植物次生代謝產(chǎn)物生物堿的測(cè)定 液相色譜質(zhì)譜法征求意見稿.doc

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ICS 01.040.11中 華 人 民 共 和 國 國 家 標(biāo) 準(zhǔn)GB/T XXXXX—XXX植物次生代謝產(chǎn)物生物堿測(cè)定液相色譜質(zhì)譜法 Determination of 11 alkaloids in biological human samples點(diǎn)擊此處添加與國際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識(shí)（征求意見稿）XXXX - XX - XX發(fā)布 XXXX - XX - XX實(shí)施GB/T XXXXX—2017I前 言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位： 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人： GB/T XXXXX—20171植物次生代謝產(chǎn)物生物堿測(cè)定液相色譜質(zhì)譜法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了植物組織、動(dòng)物組織、體液（血液、尿液）中東莨菪堿、番木鱉堿、烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、秋水仙堿、阿托品、士的寧、喜樹堿、毛果蕓香堿、鬼臼毒素含量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）測(cè)定方法的試驗(yàn)方法、結(jié)果計(jì)算、回收率與精密度、允許差等內(nèi)容。本標(biāo)準(zhǔn)適用于植物組織、動(dòng)物組織、體液（血液、尿液）中東莨菪堿、番木鱉堿、烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、秋水仙堿、阿托品、士的寧、喜樹堿、毛果蕓香堿、鬼臼毒素含量的測(cè)定。2 規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3試驗(yàn)方法樣品經(jīng)提取液超聲提取、離心后，用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定和確證，外標(biāo)法定量。4 試劑和材料除非另有說明，所有試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。4.1 甲醇：色譜純。4.2 乙腈：色譜純。4.3 10%乙腈溶液：10mL 乙腈+90mL 去離子水，混勻。4.4 甲酸：色譜純。4.5 0.1%甲酸水溶液：準(zhǔn)確移取甲酸（ 4.4）1.0mL 置于 1L 容量瓶中，用水定容至刻度。4.6 1%甲酸的乙腈溶液：1mL 甲酸（4.4）+ 99 mL 乙腈（4.2），混勻。4.7 無水硫酸鎂：分析純。4.8 乙酸銨：色譜純。4.9 氨水：色譜純。4.10 100mM 乙酸銨溶液：稱取乙酸銨（ 4.8）3.854g，用去離子水溶解，定容至 500mL。4.11 乙酸銨-氨水緩沖液（pH≈9）：取 100mL 100mM 乙酸銨溶液（4.10），用氨水（4.9)調(diào) pH 值到9±0.5。4.12 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：東莨菪堿、番木鱉堿、烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、秋水仙堿、阿托品、士的寧、喜樹堿、毛果蕓香堿、鬼臼毒素的中文名稱、英文名稱、CAS 號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)式參見附錄 A 表 A.1，純度均不小于 96%。GB/T XXXXX—201724.13 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取適量各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（4.12）分別置于 50mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成濃度為 100mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（于 4℃避光保存，有效期 2 個(gè)月）。分別準(zhǔn)確移取東莨菪堿、番木鱉堿、烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、秋水仙堿、阿托品、士的寧、喜樹堿、毛果蕓香堿、鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液 1mL 于 100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成東莨菪堿、番木鱉堿、烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、秋水仙堿、阿托品、士的寧、喜樹堿、毛果蕓香堿、鬼臼毒素濃度為 1mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于 4℃避光保存，可使用一周。4.14 微孔濾膜：0.22 μm，有機(jī)相。5 儀器和設(shè)備5.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-MS/MS）：配有電噴霧離子源（ESI）。5.2 電子天平：感量為 0.0001g 和 0.01g。5.3 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于 9500r/min。5.4 超聲波清洗儀。5.5 氮吹儀：帶水浴，溫度可調(diào)。5.6 渦旋混合器。5.7 粉碎機(jī)。5.8 離心管：10mL。5.9 離心管：50mL。6 分析步驟6.1 試樣制備植物組織、動(dòng)物組織樣品用粉碎機(jī)粉碎均勻。6.2 試樣提取6.2.1 植物組織、動(dòng)物組織稱取植物組織樣品 1g（精確至 0.001g）于 50mL 離心管中，加入 5mL 去離子水，渦旋混合2min，加入 10mL 乙腈（4.2 ），渦旋混合 1min，超聲輔助提取 10min，加入 4g 無水硫酸鎂（4.7），迅速振搖 1min，9500 rpm 離心 5min。取上清液 5mL 在 45℃水浴中氮吹濃縮至干，用 1mL 10%乙腈溶液（4.3）復(fù)溶，過微孔濾膜（4.14），待測(cè)定。6.2.2 體液6.2.2.1 血液取血液試樣 0.5mL 于 10 mL 離心管中，加入 1 mL 乙酸銨-氨水緩沖溶液（4.11） ，渦旋混合1min，加入 2mL 甲醇（4.1） ，渦旋混合 2min，超聲輔助提取 10min，9500 rpm 離心 5min，取上清液；殘?jiān)尤?2mL 甲醇（4.1）重復(fù)提取一次，合并上清液，45℃水浴中氮吹濃縮至干，用 1mL 10%乙腈溶液（4.3）復(fù)溶，過微孔濾膜（4.14） ，待測(cè)定。6.2.2.2 尿液取尿液試樣 1mL 于 10mL 離心管中，準(zhǔn)確加入 4 mL 含 1%甲酸的乙腈溶液（4.6） ，渦旋混合1min 后，向離心管中加入 1.5g 無水硫酸鎂（4.7） ，迅速振搖 1min，9500 rpm 離心 5min。取上清液2mL 在 45℃水浴中氮吹濃縮至干，用 1mL 10%乙腈溶液（4.3）復(fù)溶，過微孔濾膜（4.14） ，待測(cè)定。6.3 儀器參考條件6.3.1 液相色譜參考條件a) 色譜柱：C 18 柱，100mm×2.1mm（內(nèi)徑），2.5μm，或相當(dāng)者；b) 流動(dòng)相：A ：0.1%甲酸水溶液（3.2.6），B：乙腈（ 3.2.3），梯度洗脫，梯度洗脫程序參見表1；GB/T XXXXX—20173c) 流速：0.30mL/min ；d) 柱溫：30℃；e) 進(jìn)樣量：2μL。表 1 梯度洗脫程序表時(shí)間 /min A/% B/%0.0 90 102.0 90 106.0 75 2523 75 2523.01 90 1025 90 106.3.2 質(zhì)譜參考條件a) 電離方式：電噴霧電離，正離子模式；b) 噴霧電壓：5.5 kV；c) 離子源溫度：500℃；d) 氣簾氣壓力：0.21MPa ；e) 霧化氣壓力：0.34MPa ；f) 輔助氣壓力：0.34MPa ；g) 掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM ）模式，11 種生物堿質(zhì)譜參數(shù)參見表 2。表 2 11 種生物堿質(zhì)譜參數(shù)序號(hào) No. 物質(zhì)名稱Substance name 母離子Parent ion(m/z)去簇電壓Declustering potential /V子離子Product ion (m/z)碰撞能Collision energy (V)138.3* 301 東莨菪堿Scopolamine 324.2 70 156.3 25244.2 502 番木鱉堿Brucine 395.1 80 324.3* 45586.3* 473 烏頭堿Aconitine 646.3 80 554.5 52556.2* 454 次烏頭堿Hypaconitine 616.4 70 524 50572.2* 455 新烏頭堿Mesaconitine 632.3 80 354.2 60310.1 356秋水仙堿 Colchicine 400.4 70 358.1* 32124.1* 357 阿托品Atropine 290.3 80 93.1 42184.2* 508 士的寧Strychnine 335.2 90 156.2 60GB/T XXXXX—20174305.2* 359 喜樹堿Camptothecin 349.2 80 249.2 4094.9* 3410 毛果蕓香堿Pilocarpine 209.3 70 163.5 29247.3* 2011 鬼臼毒素podophyllotixin 415.3 80 397.2 15注：*定量離子6.4 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備 取相應(yīng)的空白樣品，按照 6.1.2 步驟進(jìn)行處理，用得到的空白樣品提取液將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（4.13）逐級(jí)稀釋得到東莨菪堿、番木鱉堿、烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、秋水仙堿、阿托品、士的寧、喜樹堿、毛果蕓香堿、鬼臼毒素濃度為 5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度由低到高進(jìn)行檢測(cè)，以定量離子峰面積對(duì)質(zhì)量濃度作圖，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。6.5 測(cè)定步驟將試樣溶液注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，得到 11 種生物堿的質(zhì)譜響應(yīng)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)液中 11 種生物堿的濃度。樣品溶液中各組分的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應(yīng)稀釋后再進(jìn)樣測(cè)定。6.6 定性判定在相同條件測(cè)定樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液，如果樣品溶液中檢出的色譜峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中的某種組分峰的保留時(shí)間一致（變化范圍在±2.5%），并且所選擇的兩對(duì)子離子的質(zhì)荷比一致，樣品溶液中定性離子相對(duì)豐度與濃度相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中定性離子的相對(duì)豐度進(jìn)行比較時(shí)，相對(duì)偏差不超過表3規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在該組分。11種生物堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的總離子流圖參見附錄B圖B.1 。表 3 定性確定時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差相對(duì)離子豐度 ＞50% ＞ 20%至 50% ＞ 10%至 20% ≤10%允許的相對(duì)偏差 ±20% ±25% ±30% ±50%6.7 空白試驗(yàn)除不加試樣外，均按上述測(cè)定條件和步驟進(jìn)行。7.結(jié)果計(jì)算7.1 植物組織、動(dòng)物組織結(jié)果按式（1）計(jì)算，計(jì)算結(jié)果保留小數(shù)點(diǎn)后兩位。GB/T XXXXX—20175（1） 式中：Xi—樣品中待測(cè)組分含量，?g/kg；Ci—由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的測(cè)試液中某種組分的濃度，μg/L；V—定容體積，mL；K—稀釋倍數(shù)；m—樣品質(zhì)量，g。7.2 體液結(jié)果按式（2）計(jì)算，計(jì)算結(jié)果保留小數(shù)點(diǎn)后兩位。（2）式中：Xi—樣品中待測(cè)組分含量，?g/L；Ci—由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的測(cè)試液中某種組分的濃度，μg/L；V—定容體積，mL；K—稀釋倍數(shù)；v—樣品體積，mL。8 精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的10%。9其他本標(biāo)準(zhǔn)的方法檢出限，植物組織、動(dòng)物組織：阿托品為0.4μg/kg，次烏頭堿、新烏頭堿為0.6μg/kg，東莨菪堿、番木鱉堿、烏頭堿、秋水仙堿、士的寧、喜樹堿、毛果蕓香堿為1.0μg/kg，鬼臼毒素為2.0μg/kg ；血漿、尿液：阿托品為0.4μg/L ，次烏頭堿、新烏頭堿為 0.6μg/L，東莨菪堿、番木鱉堿、烏頭堿、秋水仙堿、士的寧、喜樹堿、毛果蕓香堿為1.0μg/L，鬼臼毒素為2.0μg/L 。本標(biāo)準(zhǔn)的方法定量限，植物組織、動(dòng)物組織：阿托品為1.0μg/kg，次烏頭堿、新烏頭堿為2.0μg/kg，東莨菪堿、番木鱉堿、烏頭堿、秋水仙堿、士的寧、喜樹堿、毛果蕓香堿為4.0μg/kg， 鬼臼毒素為5.0μg/kg ；血漿、尿液：阿托品為1.0μg/L ，次烏頭堿、新烏頭堿為 2.0μg/L，東莨菪堿、番木鱉堿、烏頭堿、秋水仙堿、士的寧、喜樹堿、毛果蕓香堿為4.0μg/L，鬼臼毒素為5.0μg/L 。GB/T XXXXX—20176附 錄 A（資料性附錄）11種生物堿的中文名稱、英文名稱、CAS 號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)式11 種生物堿的中文名稱、英文名稱、CAS 號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)式參見表 A.1。表 A.1 11 種生物堿的中文名稱、英文名稱、CAS 號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)式序號(hào) 中文名稱 英文名稱 CAS 號(hào) 分子式 相對(duì)分子質(zhì) 量 結(jié)構(gòu)式1 東莨菪堿 Scopolane 51-34-3 C17H21NO4 303OOHONCH3O2 番木鱉堿 Brucine 357-57-3 C23H26N2O4 394.5 NNOHHOHHOO3 烏頭堿 Aconitine 302-27-2 C34H47NO11 645.7HOOOHHOOHO OOHOOOHNH4 次烏頭堿 Hypaconitine 6900-87-4 C33H45NO10 615.7HOOOHHOOOOHOOOHN5 新烏頭堿 Mesaconitine 2752-64-9 C33H45NO11 631.7HOOOHOOOOHOOOHNHOHHGB/T XXXXX—20177表 A.1(續(xù))序號(hào) 中文名稱 英文名稱 CAS 號(hào) 分子式 相對(duì)分子質(zhì) 量 結(jié)構(gòu)式6 秋水仙堿 Colchicine 64-86-8 C22H25NO6 399.4OOOOO NHO7 阿托品 Atropine 51-55-8 C17H23NO3 289.4OH O NO8 士的寧 Strychnine 57-24-9 C21H23N2O2 335.4 N OO HHHHN9 喜樹堿 Camptothecin 7689-03-4 C20H16N2O4 348.3O NNO OOH10 毛果蕓香堿 Pilocarpine 92-13-7 C11H16N2O2 208.3 NNOO11 鬼臼毒素 Podophyllotoxin 4354-76-1 C22H22O8 414.4OOOOHOOCH3OCH3OCH3GB/T XXXXX—20178附 錄 B（資料性附錄）11種生物堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的總離子流圖11 種生物堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的總離子流圖參見圖 B.1。1——毛果蕓香堿； 2——東莨菪堿； 3——士的寧； 4——番木鱉堿；5——阿托品； 6——.秋水仙堿； 7——喜樹堿； 8——新烏頭堿；9——次烏頭堿； 10——烏頭堿； 11——鬼臼毒素圖 B.1 11種生物堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的總離子流圖______________ ___________________