植物次生代謝產(chǎn)物生物堿測(cè)定 液相色譜質(zhì)譜法征求意見(jiàn)稿編制說(shuō)明.doc

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《 植 物 次 生 代 謝 產(chǎn) 物 生 物 堿 測(cè) 定 液 相 色 譜 質(zhì) 譜 法 》(征求意見(jiàn)稿)編制說(shuō)明一、任務(wù)來(lái)源本國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)列入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)《二0一七年國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目》，項(xiàng)目編號(hào)“20171810-T-424”。本項(xiàng)任務(wù)由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口，項(xiàng)目周期24個(gè)月。本標(biāo)準(zhǔn)起草工作組由河北省食品檢驗(yàn)研究院、河北醫(yī)科大學(xué)等單位共同組成。二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則本標(biāo)準(zhǔn)遵循GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě) 》和標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)內(nèi)容參考了與生物堿檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)的文獻(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)參照了 GB/T6379.1-2004《測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精密度） 》第1部分總則與定義和 GB/T 6379.2-2004《測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度》第2部分確定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法。3、標(biāo)準(zhǔn)制定的背景及意義在司法鑒定實(shí)踐中，時(shí)常遇到因不當(dāng)治療、他殺和意外而致的有毒生物堿中毒事件，由于植物中所含有毒生物堿成分復(fù)雜多樣、毒性大、含量低以及中毒者體內(nèi)代謝迅速、樣品量受限制且中毒無(wú)特意性臨床表現(xiàn)等問(wèn)題，使復(fù)雜生物體系中有毒生物堿成分的鑒定及定量分析成分毒物分析中的難題。生物堿是存在于自然界（主要為植物）中的一類含氮的堿性有機(jī)化合物，大多數(shù)有復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，氮素多包含在環(huán)內(nèi)，有顯著的生物活性，是中藥中重要的有效成分之一。按照生物堿的基本結(jié)構(gòu)，可分為 60 類左右，如有機(jī)胺類（秋水仙堿） 、莨菪烷類（阿托品、東莨菪堿） 、二萜類（烏頭堿）等。大多數(shù)生物堿幾乎不溶或難溶于水，能溶于氯仿、乙醚、酒精、丙酮、苯等有機(jī)溶劑。絕大多數(shù)生物堿分布在高等植物，尤其是雙子葉植物中，如毛茛科、罌粟科、茄科、夾竹桃科、小檗科等。有的一種植物體內(nèi)含有多種甚至數(shù)十種生物堿，并且它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)有相似之處。形形色色的生物堿為我們提供了許多神奇的藥物，在醫(yī)學(xué)上做出了長(zhǎng)足的貢獻(xiàn)，但也不乏有毒甚至劇毒的生物堿。烏頭堿臨床上具有鎮(zhèn)痛作用，適用于消化系統(tǒng)癌痛，外用時(shí)能麻痹周圍神經(jīng)末梢，產(chǎn)生局部麻醉和鎮(zhèn)痛作用。烏頭堿毒性極大，能興奮麻痹感覺(jué)神經(jīng)和中樞神經(jīng)，興奮麻痹膽堿能神經(jīng)和呼吸中樞，興奮心臟迷走神經(jīng)，直接毒害心肌細(xì)胞，故其心臟毒的致命性最為嚴(yán)重。顛茄堿（阿托品）是副交感神經(jīng)抑制劑，為阻斷 M 膽堿受體的抗膽堿藥，能解除平滑肌的痙攣 (包括解除血管痙攣，改善微血管循環(huán)) ；抑制腺體分泌；解除迷走神經(jīng)對(duì)心臟的抑制，使心跳加快；散大瞳孔，使眼壓升高；興奮呼吸中樞。東莨菪堿，又稱天仙子堿，一種莨菪烷型生物堿,它存在于茄科植物中。作用與阿托品相似，其散瞳及抑制腺體分泌作用比阿托品強(qiáng)，對(duì)呼吸中樞具興奮作用，但對(duì)大腦皮質(zhì)有明顯的抑制作用，此外還有擴(kuò)張毛細(xì)血管、改善微循環(huán)以及抗暈船暈車等作用。秋水仙堿在臨床上主要用于乳腺癌、肺癌、胃癌、皮膚癌及慢性粒細(xì)胞白血病，還可用于治療痛風(fēng)急性發(fā)作。秋水仙堿的毒性較大，如果人體攝入秋水仙堿后，會(huì)在人體組織內(nèi)被氧化，生成二秋水仙堿。而二秋水仙堿是一種劇毒物質(zhì)，可毒害人體胃腸道、泌尿系統(tǒng) 。番木鱉堿能破壞中樞神經(jīng)，導(dǎo)致強(qiáng)烈反應(yīng)，最終會(huì)導(dǎo)致肌肉萎縮，中毒者會(huì)窒息，無(wú)力及身體抽搐，先脖子發(fā)硬，然后肩膀及腿痙攣，直到中毒者蜷縮成弓形，并且只要中毒者說(shuō)話或做動(dòng)作就會(huì)再次痙攣，尸體仍然會(huì)抽搐，面目猙獰。生物堿的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法（HPLC） 、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）和液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS） 。HPLC 檢出限高，很多情況下不能滿足生物堿鑒定的需要，且僅以保留時(shí)間進(jìn)行定性分析存在風(fēng)險(xiǎn)，當(dāng)目標(biāo)物濃度低時(shí)基質(zhì)干擾嚴(yán)重、選擇性差，易出現(xiàn)假陽(yáng)性。GC-MS 分析有毒生物堿則需要衍生化后才能進(jìn)行分析，操作過(guò)程復(fù)雜。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)具備液相色譜高效的在線分離能力和質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度的檢測(cè)能力，可以同時(shí)得到化合物的保留時(shí)間、分子量以及特征結(jié)構(gòu)碎片等豐富的信息，其多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）技術(shù)兼具有選擇離子掃描的靈敏度和二級(jí)質(zhì)譜的特征性，在痕量分析方面具有很大的優(yōu)勢(shì)。目前國(guó)內(nèi)外研究較少，且檢測(cè)項(xiàng)目單一，檢測(cè)方法靈敏度較低。本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定生物檢材中 11 種有毒生物堿的 LC-MS/MS 檢測(cè)方法，方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可為監(jiān)管部門(mén)提供技術(shù)支撐。4、標(biāo)準(zhǔn)工作過(guò)程（1）確立標(biāo)準(zhǔn)制定的基本原則，收集國(guó)際和國(guó)內(nèi)生物產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)。（2）比較與研究我國(guó)原國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)內(nèi)容，并結(jié)合方法的研究工作，制定出標(biāo)準(zhǔn)的討論稿。（3）提交《生物檢材中 11 種生物堿的檢測(cè) 液相色譜質(zhì)譜法（征求意見(jiàn)稿）、 《編制說(shuō)明》 。5、標(biāo)準(zhǔn)的重要內(nèi)容1、方法的研制和實(shí)驗(yàn)條件的確定1.1 色譜柱的選擇及分離條件的選擇對(duì)比了 3 種色譜柱（Waters Xbridge BEH C18： 2.1*100mm，2.5μm ；Thermo Accuore-150 C18：2.1*100mm，2.5μm 和資生堂 Capcell PAK C18：2.1*100mm，2μm）對(duì) 10 種生物堿的分離效果。結(jié)果表明，使用 Thermo C18 柱時(shí)士的寧、番木鱉堿、阿托品沒(méi)有基線分離；使用資生堂色譜柱時(shí)，11 種生物堿峰形良好，但峰面積普遍偏低；使用 Waters C18 時(shí)，11 種生物堿實(shí)現(xiàn)了基線分離，峰形良好，峰響應(yīng)也較高，因此選擇后續(xù)試驗(yàn)選擇 Waters Xbridge BEH C18 柱。本研究考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、乙腈- 水、乙腈-0.1%甲酸體系作為流動(dòng)相對(duì) 10 種生物堿的色譜行為和離子化程度的影響。結(jié)果表明，流動(dòng)相中含有 0.1%甲酸時(shí)，儀器信號(hào)響應(yīng)高，因此選擇含 0.1%甲酸的體系；流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸時(shí)，柱壓明顯低于甲醇-0.1% 甲酸，而且分析物峰形相對(duì)較好，因此選擇乙腈-0.1% 甲酸作為流動(dòng)相。為實(shí)現(xiàn) 11 種生物堿的基線分離，我們考察了不同梯度條件下的分離情況。C18 柱對(duì)毛果蕓香堿幾乎沒(méi)有保留，不同梯度條件下毛果蕓香堿的保留時(shí)間變化不大。士的寧、番木鱉堿、阿托品的出峰時(shí)間比較接近，為實(shí)現(xiàn)三者的基線分離，需要比較平緩的梯度；次烏頭堿、烏頭堿結(jié)構(gòu)類似，保留時(shí)間也比較接近。通過(guò)改變梯度洗脫條件，最終實(shí)現(xiàn)了 11 種生物堿的基線分析，最終優(yōu)化的梯度洗脫條件見(jiàn)表 1。表 1 梯度洗脫程序表時(shí)間（min） A B0.02.06.02323.012590%90%75%75%90%90%10%10%25%25%10%10%1.2 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化11 種有毒生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)中，都含有雜環(huán)原子，所以在正離子模式下易得到一個(gè) H+形成準(zhǔn)分子離子峰 [M+H]+，所以實(shí)驗(yàn)選用正離子模式。分別將 10種生物堿儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)溶液用流動(dòng)相配制為 100 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用流動(dòng)注射泵連續(xù)進(jìn)樣方式進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。首先采用全掃方式，各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均可得到較高豐度的[M+H] +準(zhǔn)分子離子峰。在確定母離子的基礎(chǔ)上選擇 2 個(gè)以上的子離子。采用子離子掃描方式對(duì)子離子及碰撞能進(jìn)行優(yōu)化選擇，通過(guò)改變碰撞能值，使得母離子的強(qiáng)度占最大子離子強(qiáng)度的 1/3 左右時(shí)，同時(shí)優(yōu)化去簇電壓值，選擇能產(chǎn)生最高豐度子離子的碰撞能作為最佳碰撞能量，最終選定母離子與豐度較高，干擾較小的 1 對(duì)特征子離子進(jìn)行定性分析，選擇其中響應(yīng)值高的作為定量離子。10 種有毒生物堿的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表 2，色譜質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。表 2 質(zhì)譜參數(shù)序號(hào) No.藥物名稱Drugs母離子Parent ion(m/z)去簇電壓Declustering potential (V)子離子Product ion (m/z)碰撞能Collision energy (V)138.3* 301東莨菪堿Scopolamine304.2 70156.3 252 番木鱉堿 395.1 80 244.2 50Brucine 324.3* 45586.3* 473烏頭堿Aconitine646.3 80554.5 52556.2 454次烏頭堿Hypaconitine616.4 70524 50572.2* 455新烏頭堿Mesaconitine632.3 80354.2 60310.1 356秋水仙堿Colchicine400.4 70358.1* 32124.1* 357阿托品Atropine290.38093.1 42184.2* 508士的寧Strychnine335.2 90156.2 60305.2* 359喜樹(shù)堿Camptothecin349.2 80249.2 4094.9* 3410毛果蕓香堿Pilocarpine209.3 70163.5 29247.3* 2011鬼臼毒素podophyllotixin 415.3 80 397.2 15*定量離子1.毛果蕓香堿 2.東莨菪堿 3.士的寧 4 番木鱉堿 5.阿托品 6.秋水仙堿 7.喜樹(shù)堿 8.新烏頭堿 9.次烏頭堿 10.烏頭堿 11 鬼臼毒素圖 2 11 種生物堿的色譜質(zhì)譜圖1.3 前處理?xiàng)l件的選擇和優(yōu)化1.3.1 提取溶劑的選擇（1）植物組織、動(dòng)物組織樣品：考察了三氯甲烷、甲醇、乙醇、乙腈四種有機(jī)溶劑的提取效果。通過(guò)標(biāo)品添加方式考察不同提取溶劑時(shí)分析物的回收率最終確定了乙腈為后續(xù)試驗(yàn)的提取溶劑。由于部分植物組織、動(dòng)物組織含水量低，直接加有機(jī)溶劑提取效果不太理想，采取稱取 1g 樣品后加入 5mL 水，使樣品分散后再加有機(jī)溶劑提取，回收率有了明顯提高。（2）血液樣品含有蛋白質(zhì)，直接加入有機(jī)溶劑提取會(huì)導(dǎo)致樣品中蛋白質(zhì)沉淀，提取溶劑不易滲透進(jìn)樣品中；生物堿大都為堿性，在堿性環(huán)境中更容易游離出來(lái)，易溶于有機(jī)溶劑。因此血液樣品在取樣后加入 2 被體積的乙酸銨-氨水溶液（pH≈9） ，再用有機(jī)溶劑提取。（3）為有效將生物堿從尿液樣品中提取出來(lái)，考察了直接用乙腈提取和加入硼砂-氫氧化鈉（pH≈9.6）后再用乙腈提取兩種提取方式，兩種方式提取效果接近，因此采用直接加乙腈提取的方式?？疾炝艘译嬷屑尤氩煌瑵舛燃姿釙r(shí)生物堿的提取效果，結(jié)果表明用含有 1%甲酸的乙腈溶液時(shí)，提取效果最佳。為使乙腈與水有效分離，加入了一定量的無(wú)水硫酸鎂。1.3.2 凈化方法的考察選擇尿液為基質(zhì)，11 種生物堿添加水平為 100μg/L，考察了 Oasis?MCX 固相萃取柱的凈化效果。結(jié)果表明采用 Oasis?MCX 柱凈化時(shí)，秋水仙堿和鬼臼毒素檢測(cè)不到，毛果蕓香堿的回收率為 60 左右。該前處理過(guò)程沒(méi)有采用陽(yáng)離子固相萃取柱凈化。2、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)驗(yàn)證和實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證2.1 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)驗(yàn)證（技術(shù)指標(biāo)要求）2.1.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限的線性范圍、檢出限和定量限見(jiàn)表 3，植物組織、動(dòng)物組織檢出限、定量限單位為 μg/kg，體液（血液、尿液）檢出限、定量限單位為 μg/L。表 3 方法的檢出限、定量限、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和回歸方程序號(hào)No.物質(zhì)名稱Substance name回歸方程Regression equations相關(guān)系數(shù)Correlationcoefficients(R2)檢出限LOD（μg/kg 或 μg/L）定量限LOQ（μg/kg 或 μg/L）線性范圍Linear range(μg/L)1東莨菪堿ScopolamineY=3.506e5x+6.534e5 0.9913 1 4 2-1002番木鱉堿BrucineY=1.203e5x+9.103e5 0.9916 1 4 2-1003烏頭堿Aconitine Y=8.348e5x+2.177e5 0.9912 1 4 2-1004次烏頭堿Hypaconitine Y=4.427e5x+1.216e5 0.9904 0.6 2 1-1005新烏頭堿MesaconitineY=5.110e5x+1.358e5 0.9912 0.6 2 1-1006秋水仙堿ColchicineY=1.405e5x+8.205e5 0.9946 1 4 2-1007阿托品AtropineY=4.868e5x+4.319e5 0.9926 0.4 1 0.5-1008士的寧StrychnineY=1.983e5x+4.107e5 0.9922 1 4 2-1009喜樹(shù)堿CamptothecinY=9.878e4x+1.319e5 0.9994 1 4 2-10010毛果蕓香堿PilocarpineY=1.664e5x+1.659e5 0.9931 1 4 2-10011鬼臼毒素podophyllotixin Y=3.990e4x+1.996e4 0.9923 2 5 2.5-100Y:peak area；X:concentration of standard solution, μg/L2.1.2 方法的準(zhǔn)確度和精明度植物組織選擇土豆、茄子、制草烏樣品，動(dòng)物組織選擇豬肝臟、腎，體液選擇小鼠血漿、尿液進(jìn)行方法驗(yàn)證，做 LOQ、5LOQ、10LOQ 三個(gè)水平進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，回收率在 79.8%～116.5% 之間，RSD 低于 10%。2.1.3 穩(wěn)定性在小鼠尿液樣品中按 5LOQ 添加待測(cè)物，在不同時(shí)間點(diǎn)0h，4h，8h，12h，16h，20h，24h 分別測(cè)定（環(huán)境溫度 25℃） ，RSD 在 1.98%～6.32%之間。2.1.4 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)以定量測(cè)定空白基質(zhì)提取液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液與純提取溶劑中相同濃度待測(cè)物的離子響應(yīng)強(qiáng)度。生物堿的濃度為20μg/L ，平行測(cè)定3次。各分析物的平均基質(zhì)效應(yīng)在57.3%~97.5%之間。2.2 實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證該標(biāo)準(zhǔn)經(jīng) 5 家國(guó)內(nèi)檢測(cè)機(jī)構(gòu)驗(yàn)證，添加水平為 LOQ、5LOQ 、10LOQ，回收率范圍為 80.1%～115.2% 之間，RSD 在 2.23%～9.75%之間。6、其他需要說(shuō)明的事項(xiàng)無(wú)。