動(dòng)物墊料中綠膿桿菌檢測(cè)方法 編制說(shuō)明 2019.12.20

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DB15/T XXXXX—XXXX 編制說(shuō)明 項(xiàng)目名稱：動(dòng)物墊料中綠膿桿菌檢測(cè) 項(xiàng)目編號(hào)：內(nèi)質(zhì)監(jiān)標(biāo)函（2018）154號(hào)-106 編制單位：呼和浩特海關(guān) 編制時(shí)間：2018.05-2019.10 一、 工作簡(jiǎn)況 本標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)《關(guān)于下達(dá)2018年第一批內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目計(jì)劃的通知》[內(nèi)質(zhì)監(jiān)標(biāo)函（2018）154號(hào)]，本標(biāo)準(zhǔn)是由中華人民共和國(guó)呼和浩特海關(guān)提出并歸口，項(xiàng)目計(jì)劃編號(hào)為106。呼和浩特海關(guān)牽頭成立由相關(guān)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員和具有標(biāo)準(zhǔn)化專(zhuān)業(yè)知識(shí)的人員組成的標(biāo)準(zhǔn)起草組。起草組在充分調(diào)查研究、綜合分析和試驗(yàn)驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，起草標(biāo)準(zhǔn)初稿和編制說(shuō)明，并廣泛征求意見(jiàn)。對(duì)意見(jiàn)進(jìn)行匯總整理，修改完善標(biāo)準(zhǔn)初稿，形成地方標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿。 第一起草單位：中華人民共和國(guó)呼和浩特海關(guān)；第二起草單位：二連浩特海關(guān)；第三起草單位：二連浩特市疾病預(yù)防控制中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：趙治國(guó)、敖威華、楊帆、延涵、王海艷、陳林軍、崔強(qiáng)、韓祎陟、郭文麗、馬彩霞。 二、標(biāo)準(zhǔn)制定的背景及意義 動(dòng)物墊料與動(dòng)物關(guān)系密切。近年來(lái)隨著生物科學(xué)研究的飛速發(fā)展，動(dòng)物作為其研究中不可缺少的重要組成部分，備受各國(guó)政府的重視和科學(xué)家的關(guān)注。墊料是為動(dòng)物營(yíng)造舒適的人工環(huán)境，進(jìn)行環(huán)境控制的基礎(chǔ)條件和必要材料，是對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生直接作用和影響的環(huán)境因素。動(dòng)物墊料與動(dòng)物健康、福利息息相關(guān)，同時(shí)也對(duì)養(yǎng)殖業(yè)、動(dòng)物及其相關(guān)科研方面甚至社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展有十分重大的影響。因此，墊料的質(zhì)量評(píng)定與控制非常必要。 我國(guó)動(dòng)物墊料標(biāo)準(zhǔn)化、商品化尚處于初級(jí)階段。歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家早已實(shí)行墊料商品化生產(chǎn)，有專(zhuān)業(yè)的工廠，并且各道工序的質(zhì)量要求非常嚴(yán)格。但我國(guó)對(duì)動(dòng)物墊料的研究還處于初級(jí)階段，與墊料相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道甚少，墊料生產(chǎn)監(jiān)管環(huán)節(jié)薄弱，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)缺乏。近年來(lái)我國(guó)政府及從業(yè)人員逐漸認(rèn)識(shí)到動(dòng)物墊料中存在的問(wèn)題，開(kāi)始對(duì)墊料質(zhì)量評(píng)價(jià)方面的問(wèn)題進(jìn)行改進(jìn)。因此要想使動(dòng)物的質(zhì)量管理與國(guó)際接軌，動(dòng)物墊料生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化、商品化就變得至關(guān)重要。 我國(guó)動(dòng)物墊料標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量管理相對(duì)滯后，影響相關(guān)行業(yè)發(fā)展。我國(guó)對(duì)動(dòng)物墊料的研究才剛剛起步，現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)管理?xiàng)l例中，對(duì)動(dòng)物墊料的標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)定幾乎空白，稀數(shù)資料對(duì)于墊料的規(guī)定只有：應(yīng)選用吸濕性好、塵埃少、無(wú)異味、無(wú)毒性、無(wú)油脂的材料；須經(jīng)消毒、滅菌后方可使用。如此籠統(tǒng)的規(guī)定在一定程度上制約了我國(guó)動(dòng)物墊料標(biāo)準(zhǔn)不能緊跟國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)限制了藥品、生物制品、動(dòng)物等產(chǎn)品的出口，還使科研論文將不能被同行接受。因此要想提高相關(guān)學(xué)科競(jìng)爭(zhēng)力，就必須加強(qiáng)墊料標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量管理，從動(dòng)物墊料微生物指標(biāo)監(jiān)測(cè)入手。 我國(guó)動(dòng)物墊料微生物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)幾乎空白，亟待建立相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。近年來(lái)，我國(guó)政府及從業(yè)人員逐漸認(rèn)識(shí)到動(dòng)物墊料對(duì)動(dòng)物健康及下游產(chǎn)業(yè)的重大意義，墊料相關(guān)研究報(bào)道逐年增多，積累了一定的理論基礎(chǔ)。但目前，我國(guó)尚未對(duì)國(guó)內(nèi)墊料質(zhì)量建立統(tǒng)一評(píng)價(jià)體系、風(fēng)險(xiǎn)分析、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及配套法規(guī)。其中，墊料中微生物特別是致病微生物的含量對(duì)動(dòng)物健康、福利和產(chǎn)品等影響重大，但目前動(dòng)物墊料中微生物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)屬于空白，亟待建立科學(xué)完善的動(dòng)物墊料微生物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，該工作將對(duì)國(guó)內(nèi)墊料建立統(tǒng)一質(zhì)量評(píng)價(jià)體系、風(fēng)險(xiǎn)分析及產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)等有力促進(jìn)。 動(dòng)物墊料中綠膿桿菌對(duì)動(dòng)物的危害極大。動(dòng)物墊料綠膿桿菌是影響動(dòng)物健康和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的國(guó)際公認(rèn)的重要環(huán)境因素之一，因此動(dòng)物墊料中綠膿桿菌的檢測(cè)十分重要。綠膿桿菌是人獸共患的一種條件性病原菌。在自然界分布極廣,是多種家畜、經(jīng)濟(jì)動(dòng)物以及野生動(dòng)物和人都可感染的一種傳染病，對(duì)人畜危害嚴(yán)重。病畜及帶菌動(dòng)物是主要傳染源，經(jīng)消化道、呼吸道及傷口感染。是燒傷、外傷和術(shù)后感染的主要病原菌, 綠膿桿菌感染可發(fā)生在人體任何部位和組織、常見(jiàn)于燒傷或創(chuàng)傷部位、中耳、角膜、尿道和呼吸道。也可引起心內(nèi)膜炎、胃腸炎、膿胸甚至敗血癥。綠膿桿菌經(jīng)常由傷口、燒傷部位、外科手術(shù)或治療、檢驗(yàn)用各種插管，甚至使用不當(dāng)?shù)碾[形眼鏡，而侵入人體。一旦綠膿桿菌侵入患者組織或血液后，常出現(xiàn)各種不同的臨床癥狀，如急性眼內(nèi)炎；或在囊狀纖維瘤患者身上，出現(xiàn)慢性呼吸道感染，進(jìn)而演變成慢性肺炎；在免疫力缺失的癌癥患者或嚴(yán)重的燒傷病人身上，則出現(xiàn)急性的肺炎或菌毒血癥。院內(nèi)感染綠膿桿菌所引起的肺炎或菌毒血癥，致死率更高達(dá)70％，其中主要的致病因子是綠膿桿菌外毒素Ａ。據(jù)報(bào)道10％在醫(yī)院感染的病癥都是由綠膿桿菌所引致的，居病原菌之首。國(guó)內(nèi)外燒傷中心對(duì)細(xì)菌感染的臨床調(diào)查中發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌感染占50％以上。基于以上致病性，綠膿桿菌是疾病診斷中必檢微生物之一。禽類(lèi)感染可呈現(xiàn)卡他性或出血性腸炎,或發(fā)生眼角膜炎。也可與葡萄球菌等混合感染呈現(xiàn)呼吸道疾病。綠膿桿菌也是奶牛乳房炎的重要病原菌之一。它引起的疾病不論在發(fā)達(dá)國(guó)家還是在發(fā)展中國(guó)家都嚴(yán)重地?fù)p害著動(dòng)物及人類(lèi)的健康，也給養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。綠膿桿菌病的危害如此之大，使用綠膿桿菌污染的墊料容易引起動(dòng)物發(fā)病，含有綠膿桿菌的動(dòng)物產(chǎn)品又會(huì)導(dǎo)致公共衛(wèi)生事件的發(fā)生。動(dòng)物體內(nèi)排出的綠膿桿菌，也可能污染食物導(dǎo)致人的食物中毒。因此檢測(cè)墊料中綠膿桿菌成為重中之重。 建立動(dòng)物墊料綠膿桿菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，保障動(dòng)物健康急不可待。動(dòng)物墊料與動(dòng)物糞便直接接觸，容易滋生細(xì)菌，尤其是腸道致病微生物，致使墊料被綠膿桿菌污染，從而威脅動(dòng)物的健康與福利，并且對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展與國(guó)際間動(dòng)物及產(chǎn)品貿(mào)易帶來(lái)巨大的影響，甚至威脅到人類(lèi)社會(huì)的生產(chǎn)與生活。但是對(duì)于動(dòng)物墊料綠膿桿菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)幾乎空白，還沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和方法，所以建立動(dòng)物墊料綠膿桿菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)已刻不容緩。 本實(shí)驗(yàn)室具有多年微生物檢測(cè)的經(jīng)驗(yàn)，本方法的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，在檢測(cè)技術(shù)方面填補(bǔ)我區(qū)的空白、彌補(bǔ)了自治區(qū)沒(méi)有現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的不足，能夠使動(dòng)物墊料中綠膿桿菌的檢測(cè)更加高效、準(zhǔn)確、安全。本方法的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用將會(huì)使我區(qū)在動(dòng)物墊料中綠膿桿菌的檢測(cè)先進(jìn)性方面達(dá)到國(guó)內(nèi)領(lǐng)先水平，為我區(qū)動(dòng)物墊料質(zhì)量安全管理部門(mén)更快更好的管控提供可靠保障。因此，加強(qiáng)動(dòng)物墊料中綠膿桿菌的檢測(cè)對(duì)確保全區(qū)農(nóng)業(yè)持續(xù)、健康發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 三、主要起草過(guò)程 2018.05-2018.08 地標(biāo)前期基礎(chǔ)工作：收集動(dòng)物墊料樣本，查閱綠膿桿菌資料，檢索綠膿桿菌檢測(cè)的相關(guān)文獻(xiàn)及標(biāo)準(zhǔn)。 2018.09-2019.07 前期實(shí)驗(yàn)條件的摸索：包括前處理方法的優(yōu)化、對(duì)照，不同墊料中綠膿桿菌的檢出率，最終確定實(shí)驗(yàn)方案，編寫(xiě)編制說(shuō)明。 2019.08-2019.09 驗(yàn)證單位進(jìn)行驗(yàn)證。 2019.10 編寫(xiě)地標(biāo)并定初稿。 四、現(xiàn)行法律、法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系 本標(biāo)準(zhǔn)遵循GB/T 1.1-2009 《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)》和GB/T 20001.4-2015 《標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)規(guī)則 第4部分：試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)則編寫(xiě)。還參照相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)指南的要求。 在編制本標(biāo)準(zhǔn)的過(guò)程中參考了以下標(biāo)準(zhǔn)：ISO 22717:2015 《Cosmetics. Microbiology. Detection of Pseudomonas aeruginosa》、AOAC Official Method 991.49 《Testing Disinfectants Against Pseudomonas aeruginosa》、SN/T 2099《進(jìn)出口食品中綠膿桿菌檢測(cè)方法》、GB 7918.4《化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 綠膿桿菌》、DB 22/T 394.3-2017《保健用品微生物檢驗(yàn)方法 第3部分：銅綠假單胞菌測(cè)定》、GB 8538-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》、GB/T 14926.17-2001《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 綠膿桿菌檢驗(yàn)方法》、SN/T 4458-2016《出口中藥材微生物學(xué)檢驗(yàn)》；綜合參考了國(guó)內(nèi)外與綠膿桿菌檢測(cè)相關(guān)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，力求該標(biāo)準(zhǔn)能夠高效準(zhǔn)確的檢測(cè)墊料中綠膿桿菌，同時(shí)兼顧標(biāo)準(zhǔn)的廣泛應(yīng)用。 本標(biāo)準(zhǔn)完全符合現(xiàn)行法律法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，不存在任何與現(xiàn)行法律法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)相違背之處。相關(guān)強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)2項(xiàng)：GB 14925-2010 《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 環(huán)境及設(shè)施》，本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)備和環(huán)境的技術(shù)要求及檢測(cè)方法，同時(shí)規(guī)定了墊料、飲水和籠具的原則要求。但針對(duì)墊料該標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定了“墊料的材質(zhì)應(yīng)符合動(dòng)物的健康和福利要求，應(yīng)滿足吸濕性好、塵埃少、無(wú)異味、無(wú)毒性、無(wú)油脂、耐高溫、耐高壓等條件；墊料必須經(jīng)滅菌處理后方可使用”，本地標(biāo)適用于墊料中綠膿桿菌檢測(cè)，明確規(guī)定了不同類(lèi)別墊料取樣方法，標(biāo)準(zhǔn)中綠膿桿菌鑒定過(guò)程增加了新的鑒定手段，確保檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。 5、 主要內(nèi)容及檢測(cè)方法的確定 5.1 取樣方法的確定及優(yōu)化 根據(jù)動(dòng)物墊料的物理性狀將其分為顆粒狀/粉末狀墊料和平面狀墊料，針對(duì)不同性狀的墊料采取不同的取樣方法。 5.1.1 顆粒狀或粉末墊料樣品取樣方法 國(guó)內(nèi)外食品和飼料中霉菌檢測(cè)法中常用的取樣方法為稱取法，本標(biāo)準(zhǔn)中針對(duì)顆粒狀或粉末墊料樣品（木屑、玉米芯、秸稈、紙屑等）參考通用做法采用稱取25 g的方法進(jìn)行取樣。 5.1.2 平面墊料樣品取樣方法 針對(duì)平面墊料（膠墊、托盤(pán)等）采用表面涂抹取樣法，無(wú)菌操作將涂抹25 cm2～100 cm2平面樣品的棉拭子置入裝有 25 mL～100 mLSCDLP中，混勻作為原液。 5.2 增菌液和培養(yǎng)基的選擇 5.2.1 增菌液的選擇 國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)和資料中用到的增菌液主要有：SCDLP液體培養(yǎng)基、NAC液體培養(yǎng)基、滅菌生理鹽水、磷酸鹽緩沖稀釋液和營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）等。不同標(biāo)準(zhǔn)中使用最多的是SCDLP，本標(biāo)準(zhǔn)也選用該增菌液。 5.2.2 分離培養(yǎng)基 本標(biāo)準(zhǔn)選用的綠膿桿菌分離培養(yǎng)基為國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)中比較認(rèn)可的假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基、假單胞菌CN選擇性培養(yǎng)基，在保證檢測(cè)結(jié)果的同時(shí)，兼顧不同標(biāo)準(zhǔn)所用培養(yǎng)基的一致性，節(jié)約實(shí)驗(yàn)室成本。 5.3 典型或可疑菌落的鑒定 本標(biāo)準(zhǔn)對(duì)典型或可疑菌落的鑒定過(guò)程，參考了國(guó)內(nèi)外綠膿桿菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和藥典等成熟做法，綜合了生化反應(yīng)等必要鑒定過(guò)程，并囊括了全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)和飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)方法，做到了與國(guó)際接軌，縮短檢測(cè)時(shí)間，增加檢測(cè)通量，減少檢測(cè)人員工作量。 5.4 培養(yǎng)時(shí)間和溫度 最新的ISO 22717:2015采用了32.5℃2.5℃的預(yù)增菌溫度，使綠膿桿菌培養(yǎng)溫度范圍擴(kuò)大為為30℃~35℃，而我國(guó)常用的綠膿桿菌培養(yǎng)溫度為36℃1℃，也在這一范圍內(nèi)，本標(biāo)準(zhǔn)將繼續(xù)采用我國(guó)常用的36℃1℃對(duì)綠膿桿菌進(jìn)行檢測(cè)培養(yǎng)。本標(biāo)準(zhǔn)各種培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)間也與國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)常用時(shí)間相統(tǒng)一。 六、方法驗(yàn)證 為驗(yàn)證本方法的有效性和適用性，選擇5家不同行業(yè)的檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)本方法進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證內(nèi)容為方法的適用性、準(zhǔn)確度、檢出率及相關(guān)樣品的檢測(cè)，結(jié)果顯示該方法穩(wěn)定可靠，符合相關(guān)要求。 七、結(jié)論 綜上所述，本標(biāo)準(zhǔn)在制定過(guò)程中所涉及到的各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均經(jīng)過(guò)方法學(xué)的驗(yàn)證，并切實(shí)可行，完全達(dá)到了編制標(biāo)準(zhǔn)的要求。 八、重大意見(jiàn)分歧的處理依據(jù)和結(jié)果 未發(fā)生。 九、國(guó)內(nèi)外情況簡(jiǎn)要說(shuō)明 國(guó)內(nèi)尚沒(méi)有建立統(tǒng)一的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。檢索國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)1項(xiàng)和地方標(biāo)準(zhǔn)2項(xiàng)：GB 14925-2010 《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 環(huán)境及設(shè)施》、江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)DB 32/T 2129-2012 《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 墊料》、北京市地方標(biāo)準(zhǔn)DB 11/T 1126-2014《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 墊料》。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道尚未發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古自治區(qū)內(nèi)有相關(guān)單位從事這項(xiàng)研究。 10、 標(biāo)準(zhǔn)草稿征求意見(jiàn)情況匯總表 序號(hào) 意見(jiàn) 提出單位/專(zhuān)家 采納 不采納（說(shuō)明原因） 1 建議在標(biāo)準(zhǔn)適當(dāng)位置增加“綠膿桿菌檢測(cè)流程圖”。 二連浩特海關(guān)技術(shù)中心/王伊琴 采納 2 建議將新型“飛行時(shí)間質(zhì)譜法”加入到標(biāo)準(zhǔn)。 包頭海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心/張鵬翔 采納 3 建議只保留綠膿菌素、硝酸鹽還原產(chǎn)氣、明膠液化、42℃生長(zhǎng)試驗(yàn)，去掉乙酰胺、葡萄糖酸鹽、精氨酸雙水解酶試驗(yàn)。 蘭州海關(guān)技術(shù)中心/張宇霞 采納 4 平面墊料樣品應(yīng)用表格方式給出采樣量。 貴陽(yáng)海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心/羅阿東 采納 5 無(wú) 參考文獻(xiàn)： [1] GB/T 1.1-2009標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)規(guī)則. [2] GB/T 20001.4-2015標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)規(guī)則 第4部分：試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn). [3] GB 14925-2010實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 環(huán)境及設(shè)施. [4] DB 32/T 2129-2012實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 墊料. [5] DB 11/T 1126-2014實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 墊料. [6] SN/T 2099-2008進(jìn)出口食品中綠膿桿菌檢測(cè)方法. [7] GB 7918.4-1987化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 綠膿桿菌. [8] DB 22/T 394.3-2017.保健用品微生物檢驗(yàn)方法 第3部分：銅綠假單胞菌測(cè)定. [9] GB 8538-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法. [10] GB/T 14926.17-2001實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 綠膿桿菌檢驗(yàn)方法. [11] SN/T 4458-2016出口中藥材微生物學(xué)檢驗(yàn). [12] ISO 22717:2015 Cosmetics. Microbiology. Detection of Pseudomonas aeruginosa. [13] AOAC Official Method 991.49 Testing Disinfectants Against Pseudomonas aeruginosa. 8