的濃度，能篩選出其中的耐受菌，獲得耐受高甲醇的菌株，d正確。 (4)酵母是兼性厭氧型真菌，在有氧條件下可大量繁殖。酵母擴大培養(yǎng)時，需保證充足的營養(yǎng)和氧氣等條件。由題中信息“經(jīng)等體積臺盼藍染液染色”可知，計數(shù)室中培養(yǎng)液容積實際只有0.12＝0.05mm3。設(shè)5個中方格中無色(活細胞不能被臺盼藍染色)的細胞數(shù)目為x個，則3109＝x/525100010000.05，解得x＝30(個)。