高二生物質(zhì)疑解惑課件：5-3《血紅蛋白的提取和分離》（人教版選修I）

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歡迎進(jìn)入生物課堂 課題3血紅蛋白的提取和分離 課程標(biāo)準(zhǔn)嘗試蛋白質(zhì)的提取和分離 課標(biāo)解讀1 知道凝膠色譜法 電泳法等分離生物大分子技術(shù)的基本原理 2 掌握血紅蛋白提取和分離的基本過(guò)程 1 凝膠色譜法 1 概念也稱做 是根據(jù)分離蛋白質(zhì)的有效方法 2 原理 由構(gòu)成的凝膠 內(nèi)部有許多貫穿的 血紅蛋白提取和分離的基本原理 分配色譜法 相對(duì)分子質(zhì)量的大小 多孔球體 通道 當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí) 相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道 路程 移動(dòng)速度 而相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道 只能在移動(dòng) 路程 移動(dòng)速度 從而使相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子得以 相對(duì)分子質(zhì)量 較小 較長(zhǎng) 較慢 較大 凝膠外部 較短 較快 分離 2 緩沖溶液 1 作用在一定范圍內(nèi) 抵制外界的對(duì)溶液pH的影響 維持pH 2 配制由1 2種溶解于水中配制而成 通過(guò)就可以得到在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液 酸和堿 基本不變 緩沖劑 調(diào)節(jié)緩沖劑 的比例 3 電泳 1 概念指在電場(chǎng)的作用下發(fā)生的過(guò)程 2 原理在一定的下 多肽 核酸等生物大分子的可解離基團(tuán)會(huì)帶上或 在電場(chǎng)的作用下 這些帶電分子會(huì)向著的電極移動(dòng) 帶電粒子 遷移 pH 正電 負(fù)電 與其所帶電荷相反 3 作用電泳利用了待分離樣品中各種分子的差異及分子本身的 的不同 使帶電分子產(chǎn)生不同的 從而實(shí)現(xiàn)樣品中 4 方法常用的電泳方法有和 測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)通常使用 帶電性質(zhì) 大小 形狀 遷移速度 各種分子的分離 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 思維激活1 凝膠色譜法和電泳法在實(shí)現(xiàn)分子分離的原理方面有何不同 提示凝膠色譜法分離分子是依據(jù)分子質(zhì)量大小 利用凝膠色譜柱使大分子優(yōu)先洗脫出來(lái) 而小分子后分離出來(lái) 電泳法分離分子則是依據(jù)各種分子帶電性質(zhì)的差異 以及分子本身的大小 形狀不同 使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度 從而實(shí)現(xiàn)在電場(chǎng)中將各種分子分離 蛋白質(zhì)分離的依據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異 如分子的形狀和大小 所帶電荷的性質(zhì)和多少 溶解度 吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等 可以用來(lái)分離不同種類的蛋白質(zhì) 1 凝膠色譜法 2 電泳法 含義 帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程 原理 一些生物大分子具有可解離的基團(tuán) 在一定pH下 會(huì)帶上正電或負(fù)電 在電場(chǎng)的作用下 這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng) 因各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小 形狀不同 遷移速度不同 從而實(shí)現(xiàn)各種分子的分離 常用方法 瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳 在測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量時(shí) 通常使用SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 此方法也可用來(lái)分離蛋白質(zhì)混合組分 亞基 鞏固1 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理依據(jù)是 A 根據(jù)蛋白質(zhì)分子與凝膠的親和力的大小B 根據(jù)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小C 根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的多少D 根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的大小解析凝膠色譜法所用的凝膠實(shí)際上是一些微小多孔的球體 在小球內(nèi)部有許多貫穿的通道 相對(duì)分子質(zhì)量小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道 路程較長(zhǎng) 移動(dòng)速度較慢 相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)只能在凝膠外部移動(dòng) 路程較短 移動(dòng)速度較快 相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離 答案B 1 蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步 和 2 樣品處理 1 紅細(xì)胞的洗滌采集血樣 吸取血漿后加洗滌 再低速短時(shí)間離心 如此重復(fù)洗滌三次 直至上清液中沒(méi)有黃色 目的是 以利于后續(xù)步驟的分離純化 血紅蛋白提取和分離的實(shí)驗(yàn)操作與評(píng)價(jià) 樣品處理 粗分離 純化 純度鑒定 低速短時(shí)間離心 生理鹽水 除去雜質(zhì) 2 血紅蛋白的釋放將洗滌好的紅細(xì)胞依次加入至原血液體積 40 體積的 置于磁力攪拌器上攪拌10min 使紅細(xì)胞吸水 血紅蛋白釋放出來(lái) 3 分離血紅蛋白溶液將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到中 以2000r min的速度10min 使血紅蛋白和其他雜質(zhì)分離開(kāi) 便于下一步對(duì)血紅蛋白的純化 蒸餾水 甲苯 漲破 離心管 離心 4 透析取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中 將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量濃度為20mmol L的中 pH為7 0 透析12h 以除去樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì) 3 凝膠色譜操作 1 凝膠色譜柱的制作 準(zhǔn)備材料 加工橡皮塞 安裝 2 凝膠色譜柱的裝填 3 樣品的 磷酸緩沖液 色譜柱 加入和洗脫 4 操作提示 1 紅細(xì)胞的洗滌 與十分重要 洗滌次數(shù)過(guò)少 無(wú)法除去 離心速度和時(shí)間會(huì)使等一同沉淀 達(dá)不到分離效果 2 色譜柱填料的處理商品凝膠使用前需直接放在中膨脹 可以將加入其中的濕凝膠 加速膨脹 洗滌次數(shù) 離心速度 離心時(shí)間 血漿蛋白 過(guò)高 過(guò)長(zhǎng) 白細(xì)胞 洗脫液 用沸水浴加熱 3 凝膠色譜柱的裝填在裝填凝膠柱時(shí) 不得有存在 因其能攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的 降低分離效果 4 蛋白質(zhì)的分離如果 說(shuō)明色譜柱制作成功 氣泡 洗脫次序 紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng) 思維激活2 透析的目的是什么 依據(jù)了什么原理 提示透析的目的在于去除血紅蛋白溶液中相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì) 透析依據(jù)的原理是半透膜只允許小分子透過(guò) 不允許大分子透過(guò) 1 樣品的處理 1 紅細(xì)胞的洗滌 目的 去除雜蛋白 方法a 采集血樣 b 低速短時(shí)間離心 c 吸取血漿 d 鹽水洗滌 e 低速離心 重復(fù)d e步驟三次 2 血紅蛋白的釋放紅細(xì)胞在蒸餾水和甲苯的作用下破裂 釋放出血紅蛋白 3 分離血紅蛋白溶液 將混合液進(jìn)行離心后 會(huì)明顯看到試管中的溶液的分層情況 從上往下 第1層 無(wú)色透明的甲苯層 第2層 脂溶性物質(zhì)的沉淀層 白色薄層固體 第3層 血紅蛋白的水溶液 紅色透明液體 第4層 其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物 將液體用濾紙過(guò)濾 除去脂溶性沉淀層 于分液漏斗中靜置片刻后 分出下層的紅色透明液體 目的 經(jīng)過(guò)離心使血紅蛋白和其他雜質(zhì)分離開(kāi)來(lái) 便于下一步對(duì)血紅蛋白的純化 4 透析 原理 透析袋能使小分子自由進(jìn)出 而將大分子保留在袋內(nèi) 過(guò)程 取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中 將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量濃度為20mmol L的磷酸緩沖液中 pH為7 0 透析12h 目的 a 除去樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì) b 用于更換樣品的緩沖液 2 凝膠色譜操作 3 純度鑒定 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷純化的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求 需要進(jìn)行蛋白質(zhì)純度的鑒定 鑒定的方法中 使用最多的是SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 4 結(jié)果分析與評(píng)價(jià) 特別提醒SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量 是根據(jù)大多數(shù)蛋白質(zhì)都能與陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉 SDS 按重量比結(jié)合成復(fù)合物 使蛋白質(zhì)分子所帶的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)天然蛋白質(zhì)分子的負(fù)電荷 消除了不同蛋白質(zhì)分子的電荷效應(yīng) 使蛋白質(zhì)分子相對(duì)遷移率的大小完全取決于相對(duì)分子質(zhì)量的高低 因此可從已知相對(duì)分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的對(duì)數(shù)和相對(duì)遷移率所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出供試品的相對(duì)分子質(zhì)量 鞏固2 在血紅蛋白的整個(gè)提取過(guò)程中 不斷用磷酸緩沖液處理的目的是 A 防止血紅蛋白被氧化B 血紅蛋白是一種兩性物質(zhì) 需要酸中和C 磷酸緩沖液會(huì)加速血紅蛋白的提取過(guò)程D 讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi) 維持其結(jié)構(gòu)和功能解析利用磷酸緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的pH環(huán)境 保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能 便于分離觀察 紅色 和研究 活性 答案D 例1 下圖中 可表示為相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的移動(dòng)過(guò)程的是 血紅蛋白提取和分離的基本原理 思維導(dǎo)圖 深度剖析本題考查凝膠色譜法原理 根據(jù)分子篩效應(yīng)可知 相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子通過(guò)的路程較短 移動(dòng)速度較快 相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子通過(guò)的路程較長(zhǎng) 移動(dòng)速度較慢 因此 樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出 相對(duì)分子質(zhì)量最小的分子最后流出 故選B 答案B 特別提醒血紅蛋白的分離方法及相關(guān)原理比較 例2 下圖是用除去DNA的濾液進(jìn)行血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)的裝置 下列有關(guān)敘述不正確的是 血紅蛋白提取和分離的實(shí)驗(yàn)操作 A 首先用圖甲裝置對(duì)濾液進(jìn)行處理 其目的是去除相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)B 圖乙裝置的試管中收集到的液體中最先出現(xiàn)的是相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)C 用圖乙裝置分離血紅蛋白時(shí) 待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí) 用試管收集流出液 每管收集5mL 連續(xù)收集D 圖丙裝置中電泳法分離提純血紅蛋白的原理是血紅蛋白帶有一定量的電荷 在電場(chǎng)的作用下向一極移動(dòng) 思維導(dǎo)圖 深度剖析用圖甲裝置對(duì)濾液進(jìn)行處理 其目的是去除相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì) 圖乙裝置表示通過(guò)凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過(guò)程 蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量較大 被排阻在凝膠顆粒的外面 在顆粒之間迅速通過(guò) 答案B 歸納整合 蛋白質(zhì)的提取和分離 單擊此處進(jìn)入隨堂達(dá)標(biāo)檢測(cè) 旁欄思考題你能從凝膠色譜的分離原理分析為什么凝膠的裝填要緊密 均勻嗎 答案凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體 小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道 相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部 只能分布在顆粒之間 通過(guò)的路程較短 移動(dòng)速度較快 相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道 通過(guò)的路程較長(zhǎng) 移動(dòng)速度較慢 因此 樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出 相對(duì)分子質(zhì)量中等的分子后流出 相對(duì)分子質(zhì)量最小的分子最后流出 從而使各種相對(duì)分子質(zhì)量不同的分子得以分離 如果凝膠裝填得不夠緊密 均勻 就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無(wú)效的空隙 使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過(guò) 攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序 影響分離的效果 練習(xí)1 解析本題考查凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理 該方法的原理的核心是利用了不同體積 大小 的蛋白質(zhì)在凝膠中的遷移速度不同以達(dá)到分離的目的 答案凝膠色譜法也稱為分配色譜法 它是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法 所用的凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體 這些小球體大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成 小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道 當(dāng)一個(gè)含有各種分子的樣品溶液緩慢流經(jīng)時(shí) 各分子在色譜柱內(nèi)進(jìn)行兩種不同的運(yùn)動(dòng) 即垂直向下的運(yùn)動(dòng)和無(wú)規(guī)則的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng) 相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部 只能分布在顆粒之間 通過(guò)的路程較短 移動(dòng)速度較快 相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道 通過(guò)的路程較長(zhǎng) 移動(dòng)速度較慢 因此 樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出 相對(duì)分子質(zhì)量中等的分子后流出 相對(duì)分子質(zhì)量最小的分子最后流出 這種現(xiàn)象又叫分子篩現(xiàn)象 此外 凝膠本身具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 相對(duì)分子質(zhì)量大的分子通過(guò)這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的空隙時(shí)阻力大 而相對(duì)分子質(zhì)量小的分子通過(guò)時(shí)阻力小 因此不同相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)分子可以獲得分離 2 答案在一定范圍內(nèi) 能對(duì)抗外來(lái)少量強(qiáng)酸 強(qiáng)堿或稍加稀釋不引起溶液pH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用 具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液 緩沖溶液通常是由一或兩種化合物 緩沖劑 溶解于水中制得 調(diào)節(jié)緩沖劑的配比就可制得不同pH范圍的緩沖液 緩沖溶液的作用是維持反應(yīng)體系的pH不變 在生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)過(guò)程都是在精確的pH下進(jìn)行的 受到氫離子濃度的嚴(yán)格調(diào)控 為了在實(shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確地模擬生物體內(nèi)的環(huán)境 就必須保持體外生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程有與體內(nèi)反應(yīng)過(guò)程完全相同的pH 3 解析本題考查電泳法分離蛋白質(zhì)的原理 此方法的核心是利用電場(chǎng)力使帶電性質(zhì)不同或體積不同的蛋白質(zhì)分離 答案電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程 許多重要的生物大分子 如氨基酸 多肽 蛋白質(zhì) 核苷酸 核酸等都具有可解離基團(tuán) 它們?cè)谀硞€(gè)特定的pH下會(huì)帶上正電或負(fù)電 在電場(chǎng)的作用下 這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極方向移動(dòng) 電泳技術(shù)就是在電場(chǎng)的作用下 利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小 形狀等性質(zhì)的差異 使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度 從而達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行分離 鑒定或提純的目的 4 解析從生物材料中分離生物大分子的方法較為復(fù)雜 因?yàn)樯锊牧现泻械某煞址浅?fù)雜 需要逐一除去 答案血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步 樣品處理 粗分離 純化和純度鑒定 首先通過(guò)洗滌紅細(xì)胞 血紅蛋白的釋放 離心等操作收集到血紅蛋白溶液 即樣品的處理 再經(jīng)過(guò)透析去除相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì) 即樣品的粗分離 然后通過(guò)凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去 即樣品的純化 最后經(jīng)SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定 5 答案血紅蛋白是有色蛋白 因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過(guò)觀察顏色來(lái)判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液 這使血紅蛋白的分離過(guò)程非常直觀 大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作 同學(xué)們 來(lái)學(xué)校和回家的路上要注意安全 同學(xué)們 來(lái)學(xué)校和回家的路上要注意安全