【基金標書】2010CB912500-細胞膜重要脂質代謝產物對重大疾病病理生理過程的調控

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項目名稱： 細胞膜重要脂質代謝產物對重大疾病病理生理過程的調控首席科學家： 朱毅 北京大學起止年限： 2010年 1月-2014 年 8月依托部門： 教育部一、研究內容花生四烯酸被 COX、LOX 和 CYP三條途徑代謝生成上百種結構相似，但具有不同生物活性的代謝產物，在生命活動和多種重大疾病過程中發(fā)揮重要的作用。然而，許多重要花生四烯酸代謝產物的作用機制和關鍵的作用靶點等尚不完全清楚。特別是花生四烯酸代謝一條通路出現(xiàn)異?；蛘吒淖儠r，會如何影響其他代謝途徑、會如何影響生物體的整體代謝，上述影響有什么病理生理學意義等重要問題仍然需要深入研究。另外，花生四烯酸代謝依賴幾十種相關酶的共同作用，而上百種代謝產物與相應的蛋白質（包括受體、信號分子等）結合和相互作用，共同介導了花生四烯酸系統(tǒng)對細胞和器官功能的影響。任何外界刺激或細胞功能狀態(tài)改變導致的花生四烯酸代謝通路的改變，必然影響各通路代謝產物之間的穩(wěn)態(tài)，進而造成細胞乃至機體的功能紊亂。本項目將現(xiàn)代生物學方法和轉基因/基因敲除等模式動物相結合，橫向研究在不同的生理病理狀態(tài)下花生四烯酸代謝途徑和產物的變化及其重要代謝產物與相關蛋白質相互作用的機制，進而闡明花生四烯酸代謝系統(tǒng)在不同病理生理狀態(tài)下的作用。（一）關鍵科學問題：本項目針對“花生四烯酸代謝通路不同產物之間形成的網絡、及其與相關蛋白質的相互作用機理、影響生物代謝組的規(guī)律以及對重要病理生理過程的調控作用機制”等關鍵科學問題開展研究。（二）主要研究內容圍繞我們提出的關鍵科學問題，根據(jù)前述的目前國際和國內研究現(xiàn)狀以及我們具備的條件和前期工作基礎，本項目以花生四烯酸代謝為中心，以代謝產物與相關蛋白相互作用和調節(jié)為主軸,針對花生四烯酸代謝產物在重要生理及病理生理過程中的調節(jié)作用，擬運用代謝組學、蛋白組學、結構生物學和模式動物結合的方法展開研究。本項目主要研究內容將在以下三個層面展開：1、闡明花生四烯酸的三大代謝通路中不同的代謝產物間的網絡調控和代謝調節(jié)的關鍵因素，以及花生四烯酸代謝改變對整體和特定組織器官代謝組的影響（1）首先在細胞水平，研究環(huán)氧酶（COX-1 和 COX-2）、脂氧酶（5-LOX，12-LOX， 15-LOX1和 15-LOX2）及 P450單氧酶(表氧酶和?-羥化酶)三大代謝通路的代謝產物，以期明確花生四烯酸的所有活性代謝產物代謝譜的變化，并可望發(fā)現(xiàn)新的生物活性物質；（2）運用花生四烯酸三大代謝通路關鍵合成酶基因的敲除小鼠模型，借助代謝組學手段研究動物組織、血液和尿液中的花生四烯酸代謝產物以及整體代謝組的變化規(guī)律，以闡明單一通路阻斷對其他通路代謝產物的影響；（3）在細胞和整體動物水平研究在單一代謝途徑阻斷的情況下，重要病理生理刺激因素對花生四烯酸代謝產物種類和合成水平的影響，以明確花生四烯酸不同代謝產物間的網絡調控機制。2、重要的花生四烯酸代謝產物與相關蛋白的相互作用（1）利用結構生物學和分子生物學手段明確 COX及 LOX產物與其相應膜受體結合的結構基礎和介導不同信號通路的分子機制。該研究將有助于闡明同一花生四烯酸分子調節(jié)不同生理和病生理過程以及不同產物參與同一生理及病生理過程調節(jié)的分子基礎； （2）研究花生四烯酸代謝產物與代謝性核受體相互作用的機制及其生物學作用，該項研究將可揭示花生四烯酸代謝產物通過核受體調控重要生理、病理生理過程的機制及與重大疾病的關系；（3）發(fā)現(xiàn)與重要花生四烯酸代謝產物（包括 COX代謝產物前列腺素、前列環(huán)素、血栓素；LOX 代謝物白三烯、5-HETE 和 15-HETE和 CYP代謝物 EETs和?/?-1-HETE）相互作用的新的蛋白分子，以闡明花生四烯酸代謝產物參與重要生理及病生理過程調節(jié)的機制；（4）應用分子和細胞生物學手段在重要花生四烯酸代謝產物受體及其作用蛋白轉基因或基因敲除動物模型中研究相應花生四烯酸代謝產物與相關蛋白質的相互作用及其機制。3、花生四烯酸代謝產物對重要生理病理過程的調控作用及其機制（1）在細胞水平研究重要花生四烯酸代謝產物對細胞增殖與分化、糖、脂代謝以及炎癥過程等重要生理病理過程的影響及其機制；（2）在整體動物水平，利用模式動物和基因敲除動物研究花生四烯酸代謝產物與上述生理病理過程及其功能紊亂引起的相應重大疾病的關系。我們將本著“有所為，有所不為”的原則，以這些病理生理變化對心血管系統(tǒng)影響為重點展開研究；A. 以高脂血癥等疾病模式研究重要花生四烯酸代謝產物對脂代謝的影響和其代謝紊亂與高脂血癥發(fā)生的關系；B. 以具有慢性血管炎癥為特征的動脈粥樣硬化為切入點，探討花生四烯酸代謝產物調控血管內皮細胞功能，參與對動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的機制； C. 心血管細胞的損傷與重塑發(fā)生是細胞增殖與分化失衡的結果。以高血壓、心肌肥大及內膜新生為模型，研究不同花生四烯酸代謝產物在心肌細胞和血管平滑肌細胞中對細胞增殖與分化的影響。上述研究的完成不僅將完善我們對花生四烯酸活性產物復雜網路調節(jié)的認識，也有助于明確花生四烯酸代謝產物調節(jié)重要病理生理過程的機制和分子基礎；也將有助于闡明花生四烯酸對人類重大疾?。ǜ哐獕?、動脈粥樣硬化和心肌?。┎〕痰挠绊憽Ｉ鲜鲅芯康耐瓿梢矊⒖赡馨l(fā)現(xiàn)一些花生四烯酸代謝的新產物或新功能，為干預上述重要病生理過程和相關疾病提供潛在的藥物靶點。二、預期目標（一）總體目標：本項目旨在以花生四烯酸代謝與重要生理病理過程調節(jié)為重點，通過組學研究與模式動物研究相結合的多中心、跨學科的聯(lián)合研究，整合國內優(yōu)秀團隊，礪練一支花生四烯酸代謝相關研究的隊伍，進一步完善相關的研究體系，為我國在這一重要研究領域躋身國際先進行列提供基礎和條件。我們預期在今后 5-10年內逐步闡明花生四烯酸在不同的生理、病理狀態(tài)下代謝的規(guī)律以及不同代謝途徑間的相互關系；在該領域獲得突破，并在國際上處于領先水平。確定重要的花生四烯酸代謝物與蛋白質和受體的相互作用及機制、引起的信號和網絡調節(jié)的變化，這些小分子化合產物及相關聯(lián)的蛋白分子在生理和病理生理網絡調節(jié)中的位置等。明確重要的花生四烯酸代謝產物在細胞增殖、分化、炎癥等重要生理病理過程中的作用，分子機制和關鍵的作用靶點；在基于花生四烯酸代謝產物的自主創(chuàng)新的藥物開發(fā)，和某些重大疾病的診斷標志等方面獲得一批有自主知識產權的重要成果；為疾病治療提供理論基礎和潛在靶點，從而為下一步研究疾病的防治策略、治療決策和新藥開發(fā)提供依據(jù)。（二）五年預期目標：在項目資助的五年內，我們擬實現(xiàn)以下目標：1. 闡明干預花生四烯酸單一代謝通路引起的整體代謝產物的相互消長關系、調節(jié)網絡和其介導的主要病理生理學功能；2. 闡明花生四烯酸代謝通路和代謝產物在幾個重大疾?。▌用}粥樣硬化、高血壓、血管再狹窄和心衰）的病理生理過程中的作用靶點和機制；3. 以重要花生四烯酸代謝產物為探針分子研究它們在重要心血管疾病中的作用，揭示花生四烯酸代謝產物與相關疾病發(fā)生關系，為發(fā)現(xiàn)具有潛在應用價值的藥物靶點奠定基礎； 4. 完善和加強代謝組學技術平臺以及花生四烯酸代謝相關的轉基因小鼠和組織特異性基因敲除小鼠等模式動物平臺；運用幾種重要的花生四烯酸代謝酶基因和幾個重要的代謝物受體轉基因或基因敲除動物，完成在非干預狀態(tài)下和不同干預狀態(tài)下重要組織器官基因表達譜和蛋白組學研究。5. 發(fā)現(xiàn) 10-20個重要的調節(jié)或功能蛋白，著重研究和闡明其中 5-10種重要蛋白的作用和在調節(jié)網絡中的作用和位置；6. 針對花生四烯酸代謝相關的酶、受體、作用靶點，建立專門的基因芯片和蛋白質芯片，用于課題模式動物和細胞基因和蛋白質表達變化的篩選；7. 在國際主流期刊發(fā)表高質量論文 60-80 篇，申請國內外專利 10-15 項，申報國家獎勵 2-4項。三、研究方案總體研究方案（一）學術思路：以花生四烯酸代謝為中心，以代謝產物和相關蛋白質相互作用和調節(jié)為主軸,針對它們在重要病理生理過程中的調節(jié)作用，運用現(xiàn)代生物學（組學、結構生物學、生物信息學）和模式動物結合的方法展開研究。在總體研究方案有如下幾個層面：1、在課題的選擇上，我們選擇花生四烯酸這一分布廣泛、其代謝產物復雜且有重要生理病理作用，但作用機制還遠未闡明的小分子化合物為研究對象。選用現(xiàn)代生物學方法和轉基因/基因敲除等模式動物相結合，橫向研究在不同的生理、病理狀態(tài)下代謝途徑，內源性代謝產物的變化及與相關蛋白質相互作用機制；2、在第一個層面，我們將在三大代謝途徑的代謝酶基因和幾個重要的花生四烯酸代謝物的受體轉基因或基因敲除的細胞模型中，研究基因和代謝產物所致的代謝組和蛋白組變化。結合模式生物學手段研究當一條通路，一個酶活性發(fā)生改變時，其他通路和酶的變化，代謝產物的穩(wěn)態(tài)的改變以及整體代謝組改變。以期發(fā)現(xiàn)代謝產物與相關酶的相互作用，以及代謝產物在重要生物調控網絡中的作用及其機制。3、在第二個層面，研究花生四烯酸代謝產物與受體及轉錄因子等相關蛋白的相互作用機制和調控功能。重點研究不同的代謝產物對代謝性核受體重要信號轉導途徑的調控作用及其空間結構和生物學功能的影響；同時研究與糖、脂代謝調控相關的代謝性核受體和轉錄因子等對花生四烯酸代謝的調控機制。4、在第三個層面，研究花生四烯酸三條代謝途徑的代謝酶和主要代謝產物在細胞增殖與分化、細胞激活和炎癥、糖脂代謝紊亂等重要的病理生理過程中的作用。以心血管系統(tǒng)改變?yōu)榇?，利用重大疾病如高血壓、動脈粥樣硬化、糖脂代謝紊亂和心力衰竭等疾病的動物模型和細胞模型，研究發(fā)生這些效應的同時蛋白質組和代謝組的變化規(guī)律。（二）總體技術路線按照上述總體思路，本項目利用多種模式動物研究不同基因缺陷和高表達增強后的表型變化。首先在細胞水平通過高表達或沉默相關基因及直接加入相關代謝物（如 PGE2,HETEs,EETs等）驗證實驗結果并進行機制研究；進而進行基因組、蛋白組學研究和機制研究，明確重要蛋白在整個組學變化中的位置、調節(jié)作用和作用機制；然后是研究主要花生四烯酸代謝物在重要疾病中的病理生理作用，確定關鍵作用靶點。具體用以下模式圖表示。圖 2.總體技術路線（三）研究特色和創(chuàng)新性1、凝練出明確的科學問題和研究思路-以花生四烯酸通路為主軸，將花生四烯酸代謝作為一個整體進行研究：本項目首次將花生四烯酸代謝產物這一作為體內多種小分子活性物質的前體物質、在生物體內廣泛存在且含量豐富的物質作為一個整體進行研究。與目前的單一產物，單一酶和單一通路研究不同，我們利用組學分析和生物信息學方法主要研究三條通路間的交互作用、三條代謝通路間的平衡與調節(jié)； 2、跨學科整合，優(yōu)勢互補、組學研究與模式動物結合：本項目的研究人員由高校長期從事花生四烯酸代謝與疾病研究的教授和科學院具有代謝組學和結構生物學研究經驗的專家組成。研究隊伍具有明顯的優(yōu)勢互補性。研究將利用先進的技術手段，包括高通量基因和蛋白質芯片技術、蛋白組學技術、代謝組學和生物信息學技術和各種模式動物，這將大大提高工作效率和獲得更多、更可靠的信息；對代謝性核受體和轉錄因子的結構生物學研究不僅可以揭示蛋白質的功能和作用機制，而且可以為設計活性小分子作為激活劑和抑制劑提供理論依據(jù)；3、探索新的研究模式與建立新的技術平臺系統(tǒng)：因為花生四烯酸代謝產物既能夠調控代謝性核受體和轉錄因子的生物學功能，反過來又是代謝性核受體和轉錄因子所調控酶的底物或產物，因此它們之間的相互作用是一種典型的反饋調控模式。本項目將動態(tài)而全面的研究蛋白質與代謝產物的相互作用。采用上述多種新的技術和模式動物對花生四烯酸代謝產物效應進行立體的研究和發(fā)掘、全方位研究其引起的蛋白質組學變化、在網絡調節(jié)中的作用；分析這些代謝產物并發(fā)現(xiàn)新的產物及其靶分子，研究相關作用機制，確定其在網絡調節(jié)中的位置和發(fā)現(xiàn)關鍵環(huán)節(jié)；4、研究內容明確，各課題組間關系密切、分工協(xié)作：由于花生四烯酸代謝物有共同和基本的結構，不同的課題組研究的分子效應和靶點可能交叉融合，因而能獲得更全面和準確的信息。項目利用已經建立的基因和蛋白質組學技術平臺進行，各課題之間緊密協(xié)調進行。如課題 1重點利用組學平臺研究花生四烯酸代謝產物的網絡調控，但研究有賴于其他課題的模式動物，而發(fā)現(xiàn)的新信息和分子在其他的課題組進行深入的功能研究。課題 2介于課題 1和課題 3、4之間，重點研究代謝產物與相關蛋白的關系，為課題 3和 4的機制研究提供蛋白質靶點。而課題 3和 4分別以疾病模型研究花生四烯酸代謝產物在細胞增殖與分化，炎癥與抗炎中的作用，功能性研究結果將不斷提供新的內容在組學平臺進行分析。另外，我們將建立的花生四烯酸代謝特異性基因芯片和蛋白質芯片為各課題組的相關研究提供篩選平臺。 （四）取得重大突破的可行性分析如果本項目獲得資助，我們有望在前列腺素受體（4 個受體）通路、CYP-EETs -sEH代謝等方面在不同器官和細胞的作用靶點（受體和關鍵分子）和代謝性核受體的相互作用、對不同細胞信號系統(tǒng)的調節(jié)作用和作用機制、在網絡調節(jié)中的作用和位置等方面取得重要成就和突破；在幾個重要疾病模型（高血壓、心肌肥厚、動脈粥樣硬化等）中的病理作用等方面取得突破。理由如下：（1）國內已經形成了包括本項目組主要成員在內的以花生四烯酸代謝為主要研究方向的隊伍。在科技部和國家自然科學基金委的資助下，近年來新近回國的一批該領域相關的科學家已經在國內做出了顯著的成績，建立起了相關研究平臺和隊伍，并開始發(fā)表高水平的系統(tǒng)研究成果，為本項目奠定了堅實基礎；（2）本項目的團隊有很好的學科交叉和優(yōu)勢互補。除了聚集了國內在花生四烯酸代謝方面有很強研究背景的項目負責人和優(yōu)秀的骨干力量外，我們團隊還包括在蛋白質組學和代謝組學研究方面的優(yōu)秀團隊，用新的思維和新的研究模式對花生四烯酸代謝與重要生理病理過程展開全面研究。（3）本項目承擔單位具有良好的蛋白組學平臺和工作經驗，并包括了波譜與原子分子物理國家重點實驗室已建立的代謝組核磁共振技術平臺。我們還擁有研究所需的包括幾十種轉基因和基因敲除（含器官選擇性的）實驗動物模型，為我們工作的順利開展提供了必要條件。（4）從前期工作基礎看，本項目各課題組均有自己特色的系列工作基礎，研究工作已形成完整的系統(tǒng)并具有原創(chuàng)性突破。在我們課題組成員之間已經展開了密切的合作，如管又飛與唐惠儒之間已經就基因敲除小鼠的代謝組改變正在進行合作研究。（5）本項目的主要研究內容均是在原有的獨立原創(chuàng)工作的基礎上的延伸，例如首次用前列腺素 E2受體轉基因和敲除動物的研究、關于 CYP-EETs與高血壓、心肌肥厚及動脈粥樣硬化的研究等。如能整合大家的力量和學科交叉的優(yōu)勢，針對我們凝練的科學問題，集中精力攻克難關，我們有理由相信在花生四烯酸代謝領域能夠取得重要成就和突破性進展。課題分解(一)課題設置：課題一、花生四烯酸網絡調控及其代謝組學研究主要承擔單位：中國科學院上海生命科學院、中國科學院武漢物理與數(shù)學研究所課題負責人： 沈 旭，45 歲，研究員，博士生導師，上海生命科學院藥物所主要學術骨干：唐惠儒，43 歲，研究員，博士生導師，中科院武漢物理與數(shù)學研究所研究內容：綜合應用代謝組學、蛋白質組學、結構生物學等方法和技術研究在不同生理、病理狀態(tài)下花生四烯酸不同代謝途徑及其代謝產物的調節(jié)、代謝產物EETs，PGE2 和各種 HETE等與相關代謝酶和受體的相互作用，及其在重要生物調控網絡中的作用途徑及其機制。（1）發(fā)展和完善適合本項目研究的代謝組分析技術，發(fā)現(xiàn)新的花生四烯酸代謝產物、新的作用靶點及其與靶分子的作用關系和調控機制；（2）不同代謝途徑之間，與相關蛋白酶和受體的相互作用及其機制；（3）花生四烯酸代謝產物在重要生物調控網絡中的作用及其機制；（4）運用模式動物及細胞通過干擾不同代謝環(huán)節(jié)，研究花生四烯酸代謝調節(jié)整體代謝組的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)相關的代謝標志物和代謝途徑。（5）用 X-衍射或 NMR方法測定花生四烯酸代謝產物與結合蛋白質復合物的三維結構，研究內源產物與蛋白質的相互作用方式和位點。 預期目標：1）闡明干預花生四烯酸代謝通路引起的代謝產物的相互消長關系、調節(jié)網絡和其介導的主要病理生理學功能；2）以花生四烯酸代謝產物為探針分子篩選候選作用蛋白,研究它們在相關疾病發(fā)生的新信號轉導及分子調控通路，為發(fā)現(xiàn)具有潛在應用價值的藥物靶點奠定基礎；3）利用一系列生物化學和生物物理方法，形成具有原創(chuàng)能力的花生四烯酸代謝產物調控作用機制的研究平臺；4）發(fā)現(xiàn) 8-10個重要的調節(jié)或功能蛋白，選擇研究和闡明其中有重要意義蛋白的作用和在調節(jié)網絡中的作用和位置；5）在國際主流學術期刊上發(fā)表高質量研究論文 15-20篇，申請專利 3-5項；6）完善和加強代謝組學技術平臺，建立一支具有原創(chuàng)能力的化學生物學研究隊伍，培養(yǎng)博士生 6人、博士后 2人。經費比例：21.4%課題二、花生四烯酸代謝產物與糖、脂代謝相關的核受體和轉錄因子的相互作用承擔單位：中國科學院上海生命科學院、北京大學醫(yī)學部課題負責人： 應 浩 35 歲，研究員，博士生導師，上海生命科學院主要學術骨干：郭非凡 41 歲，研究員，博士生導師，上海生命科學院向 嵩 35 歲，研究員，博士生導師，上海生命科學院汪南平 46 歲，教授，博士生導師，北京大學研究內容：本課題研究探索在糖、脂代謝調控中，花生四烯酸代謝產物與代謝性核受體以及相關轉錄因子相互作用機制及調控功能，包括（1）不同的花生四烯酸代謝產物對代謝性核受體空間結構以及生物學功能的影響；（2）代謝性核受體和轉錄因子對花生四烯酸代謝途徑的調控機制；（3）花生四烯酸代謝產物在代謝性核受體和轉錄因子調控的糖、脂代謝中的功能及作用機制；（4）花生四烯酸代謝在糖、脂代謝和重大代謝性疾病發(fā)生發(fā)展中的變化規(guī)律、影響因素和作用機理。預期目標：1、針對花生四烯酸代謝產物對糖、脂代謝的功能調控，系統(tǒng)研究參與花生四烯酸代謝途徑的關鍵調控蛋白質，特別是代謝性核受體 PPAR和轉錄因子SREBP-1的生理功能；2、研究花生四烯酸代謝產物與關鍵蛋白質的相互作用機制及其所調控網絡，并探索花生四烯酸代謝產物在糖、脂代謝過程中的生物學功能和在重大代謝性疾病發(fā)生發(fā)展中的病理學意義。3、針對花生四烯酸代謝相關的酶、受體、作用靶點，建立專門的蛋白質芯片，用于模式動物和細胞蛋白質表達變化的篩選，并為其他課題組提供平臺；4、發(fā)現(xiàn) 8-10個重要的調節(jié)或功能蛋白，選擇研究和闡明其中有重要意義蛋白的作用和在調節(jié)網絡中的作用和位置；5、在國際主流學術期刊上發(fā)表高質量研究論文 15-20篇，申請專利 3-5項；6、建立一支具有原創(chuàng)能力的分子生物學研究隊伍，培養(yǎng)博士生 6-8人、博士后 2人。經費比例：22.6%課題三、花生四烯酸代謝產物與炎癥調控和動脈粥樣硬化發(fā)病機制承擔單位：汕頭大學、北京大學醫(yī)學部課題負責人： 周應畢 48 歲，教授，博士生導師，汕頭大學主要學術骨干：管又飛 44 歲，教授，博士生導師，北京大學黃東陽 52 歲，教授，博士生導師，汕頭大學羅文鴻 45 歲，教授，博士生導師，汕頭大學研究內容：本課題組利用我們已擁有的多種花生四烯酸相關基因敲除和轉基因小鼠，應用分子生物學、細胞生物學、代謝組學、蛋白質組學、以及病理生理方法和手段研究：（1）在炎癥過程中花生四烯酸不同代謝途徑中的變化規(guī)律，及它們對血管功能影響和機制；（2）花生四烯酸重要代謝產物的產生、降解在炎癥過程中的病理生理作用；（3）花生四烯酸代謝通路及其代謝產物在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展及治療中的作用；（4）COX、LOX 及其前列腺素合酶和受體基因敲除和活性抑制對花生四烯酸代謝組的影響以及對其他途徑產物的調節(jié)作用。預期目標：1、明確在炎癥過程中花生四烯酸不同代謝途徑中的變化規(guī)律，花生四烯酸重要代謝產物的產生、降解在炎癥過程中對整體動物和細胞的病理生理作用以及它們對血管功能的影響和機制；2、闡明花生四烯酸代謝通路及其代謝產物在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展及治療中的作用及其分子機制。3、研究闡明花生四烯酸 COX、LOX 及其前列腺素合酶和受體基因敲除和活性抑制對花生四烯酸代謝組的影響以及對其他代謝產物的調節(jié)作用。研究它們在不同器官和組織所致的基因表達譜和蛋白組的變化，明確這些組學變化與心血管細胞功能改變的關系。4、完善花生四烯酸代謝相關的轉基因小鼠和組織特異性基因敲除小鼠等模式動物平臺；運用 5-10種代謝物受體轉基因或基因敲除動物，完成在非干預狀態(tài)下和不同干預狀態(tài)下重要組織器官基因表達譜和蛋白組學研究。5、在國際主流學術期刊上發(fā)表高質量研究論文 15-20篇，申請專利 3-5項。6、培養(yǎng)博士生 6-8人、博士后 2人。經費比例：22.6%課題四、花生四烯酸代謝產物對細胞增殖與分化調控機制及其在心血管損傷與重塑中的作用 主要承擔單位： 北京大學課題負責人： 朱 毅 49 歲，教授，博士生導師，北京大學主要學術骨干： 王 憲 53 歲，教授，博士生導師，北京大學祝世功 53 歲，教授，博士生導師，北京大學鄭樂民 35 歲，副教授，碩士生導師，北京大學研究內容以心血管損傷與重塑為切入點，研究花生四烯酸代謝產物對細胞增殖與分化調控機制（1）不同代謝途徑中的產物對細胞增殖與分化調控機制；（2）不同代謝途徑中的產物對心血管細胞的損傷與保護機制；（3）在心血管重塑過程中不同代謝途徑中產物的變化規(guī)律及其病理生理作用；（4）CYP2C44、CYP2J5和 sEH基因缺陷小鼠心血管細胞的蛋白質組和代謝組變化規(guī)律。預期目標：1、初步明確不同花生四烯酸代謝途徑中的產物對細胞增殖與分化的調控以及對心血管細胞的損傷與保護機制；闡明在心血管重塑過程中花生四烯酸不同代謝途徑中產物的變化規(guī)律及其病理生理作用；2、闡明花生四烯酸代謝通路和代謝物在具有共同的病理生理過程的高血壓、血管再狹窄和心衰等重大心血管疾病中的作用和機制，明確數(shù)個可能通過分子特異性干預達到抑制或阻斷疾病發(fā)生、發(fā)展的靶點；3、運用 CYP2C44、CYP2J5 和 sEH基因缺陷小鼠，研究 CYP通路在心血管細胞的蛋白質組和代謝組變化規(guī)律；4、針對花生四烯酸代謝相關的酶、受體、作用靶點，建立專門的基因芯片，用于模式動物和細胞基因表達變化的篩選，并為其他課題組提供平臺； 5、在國際主流學術期刊上發(fā)表高質量研究論文 15-20 篇，申請專利 3-5項；6、培養(yǎng)博士生 6-8人、博士后 2人。經費比例：33.4%（二）課題設置的思路及各課題間的有機聯(lián)系圍繞要解決的關鍵科學問題、主要研究內容和預期目標，我們以花生四烯酸代謝為中心，以代謝產物與相關蛋白相互作用和調節(jié)為主軸,針對它們在重要生理及病理生理過程中的調節(jié)作用，設置 4個課題。課題設置思路及與其它課題的關系分析如下：課題 1將以花生四烯酸代謝組改變及其網絡調控研究為重點；利用項目組成員已擁有的各種轉基因和基因敲除小鼠，研究各個通路改變而引起的其他產物的消長以及整體代謝組變化，而發(fā)現(xiàn)的新信息和分子將在其他的課題組進行深入的功能研究。是本項目代謝組研究的重要平臺。課題 2重點研究不同的代謝產物對相關蛋白，主要是糖、脂代謝相關的代謝性核受體和轉錄因子調控作用及其空間結構和生物學功能的影響；同時，研究這些核受體和轉錄因子對花生四烯酸代謝的調控機制。該課題介于課題 1代謝組學研究和課題 3、4 的各種疾病模型之間，為其他課題的研究提供蛋白質靶點，研究相關蛋白質的重要生理和病理作用。同時，建立花生四烯酸代謝特異性蛋白質芯片，為各課題組的相關研究提供篩選平臺。課題 3主要針對花生四烯酸不同代謝途徑中的代謝產物對以動脈粥樣硬化為代表的慢性炎癥的調控機制展開研究；同時重點研究 COX和 LOX酶及代謝產物對病變血管組織的細胞功能調節(jié)，以及它們與其他途徑產物的關聯(lián)作用。是本項目重要的模型動物平臺。一方面為各課題組提供各種相關模型動物，承擔其他課題中與炎癥、細胞激活相關的功能試驗，另一方面依靠其他課題組的代謝組學和蛋白結構生物學分析平臺。課題 4主要針對花生四烯酸不同代謝途徑中的代謝產物對以高血壓、心血管損傷與重構為代表的細胞增殖與分化的調控機制展開研究；同時研究 CYP酶和代謝產物 EETs的產生、降解的調節(jié)以及對其他途徑產物的調節(jié)作用。同時將建立花生四烯酸代謝特異性基因芯片，為各課題組的相關研究提供相關基因的篩選平臺。該課題依靠其他課題組的代謝組學、蛋白質結構生物學分析和模式動物平臺，同時承擔其他課題中與心血管系統(tǒng)細胞增殖與分化相關的功能試驗。圖 3. 課題設置思路及與其它課題的關系四、年度計劃第一年度：研究內容：1. 花生四烯酸代謝產物結合蛋白質的發(fā)現(xiàn)與確證：（1）應用反向對接技術從蛋白質數(shù)據(jù)庫中或利用受體垂釣技術從細胞勻漿中搜尋可能與花生四烯酸代謝產物結合的新的候選蛋白質。（2）表達候選蛋白質，利用生物物理學、分子細胞生物學及生化技術驗證花生四烯酸代謝產物與候選蛋白質的相互作用及探討它們之間的作用機制。2. 代謝性核受體為中心的蛋白的表達、蛋白純化和結晶：運用生物信息學手段預測并選取 5～7 個在基因調控過程中起重要作用的蛋白或復合體作為研究對象，構建蛋白或復合體表達質粒。測試相關蛋白是否表達和可溶，測試它們在溶液中能否形成分子量均一的單體或多聚體。優(yōu)化純化流程，獲得高純度蛋白，開始結晶條件的優(yōu)化工作。3. 糖、脂代謝動物模型的建立和多種組學分析：運用生物信息學手段預測并確定 3～4 個相關核受體和轉錄因子小鼠模型作為研究花生四烯酸代謝調控的平臺，擴展小鼠種群，收集糖脂代謝相關的組織，然后進行代謝組學分析和基因組學等分析。在體內和體外，運用細胞和動物模型，檢測各種花生四烯酸代謝產物對糖、脂代謝的影響，尋找可以通過核受體或轉錄因子起的作用的關鍵花生四烯酸代謝產物。4. 炎性因子對花生四烯酸三大代謝通路合成酶及產物影響：通過對細胞進行炎性因子刺激，確定此過程對花生四烯酸三大代謝通路關鍵合成酶的成酶譜表達及代謝鋪的影響。并研究單一代謝通路阻斷對細胞炎癥反應的影響，觀察它們對促炎和抗炎各種信號傳導通路的影響。5. COX通路與動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的關系：檢測人和動物動脈粥樣硬化斑塊 COX的表達水平以及代謝產物的種類和水平外，并將制備 COX通路關鍵酶和受體基因缺陷的動脈粥樣硬化小鼠，研究 COX通路及其產物對動脈粥樣硬化發(fā)生的影響。 6. 研究血管平滑肌細胞表形轉化，和心肌細胞、免疫細胞等在各種誘導下，功能改變過程中花生四烯酸代謝途徑相關酶及代謝產物譜改變；明確變化的代謝產物與誘導的細胞功能變化的關系。 7. CYP通路基因敲除小鼠心血管細胞的蛋白質組和代謝組變化規(guī)律：利用代謝組學手段開始研究不同的 CYP酶和 EET水解酶基因敲除的血管內皮細胞、平滑肌細胞和心肌細胞中花生四烯酸代謝譜的改變。并且利用腺病毒高表達或特異性抑制劑干預 EET的產生和降解對其它代謝途徑的影響，并明確不同 CYP450同功酶花生四烯酸代謝產物的異同。8. 建立核磁共振技術為基礎的動物微量體液和組織代謝組表征技術:（1）建立適合基因敲除動物研究的微量動物體液代謝組定量檢測方法。（2）建立基于“魔角旋轉”核磁共振（HRMAS-NMR）技術的細胞和組織代謝組原位分析新方法。9. 開始針對花生四烯酸代謝相關的酶、受體、作用靶點，設計專門的基因芯片和蛋白芯片，逐步建立用于模式動物和細胞基因表達變化的篩選，并為項目的實施提供平臺。預期目標：1. 找到與花生四烯酸代謝產物結合的新的候選蛋白 3-5個，并進一步確證它們之間的作用及闡述相應的作用機制。2. 得到 1～2 個可溶的，高純度的蛋白，得到初步的蛋白結晶條件，建立相關研究蛋白功能的手段。3. 發(fā)現(xiàn) 2～5 個可能通過核受體或轉錄因子調控糖、脂代謝的花生四烯酸代謝產物。初步探討糖、脂代謝紊亂影響花生四烯酸代謝相關核受體的表達及轉錄的新規(guī)律。4. 在細胞水平確定在不同細胞的炎癥反應、及抗炎過程中起關鍵作用的花生四烯酸代謝酶系和產物，并推測出其相應的可能作用靶點。5. 確定動脈粥樣硬化斑塊 COX及 PGE2的表達及代謝產物，建立雙基因敲除小鼠，闡明 COX1、COX2 及 PGE2在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中的作用；以及COX通路產物對血管內皮細胞、平滑肌細胞及單核巨噬細胞功能的影響。6. 找到血管平滑肌表形轉化、心肌細胞、免疫細胞等功能改變與花生四烯酸代謝產物相關的新候選蛋白 3-5個，并進一步確證變化的代謝產物與誘導的細胞表型改變的關系及其機制。逐步明確變化的代謝產物與誘導的細胞表型及功能變化的關系及其機制。7. 完成利用腺病毒高表達或特異性抑制劑干預 EET的產生和降解在心血管細胞對其它代謝途徑的影響，并明確不同 CYP450同功酶花生四烯酸代謝產物的異同。初步完成 CYP通路基因 sEH敲除小鼠心血管細胞的蛋白質組和代謝組的檢測工作。8. 建立三大代謝通路的各種產物檢測方法，并確定多種類型細胞（包括血管內皮細胞、血管平滑肌細胞、心肌細胞和炎癥相關細胞等）在各種炎癥因子和細胞因子的刺激下花生四烯酸三大代謝通路關鍵合成酶的蛋白表達及產物構成和水平。9. 建立適合基因敲除動物研究的微量動物體液代謝組的超靈敏核磁共振定量檢測方法，解決檢測靈敏度提高、波譜基線的平整、定量和水峰掩蓋的信號獲取等問題。建立細胞和生物組織代謝組高分辨核磁共振原位定量分析新方法。10. 建立用于模式動物和細胞基因表達變化的專門的基因芯片，并為項目的實施提供平臺.11.開始在國際主流學術期刊上發(fā)表高質量研究論文 4-6 篇。第二年度：研究內容：1. 在上一年研究工作的基礎上，開展進一步的質粒的構建與優(yōu)化、蛋白的純化、結晶和功能研究等工作。培養(yǎng)花生四烯酸代謝產物與結合蛋白質的復合物晶體，用 X-衍射或 NMR方法，測定復合物的三維結構。對于可以獲得的高純度蛋白，根據(jù)它們的功能建立研究它們活性的生化和細胞實驗，測量獲得的蛋白是否具有相關的活性。擴展研究的范圍，增加 5～7 個新穎的有重要功能的蛋白。2. 應用蛋白質－蛋白質相互作用網絡預測方法預測與花生四烯酸相互作用蛋白質相關的蛋白質作用網絡，結合生物信息學分析，獲得與花生四烯酸代謝產物相關網路或通路信息。3. 基于糖、脂代謝動物模型的多種組學研究：通過對小鼠樣本的代謝組學的結果分析，尋找受核受體和轉錄因子調控的花生四烯酸代謝途徑；同時分析基因組學和蛋白質組學結果來尋找花生四烯酸代謝途徑中受核受體和轉錄因子調控的酶；比較多種核受體異構體突變小鼠的代謝譜，表達譜和特異性。 4. 關鍵花生四烯酸代謝產物調控糖、脂代謝的分子機制：結合多種與糖、脂代謝相關的在體和離體模型，從轉錄調控水平和信號轉導水平尋找花生四烯酸代謝產物調控糖、脂代謝的分子機理，特別是一些轉錄后調控機制。5. 代謝性核受體、轉錄因子與花生四烯酸代謝：觀察炎癥狀況下，以 PPARs和 LXRs為代表的代謝性核受體及以 NF-?B，AP-1 為代表的炎性反應轉錄因子的變化并觀察其阻斷后代謝酶學與前列腺素、EETs 和白三烯的變化。6. LOX通路在動脈粥樣硬化發(fā)生中的作用：檢測動脈粥樣硬化斑塊 LOX的表達及代謝產物；觀察不同 LOX抑制劑和 LOX基因敲除對動脈粥樣硬化小鼠（apoE -/-和 LDLR-/-）發(fā)生、發(fā)展的影響；檢測白三烯、12-HETE 和 15-HETE對血管內皮、平滑肌及單核巨噬細胞功能的影響及其機制；7. 深入研究 COX-1和 COX-2對代謝組學的影響：檢測 COX-1和 COX-2基因敲除及雙基因敲除和活性阻斷動物重要組織、血液和尿液代謝組的變化并與同基因背景的野生型小鼠比較。8. 用蛋白組學和基因組學方法研究導致炎癥、動脈粥樣硬化和心血管重塑過程中基因表達譜的變化，找出關鍵分子并研究其作用機制、相關的伴隨分子及其相互作用。同時運用代謝組學方法研究花生四烯酸代謝途徑的干預引起的代謝產物譜改變，明確變化的代謝產物與誘導的細胞激活、功能變化和表形轉化的關系。9. CYP單氧酶與細胞生長及分化的關系：重點研究在心血管細胞中白三烯、12-HETE和 15-HETE對細胞功能的影響及其機制；CYP、w-羥化酶以及 EET的水解酶 sEH對細胞炎癥反應、激活、增殖和分化的影響；在 CYP基因敲除小鼠分離的細胞中，各種促進細胞增殖或分化的刺激物或通路的變化及對細胞主要生理功能的影響。10.運用已有的 CYP通路基因敲除小鼠（CYP2C44、CYP2J5 和 sEH），建立球囊拉傷內膜增生模型和高血壓、心肌肥厚模型，在體研究花生四烯酸代謝紊亂與心血管功能異常的關系。11.用蛋白組學和基因組學方法研究花生四烯酸代謝物導致內皮激活與保護的特性改變的基因表達譜變化：尋找關鍵分子并研究其作用機制、相關的伴隨分子及其相互作用。根據(jù)內皮的功能特性，進行相關功能試驗。12.建立優(yōu)勢集成的代謝組分析新方法：(1)發(fā)展用于生物體液代謝組分析的LC-NMR-MS和 NMR-MS新方法。(2)建立基于 LC-DAD-SPE-NMR-MS聯(lián)用的代謝物定性和結構鑒定方法。預期目標：1. 獲得花生四烯酸與蛋白的復合物晶體結構及 1～2 個可溶的，高純度的蛋白，得到初步的蛋白結晶條件，建立相關研究蛋白功能的手段，獲得 1～2 個蛋白的高質量的晶體（衍射到 3 埃或更好） 。2. 預測出花生四烯酸代謝產物參與的調控網絡或新的信號通路；揭示受核受體和轉錄因子調控的花生四烯酸代謝途徑，發(fā)現(xiàn) 2～4 個相應調控點（調控蛋白） ，確定其在調控網絡中的位置。1～2 個重要信號轉導途徑，以及相應的分子機制。3. 建立核受體調控花生四烯酸代謝相關蛋白的表達譜，調控花生四烯酸代謝的代謝產物譜，確定 2-3個可能干預靶點。確證 2～4 個介導花生四烯酸代謝產物調控糖、脂代謝和炎癥的關鍵調控蛋白。4. 闡明 5-LOX、15-LOX 對動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的影響及相互作用與機制；明確白三烯、12-HETE 和 15-HETE對血管內皮、平滑肌及單核巨噬細胞等功能的影響及其機制。5. 確定 COX-1和 COX-2及雙基因敲除對各重要臟器、組織、血液和尿液花生四烯酸代謝組的影響。明確在心血管炎癥和重塑過程中基因表達譜的變化，找出 4-8個關鍵分子并研究其作用機制、相關的伴隨分子及其相互作用6. 完成 CYP通路基因敲除小鼠血管內膜激活、高血壓和心肌肥厚模型的建立，并在體研究 CYP通路與心血管重塑的關系。完成 CYP通路中其他基因包括CYP、w-羥化酶敲除小鼠心血管細胞及免疫細胞的蛋白質組和代謝組的檢測工作。明確在心血管細胞中 CYP單氧酶與細胞生理和病理生理功能的關系。7. 完成小鼠血管內皮細胞的分離培養(yǎng)及用蛋白組學和基因組學方法研究花生四烯酸代謝物導致內皮激活與保護的特性改變的基因表達譜變化，找出 2-3個關鍵分子并研究其作用機制。8. 建立用于生物體液代謝組分析的 LC-NMR-MS、NMR-MS 等新方法和代謝物快速定性和結構鑒定的 LC-DAD-SPE-NMR-MS新方法。 9. 初步建立特異花生四烯酸代謝通路相關的蛋白芯片。10.整理數(shù)據(jù)、在國際主流學術期刊上發(fā)表高質量研究論文 10-15篇，申請專利 2～4 項。第三年度：研究內容：1. 關鍵蛋白質的結構功能研究：包括對重要的突變體的結構和功能的研究，對重要的底物或抑制物、激活因子的復合體的結構研究等。根據(jù)課題進展，擴展研究的范圍，增加 5～7 個新的花生四烯酸代謝相關的蛋白。2. 對發(fā)現(xiàn)的新的關鍵調控蛋白質進行深入研究：建立細胞模型，對發(fā)現(xiàn)的參與核受體及轉錄因子調控花生四烯酸代謝的調控蛋白質包括核受體轉錄因子以及相關的輔助因子進行生物學功能深入分析。3. 花生四烯酸代謝產物相關網路或通路的功能確證：（1）利用分子、細胞生物學的技術手段對預測出來的花生四烯酸參與的調控網絡或信號通路的進行功能確證；（2）在動物水平對預測出來的花生四烯酸參與的調控網絡或信號通路的進行功能確證。4. 利用核受體轉錄因子轉基因和基因敲除小鼠觀察特定花生四烯酸代謝通路對包括 2型糖尿病、動脈粥樣硬化和心肌肥厚等小鼠病理過程發(fā)生和轉歸的影響。5. 重點研究 PPAR系列基因的改變對動物體液和組織代謝組的影響規(guī)律：(1) 研究 PPAR?、PPAR?、PPAR? 等基因敲除動物尿液和血漿代謝組變化規(guī)律，確定代謝標志物結構。(2) 原位分析 PPAR?、PPAR?、PPAR?等基因敲除動物相關組織代謝組變化規(guī)律，確定相關代謝標志物結構。6. 研究單一花生四烯酸代謝通路阻斷對重要臟器和組織炎癥反應的影響：通過炎性因子腹腔注射，誘發(fā)全身炎癥，觀察各關鍵酶基因缺陷或藥物抑制時不同臟器和組織炎癥反應與功能變化。同時觀察單一通路阻斷的情況下前列腺素、EETs 和白三烯彼此的消長關系與代謝產物改變。7. CYP通路與動脈粥樣硬化發(fā)生的關系：檢測動脈粥樣斑塊 CYP和 w-羥化酶的表達及其產物水平的改變；觀察各種 EET產生和降解酶對 apoE-/-和 LDLR-/-小鼠動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展；觀察小鼠病理過程發(fā)生和轉歸的影響。8. 繼續(xù)前一年有關內皮功能方面的研究，運用蛋白組學和基因組學方法研究花生四烯酸代謝物導致內皮激活與保護的特性改變的基因表達譜變化，尋找關鍵分子并研究其作用機制、相關的伴隨分子及其相互作用。整合分析基因組、蛋白質組、代謝組和結構生物學并結合代謝通路，研究發(fā)現(xiàn)相關代謝標志物及其功能。9. 深入研究 COX-1和 COX-2對代謝組學的影響：通過干預動物 COX-1、COX-2表達，研究重要組織、血液和尿液代謝組及其花生四烯酸代謝譜改變。研究同的類型的細胞中 COX通路代謝產物對細胞增殖和分化的影響。使用 COX通路中關鍵合成酶的表達質?；蛳俨《?、基因敲低或活性改變，觀察花生四烯酸代謝產物譜的改變及對細胞周期和分化指標的影響和機制。10.在細胞水平研究 LOX途徑主要代謝產物對細胞增殖和分化的影響：使用 LOX通路中關鍵合成酶（5-LOX、12-LOX、15-LOX）的表達質粒或腺病毒、基因敲低或活性抑制，觀察花生四烯酸代謝產物譜的改變及對細胞周期和分化指標的影響并探討變化的分子基礎；白三烯（LTs）、12-HETE 和 15-HETE調節(jié)細胞增殖與分化的機制。預期目標：1. 確證花生四烯酸代謝產物參與的新的調控網絡或信號通路，并闡述不同信號通絡的相互關聯(lián)。2. 獲得花生四烯酸代謝產物參與的信號通路中的關鍵蛋白的復合物晶體結構。獲得 1～2 個蛋白的高質量的晶體（衍射到 3?；蚋茫?。根據(jù)結構理解蛋白的相關功能，在結構數(shù)據(jù)的指導下，通過引入突變等手段來影響和研究蛋白的功能，深入理解功能的機理。3. 完成 PPAR?等基因敲除動物的尿液和血漿代謝組變化規(guī)律分析和相關組織代謝組變化規(guī)律分析，確定代謝標志物的結構。 4. 發(fā)現(xiàn) 2～3 個花生四烯酸代謝通路影響 2型糖尿病、動脈粥樣硬化和心肌肥厚等疾病的新規(guī)律和新機制。獲得基于新的信號通路或新的靶標的活性化合物 5-10個。研究 2～3 個參與核受體和轉錄因子調控花生四烯酸代謝的調控蛋白，揭示相應的分子調控機制，以及代謝改變的關系。5. 確定心血管系統(tǒng)炎性病變時花生四烯酸代謝的關鍵酶學與代謝產物改變與作用機制，及其可能干預靶點。確定在特定細胞模型中花生四烯酸代謝途徑的亞通路的抗炎與促炎的主要因素及其機制，并設計出相應的干預靶點。6. 確證花生四烯酸代謝物導致內皮激活與保護的特性改變的基因表達譜，選擇 3-5個關鍵分子并研究其作用機制、伴隨分子及其相互作用。確定 CYP及產物在動脈粥樣斑塊內改變，闡明 CYP通路及產物在動脈粥樣斑塊發(fā)病中的作用與機制7. 完成 COX通路代謝產物對細胞增殖和分化的影響，完成 COX1和 COX2基因敲除小鼠整體代謝組以及特定心血管細胞的代謝組學研究。發(fā)現(xiàn)相關分子2-3個并在不同細胞中驗證它們與細胞增殖和分化的關系，并揭示其分子機制。8. 完成 LOX途徑主要代謝產物，尤其是白三烯、12-HETE 和 15-HETE對細胞增殖和分化的影響及其機制的相關研究。逐步明確變化的代謝組改變與蛋白質組、基因組學變化的關系。9. 完成動物代謝組與蛋白質組及有關數(shù)據(jù)的整合分析，研究相關代謝標志物的功能。10.在國際主流學術期刊上發(fā)表研究論文 15-20 篇。申請專利 3～5 項。第四年度：研究內容：1. 優(yōu)化結晶的條件，對高質量的晶體進行衍射數(shù)據(jù)的采集、結構解析、分析等工作。表達所發(fā)現(xiàn)的花生四烯酸代謝產物參與的信號轉導通路中的關鍵蛋白質，培養(yǎng)通路中蛋白與蛋白的復合物晶體，用 X-衍射或 NMR技術，測定復合物的三維結構。根據(jù)課題進展，擴展研究的范圍，增加 5～7 個新發(fā)現(xiàn)的，在花生四烯酸代謝中有重要功能的蛋白。2. 利用生物大分子相互作用分析儀對不同代謝性核受體進行配體垂釣，尋找可以作為代謝性核受體配體或影響代謝性核受體與配體結合的花生四烯酸代謝產物，發(fā)現(xiàn)新的具有調控功能的花生四烯酸代謝產物。在細胞水平和組織器官水平，對該新的代謝產物進行功能分析。3. 根據(jù)已確證的信號轉導通路或確證靶標的信息，利用虛擬篩選或者高通量篩選方法篩選活性化合物。4. 利用花生四烯酸代謝通路限速酶基因敲除小鼠研究 PPARs等代謝性核受體對心血管作用的分子代謝機制。5. 研究在局部組織、器官炎癥狀態(tài)下，單一花生四烯酸代謝通路阻斷對神經體液因子調節(jié)血管功能的影響及機制。在整體動物水平，運用各種關鍵酶基因缺陷小鼠，研究全身炎癥反應狀態(tài)下，單一花生四烯酸代謝通路阻斷對炎癥介質和主要臟器和組織炎癥反應的影響。6. 花生四烯酸雙代謝通路阻斷劑對動脈粥樣硬化、高血壓和心肌肥厚等重大心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的影響：使用 5-LOX和 COX-2雙阻斷劑 licofelone處理 apoE-/-和 LDLR-/-小鼠，觀察其對動脈粥樣硬化斑塊的影響并研究其機制。7. LOX-5和 12/15-LOX等基因敲除動物的代謝組學研究：檢測 5-LOX-/- 小鼠和 15-LOX1-/-小鼠及 5-LOX抑制劑和 15-LOX抑制劑抑制小鼠重要組織和體液花生四烯酸代謝譜改變8. COX代謝產物 PGE2受體基因 EP1-4的改變對動物體液和組織代謝組的影響規(guī)律：系統(tǒng)研究 EP1-4等基因敲除動物體液（尿液和血漿）代謝組變化規(guī)律，確定相關代謝標志物的結構。原位分析 EP1-4基因敲除動物的相關組織代謝組變化規(guī)律，確定相關代謝標志物的結構。集中研究缺陷小鼠對水鹽代謝及血壓的影響。9. 重點研究 EP3受體基因敲除小鼠對水鈉內環(huán)境穩(wěn)態(tài)及正常血壓維持的作用。通過比較野生型和 EP3-/-小鼠尿量、尿鈉排泄和基礎血壓的改變，以及對縮血管藥物全身給藥的不同反應，揭示 EP3受體在血壓調節(jié)中的功能。10.利用 EP4受體基因組織特異性基因敲除技術，選擇性的敲除血管內皮細胞和平滑肌細胞的 EP4受體，觀察對藥物縮血管作用的反應，以闡明血管組織 EP4受體在調節(jié)血管舒張功能中的作用；利用 EP4受體基因組織特異性基因敲除技術，選擇性的敲除腎臟 EP4受體，觀察腎臟 EP4在介導 PGE2利尿、利鈉等功能中的作用。11.研究主要免疫系統(tǒng)主要是 B細胞和不同亞型 T細胞中不同 EP受體對免疫功能及對心血管疾病的影響。預期目標：1. 獲得花生四烯酸代謝產物參與的信號通路中的關鍵蛋白的復合物晶體結構，1～2 個蛋白的高質量的晶體（衍射到 3?；蚋茫?。獲得根據(jù)結構理解蛋白的相關功能，并通過引入突變等手段來影響和研究蛋白的功能，深入理解功能的機理。2. 發(fā)現(xiàn) 2～3 個由花生四烯酸代謝產物直接作用并調控的新核受體和轉錄因子。發(fā)現(xiàn) 1～2 個代謝性核受體通過影響花生四烯酸代謝對心血管起作用的新規(guī)律和新機制。獲得基于新的信號通路或新的靶標的活性化合物 5-10個。3. 闡明炎癥狀況與組織血管壁的花生四烯酸代謝的酶學、對不同神經體液因子的反應性改變，并確定影響病變血管內皮及平滑肌功能的關鍵酶系與產物及其作用機制。4. 確定 5-LOX和 COX-2通路在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中的相互作用。確定兩種同功酶代謝花生四烯酸的差異，并推測出各自可能的相關酶系與產物。5. 根據(jù)前期發(fā)現(xiàn)的重要分子，逐步完成在各種相應的轉基因、敲轉基因小鼠中的蛋白質組與代謝組研究，以及與病理生理過程的關系。6. 完成 EP1-4等基因敲除動物的尿液和血漿及相關組織代謝組變化規(guī)律分析，確定代謝標志物的結構。EP1-4 介導 PGE2的血管收縮和利鈉作用的病理生理過程研究。7. 完成選擇性的敲除血管內皮細胞、平滑肌細胞及腎臟的 EP4受體的基因敲除動物模型的建立，以及表形和功能鑒定。8. 整合分析動物代謝組及蛋白質組和基因組數(shù)據(jù)，研究完成 EP受體干預引起的相關功能改變及病理生理學意義。9. 數(shù)據(jù)整理、在高水平國際主流刊物上發(fā)表論文 15-20篇，申請專利 4-6項。第五年度：研究內容：1. 根據(jù)前四年的工作進展，確定 4～6 個參與花生四烯酸代謝調控的重要蛋白質進行系統(tǒng)研究。特別是要運用各種基因突變技術，利用用于研究糖、脂代謝的動物模型進行功能分析，進一步加深對花生四烯酸代謝途徑的了解。以花生四烯酸通路為中心，建立代謝性核受體對糖脂代謝、炎癥、細胞增殖與分化等的調節(jié)網絡。2. 根據(jù)已確證的信號轉導通路或確證靶標篩選獲得的活性化合物的作用機制研究。3. COX1/2基因的改變對動物體液和組織代謝組的影響規(guī)律：研究 COX1/2基因敲除動物體液（尿液和血漿）代謝組變化規(guī)律；確定相關代謝標志物的結構。原位分析 COX1/2基因敲除動物的相關組織代謝組變化規(guī)律，確定相關代謝標志物的結構。整合分析動物代謝組及蛋白質組和基因組數(shù)據(jù)，研究相關功能改變的病理生理學意義。4. 原位分析不同的 CYP酶和 EET水解酶基因敲除的血管內皮細胞、平滑肌細胞和心肌細胞中代謝組變化規(guī)律及花生四烯酸代謝譜的改變。整合分析動物代謝組及蛋白質組和基因組數(shù)據(jù)，研究相關功能改變的病理生理學意義。5. 繼續(xù)研究內皮細胞、血管平滑肌細胞特異性敲除 EP4受體的動物模型中細胞表形的變化和血管再狹窄過程的變化。研究腎臟特異性敲除 EP4受體基因動物模型腎功能改變以及對血壓調節(jié)的影響，研究相關功能改變的病理生理學意義。6. 繼續(xù)研究主要免疫系統(tǒng)細胞中不同 EP受體對免疫功能及對心血管疾病的影響。利用各種干預手段干預 EET的產生和降解，研究其對其它代謝途徑的影響，并明確不同 CYP450同功酶花生四烯酸代謝產物的異同。7. 完成剩余或研究中衍生出的新的工作，確定多個新型的參與糖脂代謝、炎癥及動脈粥樣硬化、細胞增殖與分化等重要病理生理過程調控的與花生四烯酸代謝密切關聯(lián)的關鍵干預靶點，為下一步藥物合成進行深入研究。8. 全面總結整理所有研究工作，完成計劃，整合研究結果，發(fā)表文章，申請專利。預期目標：1. 闡明新獲得的活性化合物的作用機制，以進一步驗證新的信號轉導通路或候選靶標。2. 明確提出以花生四烯酸通路為中心，代謝性核受體對糖、脂代謝的調控網絡學說。3. 完成各種相應的轉基因、敲除基因小鼠的尿液和血漿以及相關組織代謝組變化規(guī)律分析，確定代謝標志物的結構，以及與病理生理過程的關系。4. 完成血管平滑肌細胞特異性敲除 EP4受體的動物模型中細胞表形的變化和血管再狹窄過程的變化。5. 完成腎臟特異性敲除 EP4受體基因動物模型腎功能改變以及對血壓調節(jié)的影響，研究相關功能改變的病理生理學意義。整合分析動物代謝組及蛋白質組和基因組數(shù)據(jù)，研究相關功能改變的病理生理學意義。6. 完成不同免疫細胞及炎癥細胞中不同酶及受體對免疫功能及對心血管疾病影響的研究。7. 完成研究中發(fā)現(xiàn)的新蛋白、新花生四烯酸代謝產物的鑒定和功能研究。完成在小鼠模型上的整體表達和功能研究。8. 建立新的用于研究花生四烯酸代謝途徑的新動物模型 3～4 個，為今后的工作打下堅實的工作基礎。9. 完成動物代謝組、蛋白質組及模式生物學有關數(shù)據(jù)的整合分析，及相關代謝標志物的功能研究。通過與模型動物實驗結合，選擇出 4-6個新型重要化合物，為今后進一步研究與藥物開發(fā)打好基礎。10.在高水平國際主流刊物上發(fā)表文章 20～25 篇，申請專利 4～6 項， ，申報國家獎項。總結工作，完成結題報告和評估。