《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》word版.doc

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〔Ⅰ〕 理論部分 1. 緒論 歡迎同學(xué)們到生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室來！對(duì)于大多數(shù)學(xué)生來說，這不是第一次做化學(xué)實(shí)驗(yàn)，但是我們相信，生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)一定是大家最感興趣、最激動(dòng)人心的實(shí)驗(yàn)，當(dāng)然也是花費(fèi)最大、最辛苦的實(shí)驗(yàn)。同學(xué)們?cè)谶^去幾年中所學(xué)到的各種實(shí)驗(yàn)技術(shù)和操作技能，在這些實(shí)驗(yàn)中將會(huì)經(jīng)常用到，當(dāng)然更重要的是要學(xué)會(huì)一些新的、在生物化學(xué)的科學(xué)研究中最常用的實(shí)驗(yàn)方法。同學(xué)們?cè)谏锘瘜W(xué)實(shí)驗(yàn)方面要取得好成績，在很大程度上，取決于你們對(duì)這些專門化實(shí)驗(yàn)技術(shù)的熟練掌握和對(duì)生物化學(xué)原理的深入了解。 當(dāng)同學(xué)們進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，無疑將會(huì)與以前做的各種實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較。在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，大家會(huì)發(fā)現(xiàn)，極少有像無機(jī)化學(xué)和有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)菢舆M(jìn)行化學(xué)反應(yīng)和分離出“克”數(shù)量級(jí)的產(chǎn)物。同學(xué)們將進(jìn)行的是“毫克”和“微克”數(shù)量級(jí)的研究，并且在多數(shù)情況下，生物分子是溶解在溶液中的，而且往往看不到所研究的物質(zhì)，但是將會(huì)看到動(dòng)態(tài)的生物化學(xué)過程和由生物分子引起的生物化學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)中所用到的各種技術(shù)和方法，將起到“眼睛”的作用，用以對(duì)各種生物化學(xué)過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)。 同學(xué)們通過生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)應(yīng)該做到： ⑴ 學(xué)習(xí)設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)的基本思路，掌握各個(gè)實(shí)驗(yàn)的基本原理，學(xué)會(huì)嚴(yán)密地組織自己的實(shí)驗(yàn)，合理地安排實(shí)驗(yàn)步驟和時(shí)間。 ⑵ 訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)的動(dòng)手能力，學(xué)會(huì)熟練地使用各種生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器，包括各種天平、各種分光光度計(jì)、各種離心機(jī)、自動(dòng)部分收集器、恒流泵、核酸蛋白檢測(cè)儀、冰凍干燥機(jī)、酸度計(jì)、電導(dǎo)率儀、高速分散器、各種電泳裝置和搖床等等。 ⑶ 學(xué)會(huì)準(zhǔn)確翔實(shí)地記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和數(shù)據(jù)的技能，提高實(shí)驗(yàn)報(bào)告的寫作能力，能夠整齊清潔地進(jìn)行所有的實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致的科學(xué)作風(fēng)。 ⑷ 掌握生物化學(xué)的各種基本實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)技術(shù)，尤其是各種電泳技術(shù)和層析枝術(shù)，為今后參加科研工作打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 預(yù)祝同學(xué)們以優(yōu)異的成績跨進(jìn)這一新的科學(xué)殿堂，成為攀登生物科學(xué)高峰的新的勇士！ 1.1 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)發(fā)展簡史 生物科學(xué)在20世紀(jì)有驚人的發(fā)展，其中生物化學(xué)與分子生物學(xué)的進(jìn)展尤為迅速，這樣一門最具活力和生氣的實(shí)驗(yàn)科學(xué)，在21世紀(jì)必將成為帶頭的學(xué)科，這主要有賴于生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善。這里我們簡單回顧一下生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展歷史。 20年代： 微量分析技術(shù)導(dǎo)致了維生素、激素和輔酶等的發(fā)現(xiàn)。瑞典著名的化學(xué)家T.Svedberg奠基了“超離心技術(shù)”，1924年制成了第一臺(tái)5000g（5000 r/min～8000 r/min）相對(duì)離心力的超離心機(jī)(相對(duì)離心力“RCF”的單位可表示為“g”)，開創(chuàng)了生化物質(zhì)離心分離的先河，并準(zhǔn)確測(cè)定了血紅蛋白等復(fù)雜蛋白質(zhì)的分子量，獲得了1926年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 30年代： 電子顯微鏡技術(shù)打開了微觀世界，使我們能夠看到細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和生物大分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。 40年代： 層析技術(shù)大發(fā)展，兩位英國科學(xué)家Martin和Synge發(fā)明了分配色譜（層析），他們獲得了1952年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。由此，層析技術(shù)成為分離生化物質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)。 “電泳技術(shù)”是由瑞典的著名科學(xué)家Tisellius所奠基，從而開創(chuàng)了電泳技術(shù)的新時(shí)代，他因此獲得了1948年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 50年代： 自1935年Schoenheimer和Rittenberg首次將放射性同位素示蹤用于碳水化合物及類脂物質(zhì)的中間代謝的研究以后，“放射性同位素示蹤技術(shù)”在50年代有了大的發(fā)展，為各種生物化學(xué)代謝過程的闡明起了決定性的作用。 60年代： 各種儀器分析方法用于生物化學(xué)研究，取得了很大的發(fā)展，如HPLC技術(shù)、紅外、紫外、圓二色等光譜技術(shù)、NMR核磁共振技術(shù)等。自1958年Stem，Moore和Spackman設(shè)計(jì)出氨基酸自動(dòng)分析儀，大大加快了蛋白質(zhì)的分析工作。1967年Edman和Begg制成了多肽氨基酸序列分析儀，到1973年Moore和Stein設(shè)計(jì)出氨基酸序列自動(dòng)測(cè)定儀，又大大加快了對(duì)多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，十多年間氨基酸的自動(dòng)測(cè)定工作得到了很大的發(fā)展和完善。 1962年，美國科學(xué)家Watson和英國科學(xué)家Crick因?yàn)樵?953年提出的DNA分子反向平行雙螺旋模型而與英國科學(xué)家Wilkins分享了當(dāng)年的諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，后者通過對(duì)DNA分子的X-射線衍射研究證實(shí)了Watson和Crick的DNA模型，他們的研究成果開創(chuàng)了生物科學(xué)的歷史新紀(jì)元。在X-射線衍射技術(shù)方面，英國物理學(xué)家Perutz對(duì)血紅蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行X-射線結(jié)構(gòu)分析, Kendrew測(cè)定了肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)，成為研究生物大分子空間立體結(jié)構(gòu)的先驅(qū)，他們同獲1962年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 此外，在60年代，層析和電泳技術(shù)又有了重大的進(jìn)展，在1968—1972年Anfinsen創(chuàng)建了親和層析技術(shù)，開辟了層析技術(shù)的新領(lǐng)域。1969年Weber應(yīng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)測(cè)定了蛋白質(zhì)的分子量，使電泳技術(shù)取得了重大進(jìn)展。 70年代： 基因工程技術(shù)取得了突破性的進(jìn)展，Arber，Smith和Nathans三個(gè)小組發(fā)現(xiàn)并純化了限制性內(nèi)切酶，1972年，美國斯坦福大學(xué)的Berg等人首次用限制性內(nèi)切酶切割了DNA分子，并實(shí)現(xiàn)了DNA分子的重組。1973年，又由美國斯坦福大學(xué)的Cohen等人第一次完成了DNA重組體的轉(zhuǎn)化技術(shù)，這一年被定為基因工程的誕生年，Cohen成為基因工程的創(chuàng)始人，從此，生物化學(xué)進(jìn)入了一個(gè)新的大發(fā)展時(shí)期。與此同時(shí)，各種儀器分析手段進(jìn)一步發(fā)展，制成了DNA序列測(cè)定儀、DNA合成儀等。 80至90年代： 基因工程技術(shù)進(jìn)入輝煌發(fā)展的時(shí)期，1980年，英國劍橋大學(xué)的生物化學(xué)家Sanger和美國哈佛大學(xué)的Gilbert分別設(shè)計(jì)出兩種測(cè)定DNA分子內(nèi)核苷酸序列的方法，而與Berg共獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，從此，DNA序列分析法成為生物化學(xué)與分子生物學(xué)最重要的研究手段之一。他們3人在DNA重組和RNA結(jié)構(gòu)研究方面都作出了杰出的貢獻(xiàn)。 1981年由Jorgenson和Lukacs首先提出的高效毛細(xì)管電泳技術(shù)（HPCE），由于其高效、快速、經(jīng)濟(jì)，尤其適用于生物大分子的分析，因此受到生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和化學(xué)等學(xué)科的科學(xué)工作者的極大重視，發(fā)展極為迅速，是生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)和儀器分析領(lǐng)域的重大突破，意義深遠(yuǎn)?，F(xiàn)今，由于HPCE技術(shù)的異軍突起，HPLC技術(shù)的發(fā)展重點(diǎn)己轉(zhuǎn)到制備和下游技術(shù)。 1984年德國科學(xué)家Kohler、美國科學(xué)家Milstein和丹麥科學(xué)家Jerne由于發(fā)展了單克隆抗體技術(shù)，完善了極微量蛋白質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)而共享了諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 1985年美國加利福尼亞州Cetus公司的Mullis等發(fā)明了PCR技術(shù)（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的DNA擴(kuò)增技術(shù)，對(duì)于生物化學(xué)和分子生物學(xué)的研究工作具有劃時(shí)代的意義，因而與第一個(gè)設(shè)計(jì)基因定點(diǎn)突變的Smith共享1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 除上述歷史以外，還可以列出許多生物化學(xué)發(fā)展史上的重要成就，例如： 美國哈佛大學(xué)的Folin教授和中國的吳憲教授對(duì)生物化學(xué)常用的各種分析方法（血糖分析、蛋白質(zhì)含量分析、氨基酸測(cè)定等）的建立作出了歷史性的貢獻(xiàn)。 美國化學(xué)家Pauling確認(rèn)氫鍵在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中以及生物大分子間相互作用的重要性等，他獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 英藉德裔生物化學(xué)家Krebs，在1937年發(fā)現(xiàn)了三羧酸循環(huán)，對(duì)細(xì)胞代謝及分子生物學(xué)的研究作出了重要貢獻(xiàn)，他與美藉德裔生物化學(xué)家Lipmann共獲1953年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 英國生物化學(xué)家Sanger還于1953年確定了牛胰島素中氨基酸的精確順序而獲得1958年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 1959年，美藉西班牙裔科學(xué)家Uchoa發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的多核苷酸磷酸化酶，研究并重建了將基因內(nèi)的遺傳信息通過RNA中間體翻譯成蛋白質(zhì)的過程。他和Kornberg分享了當(dāng)年的諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，而后者的主要貢獻(xiàn)在于實(shí)現(xiàn)了DNA分子在細(xì)菌細(xì)胞和試管內(nèi)的復(fù)制。 美國生物化學(xué)家Nirenberg在破譯遺傳密碼方面作出了重要貢獻(xiàn)，Holly闡明了酵母丙氨酸t(yī)RNA的核苷酸排列順序，后來證明所有tRNA的結(jié)構(gòu)均相似。美藉印度裔生物化學(xué)家Khorana曾合成了精確結(jié)構(gòu)的己知核酸分子，并首次人工制成酵母基因。他們3人共獲1969年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 法國生物學(xué)家Lwoff、JAcob和生物化學(xué)家Monod由于在病毒DNA和mRNA等方面出色的大量研究工作而共獲1965年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 1988年，美國遺傳學(xué)家McClintock由于在二十世紀(jì)五十年代提出并發(fā)現(xiàn)了可移動(dòng)的遺傳因子而獲得諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 1989年，美國科學(xué)家Altman和Cech由于發(fā)現(xiàn)某些RNA具有酶的功能（稱為核酶）而共享諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 1993年，美國科學(xué)家Roberts和Sharp由于在斷裂基因方面的工作而榮獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 1994年，美國科學(xué)家Gilman和Rodbell由于發(fā)現(xiàn)了G蛋白在細(xì)胞內(nèi)信息傳導(dǎo)中的作用而分享諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 1995年，美國科學(xué)家Lewis、德國科學(xué)家Nusslein-Volhard和美國科學(xué)家Wieschaus由于在20世紀(jì)40～70年代先后獨(dú)立鑒定了控制果蠅體節(jié)發(fā)育基因而共享諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 我國生物化學(xué)界的先驅(qū)吳憲教授在20年代初由美回國后，在協(xié)和醫(yī)科大學(xué)生化系與汪猷、張昌穎等人一道完成了蛋白質(zhì)變性理論、血液生化檢測(cè)和免疫化學(xué)等一系列有重大影響的研究。1965年我國化學(xué)和生物化學(xué)家用化學(xué)方法在世界上首次人工合成了具有生物活性的結(jié)晶牛胰島素，1983年又通過大協(xié)作完成了酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸的人工合成。近年來，在酶學(xué)研究、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及生物膜的結(jié)構(gòu)與功能等方面都有舉世矚目的研究成果。 由近百年來生物化學(xué)及其實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展史可以看出，該學(xué)科的發(fā)展與實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展密切相關(guān)，每一種新的生化物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)與研究都離不開實(shí)驗(yàn)技術(shù)，實(shí)驗(yàn)技術(shù)每一次新的發(fā)明都大大推動(dòng)了生物化學(xué)研究的進(jìn)展，因而對(duì)于每一位現(xiàn)代生物科學(xué)工作者，尤其是生物化學(xué)工作者，學(xué)習(xí)并掌握各種生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)就是極為重要的。 1.2 實(shí)驗(yàn)室規(guī)則 ⑴ 實(shí)驗(yàn)前必須認(rèn)真預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，明確本次實(shí)驗(yàn)的目的和要求，掌握實(shí)驗(yàn)原理，寫好實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)報(bào)告，否則，不能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 ⑵ 實(shí)驗(yàn)時(shí)自覺遵守實(shí)驗(yàn)室紀(jì)律，保持室內(nèi)安靜，不大聲說笑和喧嘩。 ⑶ 實(shí)驗(yàn)過程中要聽從教師指導(dǎo)，認(rèn)真按照實(shí)驗(yàn)步驟和操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若想改進(jìn)和設(shè)計(jì)新的實(shí)驗(yàn)方法，必須取得教師的同意。實(shí)驗(yàn)時(shí)認(rèn)真進(jìn)行實(shí)驗(yàn)記錄，實(shí)驗(yàn)完畢及時(shí)整理數(shù)據(jù)，按時(shí)上交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。 ⑷ 實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、稱量臺(tái)、藥品架、水池以及各種實(shí)驗(yàn)儀器內(nèi)外都必須保持清潔整齊，藥品稱完后立即蓋好瓶蓋放回藥品架，嚴(yán)禁瓶蓋及藥勺混雜，切勿使藥品（尤其是NaOH）灑落在天平和實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上，毛刷用后必須立即掛好，各種器皿不得丟棄在水池內(nèi)。 ⑸ 配制試劑和用無離子水要注意節(jié)省，按實(shí)驗(yàn)實(shí)際使用量配制，多余的重要試劑和各種有機(jī)試劑要按教師要求進(jìn)行回收，昂貴的Sephadex、Sepharose凝膠和DEAE纖維素等，用后必須及時(shí)回收，不得丟棄。 ⑹ 配制的試劑和實(shí)驗(yàn)過程中的樣品，尤其是保存在冰箱和冷室中的樣品，必須貼上標(biāo)簽、寫上品名、濃度、姓名和日期等，放在冰箱中的易揮發(fā)溶液和酸性溶液，必須嚴(yán)密封口。 ⑺ 配制和使用洗液必須極為小心，強(qiáng)酸強(qiáng)堿必須倒入廢液缶或沖稀后排放。電泳后的凝膠和各種廢物不得倒入水池，只能倒入廢物桶。 ⑻ 使用貴重精密儀器應(yīng)嚴(yán)格遵守操作規(guī)程。使用分光光度計(jì)時(shí)不得將溶液灑在儀器內(nèi)外和地面上。使用高速冷凍離心機(jī)和ＨＰＬＣ等大型儀器必須經(jīng)過考核。儀器發(fā)生故障應(yīng)立即報(bào)告教師，未經(jīng)許可不得自己隨意檢修。 ⑼ 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)嚴(yán)禁吸煙、飲水和進(jìn)食， 嚴(yán)禁用嘴吸移液管和虹吸管。易燃液體不得接近明火和電爐，凡產(chǎn)生煙霧、有害氣體和不良?xì)馕兜膶?shí)驗(yàn)，均應(yīng)在通風(fēng)條件下進(jìn)行。 ⑽ 實(shí)驗(yàn)完畢必須及時(shí)洗凈并放好各種玻璃儀器，插好自動(dòng)部分收集器上的試管，保持實(shí)驗(yàn)臺(tái)面和實(shí)驗(yàn)柜內(nèi)的整潔。 ⑾ 每組的儀器和玻璃器皿要用油漆編號(hào)，嚴(yán)禁抄拿他組儀器，不得將器皿遺棄在分光光度計(jì)內(nèi)和其他實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上，打破了玻璃儀器要及時(shí)向教師報(bào)告，并自覺登記，學(xué)期結(jié)束時(shí)按規(guī)定進(jìn)行處理。 ⑿ 每位學(xué)生要熟悉實(shí)驗(yàn)室內(nèi)電閘的位置，烘箱和電爐用畢必須立即斷電，不得過夜使用， 要嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室安全用電規(guī)則和其他安全規(guī)則。 ⒀ 每日實(shí)驗(yàn)完畢，值日生要認(rèn)真做好實(shí)驗(yàn)室的衛(wèi)生值日工作。最后離開實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)人員，必須檢查并關(guān)好水、電、門、窗。 1.3 實(shí)驗(yàn)室安全及防護(hù)知識(shí) 在生化實(shí)驗(yàn)室中可以說是“五毒”俱全，即著火、爆炸、中毒、觸電和割傷的危險(xiǎn)均時(shí)刻存在。因此每一位在生化實(shí)驗(yàn)室工作的人員都必須有充分的安全意識(shí)，嚴(yán)格的防范措施和豐富實(shí)用的防護(hù)救治知識(shí)，一旦發(fā)生意外能正確地進(jìn)行處置，以防事故進(jìn)一步擴(kuò)大。 1.3.1 著火 生化實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常使用大量的有機(jī)溶劑，如甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等，而實(shí)驗(yàn)室又經(jīng)常使用電爐等火源，因此極易發(fā)生著火事故。常用有機(jī)溶劑的易燃性列表如下： 表1—1 常見有機(jī)液體的易燃性 名 稱 沸 點(diǎn)/℃ 閃 點(diǎn)※/℃ 自燃點(diǎn)※※/℃ 乙 醚 34.5 －40 180 丙 酮 56 －17 538 二硫化碳 46 －30 100 苯 80 －11 乙醇（95％） 78 12 400 ※ 閃點(diǎn)：液體表面的蒸汽和空氣的混合物在遇明火或火花時(shí)著火的最低溫度。 ※※ 自燃點(diǎn)：液體蒸汽在空氣中自燃時(shí)的溫度。 由上表可以看出：乙醚、二硫化碳、丙酮、和苯的閃點(diǎn)都很低，因此不得存于可能會(huì)產(chǎn)生電火花的普通冰箱內(nèi)。低閃點(diǎn)液體的蒸汽只需接觸紅熱物體的表面便會(huì)著火，其中二硫化碳尤其危險(xiǎn)。 預(yù)防火災(zāi)必須嚴(yán)格遵守以下操作規(guī)程： ⑴嚴(yán)禁在開口容器和密閉體系中用明火加熱有機(jī)溶劑，只能使用加熱套或水浴加熱。 ⑵廢有機(jī)溶劑不得倒入廢物桶，只能倒入回收瓶，以后再集中處理。量少時(shí)用水稀釋后排入下水道。 ⑶不得在烘箱內(nèi)存放、干燥、烘焙有機(jī)物。 ⑷在有明火的實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上不允許放置開口的有機(jī)溶劑或傾倒有機(jī)溶劑。 滅火方法： 實(shí)驗(yàn)室中一旦發(fā)生火災(zāi)切不可驚慌失措，要保持鎮(zhèn)靜，根據(jù)具體情況正確地進(jìn)行滅火或立即報(bào)火警（火警電話119）。 ⑴容器中的易燃物著火時(shí)，用滅火毯蓋滅。因己確證石棉有致癌性，故改用玻璃纖維布作滅火毯。 ⑵乙醇、丙酮等可溶于水的有機(jī)溶劑著火時(shí)可以用水滅火。汽油、乙醚、甲苯等有機(jī)溶劑著火時(shí)不能用水，只能用滅火毯和砂土蓋滅。 ⑶導(dǎo)線、電器和儀器著火時(shí)不能用水和二氧化碳滅火器滅火，應(yīng)先切斷電源，然后用1211滅火器（內(nèi)裝二氟一氯一溴甲烷）滅火。 ⑷個(gè)人衣服著火時(shí)，切勿慌張奔跑，以免風(fēng)助火勢(shì)，應(yīng)迅速脫衣，用水龍頭澆水滅火，火勢(shì)過大時(shí)可就地臥倒打滾壓滅火焰。 1.3.2 爆炸 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室防止爆炸事故是極為重要的，因?yàn)橐坏┍ㄆ錃牧O大，后果將十分嚴(yán)重。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用的易燃物蒸汽在空氣中的爆炸極限（體積％）見 表1—2。 加熱時(shí)會(huì)發(fā)生爆炸的混合物有：有機(jī)化合物～氧化銅、 濃硫酸～高錳酸鉀、 三氯甲烷～丙酮等。 常見的引起爆炸事故的原因有：①隨意混合化學(xué)藥品，并使其受熱、受摩擦和撞擊。 ②在密閉的體系中進(jìn)行蒸餾、回流等加熱操作。 ③在加壓或減壓實(shí)驗(yàn)中使用了不耐壓的玻璃儀器 ，或反應(yīng)過于激烈而失去控制。 ④易燃易爆氣體大量逸入室內(nèi)。 ⑤高壓氣瓶減壓伐摔壞或失靈。 表1—2 易燃物質(zhì)蒸汽在空氣中的爆炸極限 名 稱 爆炸極限（體積百分?jǐn)?shù)） 名 稱 爆炸極限（體積百分?jǐn)?shù)） 乙醚 1.9～36.5 丙酮 2.6～13 甲醇 6.7～36.5 乙醇 3.3～19 氫氣 4.1～74.2 乙炔 3.0～82 1.3.3 中毒 生化實(shí)驗(yàn)室常見的化學(xué)致癌物有：石棉、砷化物、鉻酸鹽、溴乙錠等。 劇毒物有：氰化物、砷化物、乙腈 、甲醇、氯化氫、汞及其化合物等。 中毒的原因主要是由于不慎吸入、誤食或由皮膚滲入。 中毒的預(yù)防： ①保護(hù)好眼睛最重要，使用有毒或有剌激性氣體時(shí)，必須配戴防護(hù)眼鏡，并應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。 ②取用毒品時(shí)必須配戴橡皮手套。 ③嚴(yán)禁用咀吸移液管，嚴(yán)禁在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飲水、進(jìn)食、吸煙，禁止赤膊和穿拖鞋。 ④不要用乙醇等有機(jī)溶劑擦洗濺灑在皮膚上的藥品。 中毒急救的方法主要有：①誤食了酸和堿，不要催吐，可先立即大量飲水，誤食堿者再喝些牛奶，誤食酸者，飲水后再服Mg(OH)2乳劑，最后飲些牛奶。②吸入了毒氣，立即轉(zhuǎn)移室外，解開衣領(lǐng)，休克者應(yīng)施以人工呼吸，但不要用口對(duì)口法。③ 砷和汞中毒者應(yīng)立即送醫(yī)院急救。 1.3.4 外傷 ⑴ 化學(xué)灼傷： ①眼睛灼傷或掉進(jìn)異物：眼內(nèi)若濺入任何化學(xué)藥品，應(yīng)立即用大量水沖洗十五分鐘，不可用稀酸或稀堿沖洗。若有玻璃碎片進(jìn)入眼內(nèi)則十分危險(xiǎn)，必須十分小心謹(jǐn)慎，不可自取，不可轉(zhuǎn)動(dòng)眼球，可任其流淚，若碎片不出，則用紗布輕輕包住眼睛急送醫(yī)院處理。若有木屑、塵粒等異物進(jìn)入，可由他人翻開眼瞼，用消毒棉簽輕輕取出或任其流淚，待異物排出后再滴幾滴魚肝油。 ②皮膚灼傷： (a)酸灼傷：先用大量水洗，再用稀NaHCO3或稀氨水浸洗，最后再用水洗。 (b)堿灼傷：先用大量水沖洗，再用１％硼酸或２％醋酸浸洗，最后再用水洗。 (c)溴灼傷：這很危險(xiǎn)，傷口不易愈合，一旦灼傷，立即用20％硫代硫酸鈉沖洗，再用大量水沖洗，包上消毒紗布后就醫(yī)。 ⑵燙傷：使用火焰、蒸汽、紅熱的玻璃和金屬時(shí)易發(fā)生燙傷，應(yīng)立即用大量水沖洗和浸泡，若起水泡不可挑破，包上紗布后就醫(yī)，輕度燙傷可涂抹魚肝油和燙傷膏等。 ⑶割傷： 這是生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室常見的傷害，要特別注意予防，尤其是在向橡皮塞中插入溫度計(jì)、玻璃管時(shí)一定要用水或甘油潤滑，用布包住玻璃管輕輕旋入，切不可用力過猛，若發(fā)生嚴(yán)重割傷時(shí)要立即包扎止血，就醫(yī)時(shí)務(wù)必檢查傷部神經(jīng)是否被切斷。 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)準(zhǔn)備一個(gè)完備的小藥箱，專供急救時(shí)使用。藥箱內(nèi)備有：醫(yī)用酒精、紅藥水、紫藥水、止血粉、創(chuàng)口貼、燙傷油膏（或萬花油）、魚肝油、1％硼酸溶液或2％醋酸溶液、1％碳酸氫鈉溶液、20％硫代硫酸鈉溶液、醫(yī)用鑷子和剪刀、紗布、藥棉、棉簽、繃帶等。 1.3.5 觸電： 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室要使用大量的儀器、烘箱和電爐等，因此每位實(shí)驗(yàn)人員都必須能熟練地安全用電，避免發(fā)生一切用電事故，當(dāng)50HZ的電流通過人體25mA電流時(shí)呼吸會(huì)發(fā)生困難，通過了100mA以上電流時(shí)則會(huì)致死。 ⑴防止觸電：①不能用濕手接觸電器。②電源裸露部分都應(yīng)絕緣。③壞的接頭、插頭、插座和不良導(dǎo)線應(yīng)及時(shí)更換。④先接好線路再插接電源，反之先關(guān)電源再拆線路。⑤儀器使用前要先檢查外殼是否帶電。⑥如遇有人觸電要先切斷電源再救人。 ⑵防止電器著火：①保險(xiǎn)絲、電源線的截面積、插頭和插座都要與使用的額定電流相匹配。②三條相線要平均用電。③生銹的電器、接觸不良的導(dǎo)線接頭要及時(shí)處理。 ④電爐、烘箱等電熱設(shè)備不可過夜使用。⑤儀器長時(shí)間不用要拔下插頭，并及時(shí)拉閘。⑥電器、電線著火不可用泡沫滅火器滅火。 1.4 實(shí)驗(yàn)記錄與實(shí)驗(yàn)報(bào)告 1.4.1 實(shí)驗(yàn)記錄 詳細(xì)、準(zhǔn)確、如實(shí)地作好實(shí)驗(yàn)記錄是極為重要的，記錄如果有誤，會(huì)使整個(gè)實(shí)驗(yàn)失敗，這也是培養(yǎng)學(xué)生實(shí)驗(yàn)?zāi)芰蛧?yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)作風(fēng)的一個(gè)重要方面。 ⑴ 每位同學(xué)必須準(zhǔn)備一個(gè)實(shí)驗(yàn)記錄本，實(shí)驗(yàn)前認(rèn)真預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)，看懂實(shí)驗(yàn)原理和操作方法，在記錄本上寫好實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)報(bào)告， 包括詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)操作步驟(可以用流程圖表示)和數(shù)據(jù)記錄表格等。 ⑵ 記錄本上要編好頁數(shù)，不得撕缺和涂改，寫錯(cuò)時(shí)可以劃去重寫。不得用鉛筆記錄，只能用鋼筆和園珠筆。記錄本的左頁作計(jì)算和草稿用，右頁用作預(yù)習(xí)報(bào)告和實(shí)驗(yàn)記錄。同組的兩位同學(xué)合做同一實(shí)驗(yàn)時(shí)，兩人必須都有相同、完整的記錄。 ⑶ 實(shí)驗(yàn)中應(yīng)及時(shí)準(zhǔn)確地記錄所觀察到的現(xiàn)象和測(cè)量的數(shù)據(jù)，條理清楚，字跡端正，切不可了草以致日后無法辨認(rèn)。實(shí)驗(yàn)記錄必須公正客觀，不可夾雜主觀因素。 ⑷ 實(shí)驗(yàn)中要記錄的各種數(shù)據(jù)，都應(yīng)事先在記錄本上設(shè)計(jì)好各種記錄格式和表格，以免實(shí)驗(yàn)中由于忙亂而遺漏測(cè)量和記錄，造成不可挽回的損失。 ⑸ 實(shí)驗(yàn)記錄要注意有效數(shù)字，如吸光度值應(yīng)為“0.050”，而不能記成“0.05”。每個(gè)結(jié)果都要盡可能重復(fù)觀測(cè)二次以上，即使觀測(cè)的數(shù)據(jù)相同或偏差很大，也都應(yīng)如實(shí)記錄，不得涂改。 ⑹ 實(shí)驗(yàn)中要詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)條件，如使用的儀器型號(hào)、編號(hào)、生產(chǎn)廠等；生物材料的來源、形態(tài)特征、健康狀況、選用的組織及其重量等；試劑的規(guī)格、化學(xué)式、分子量、試劑的濃度等，都應(yīng)記錄清楚。二人一組的實(shí)驗(yàn)，必須每人都作記錄。 1.4.2 實(shí)驗(yàn)報(bào)告 實(shí)驗(yàn)報(bào)告是實(shí)驗(yàn)的總結(jié)和匯報(bào)，通過實(shí)驗(yàn)報(bào)告的寫作可以分析總結(jié)實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)和問題，學(xué)會(huì)處理各種實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的方法，加深對(duì)有關(guān)生物化學(xué)與分子生物學(xué)原理和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的理解和掌握，同時(shí)也是學(xué)習(xí)撰寫科學(xué)研究論文的過程。實(shí)驗(yàn)報(bào)告的格式應(yīng)為： ⑴ 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?；?實(shí)驗(yàn)原理；⑶ 儀器和試劑；⑷ 實(shí)驗(yàn)步驟；⑸ 數(shù)據(jù)處理；⑹ 結(jié)果討論。 每個(gè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告都要按照上述要求來寫，實(shí)驗(yàn)報(bào)告的寫作水平也是衡量學(xué)生實(shí)驗(yàn)成績的一個(gè)重要方面。實(shí)驗(yàn)報(bào)告必須獨(dú)立完成，嚴(yán)禁抄襲。寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告要用實(shí)驗(yàn)報(bào)告專用紙，以便教師批閱，不要用練習(xí)本和其他片頁紙。 為了使實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠重復(fù)，必須詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的所有細(xì)節(jié)，例如，若實(shí)驗(yàn)中生成沉淀，那麼沉淀的真實(shí)顏色是什麼，是白色、淡黃色或是其他？沉淀的量是多還是少，是膠狀還是顆粒狀？什麼時(shí)候形成沉淀，立即生成還是緩慢生成，熱時(shí)生成還是冷卻時(shí)生成？在科學(xué)研究中，仔細(xì)地觀察，特別注意那些未予想到的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象是十分重要的，這些觀察常常引起意外的發(fā)現(xiàn)，報(bào)告并注意分析實(shí)驗(yàn)中的真實(shí)發(fā)現(xiàn)，對(duì)學(xué)生將是非常重要的科學(xué)研究訓(xùn)練。 實(shí)驗(yàn)報(bào)告使用的語言要簡明清楚，抓住關(guān)鍵，各種實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都要盡可能整理成表格并作圖表示之，以便比較，一目了然。實(shí)驗(yàn)作圖尤其要嚴(yán)格要求，必須使用坐標(biāo)紙，每個(gè)圖都要有明顯的標(biāo)題，坐標(biāo)軸的名稱要清楚完整，要注明合適的單位，坐標(biāo)軸的分度數(shù)字要與有效數(shù)字相符，并盡可能簡明，若數(shù)字太大，可以化簡，并在坐標(biāo)軸的單位上乘以10的方次。實(shí)驗(yàn)點(diǎn)要使用專門設(shè)計(jì)的符號(hào)，如：○、●、□、■、△、▲等，符號(hào)的大小要與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的誤差相符。不要用“、＋”和“”小園點(diǎn)。有時(shí)也可用兩端有小橫線的垂直線段來表示實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其線段的長度與實(shí)驗(yàn)誤差相符。通常橫軸是自變量，往往知道的很準(zhǔn)確，縱軸是應(yīng)變量，是測(cè)量的數(shù)據(jù)。曲線要用曲線板或曲線尺畫成光滑連續(xù)的曲線，各實(shí)驗(yàn)點(diǎn)均勻分布在曲線上和曲線兩邊，且曲線不可超越最后一個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。兩條以上的曲線和符號(hào)應(yīng)有說明。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的討論要充分，盡可能多查閱一些有關(guān)的文獻(xiàn)和教科書，充分運(yùn)用己學(xué)過的知識(shí)和生物化學(xué)原理，進(jìn)行深入的探討，勇于提出自己獨(dú)到的分析和見解，并歡迎對(duì)實(shí)驗(yàn)提出改進(jìn)意見。 1.5 實(shí)驗(yàn)室基本操作 1.5.1 玻璃儀器的清洗 實(shí)驗(yàn)中所用的玻璃儀器清潔與否，直接影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，往往由於儀器的不清潔或被污染而造成較大的實(shí)驗(yàn)誤差，有時(shí)甚至?xí)?dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗。 做生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)玻璃儀器清潔程度的要求，比一般化學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求更高。這是因?yàn)椋孩偕锘瘜W(xué)實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)、酶、核酸等往往都是以“毫克”和“微克”計(jì)的，稍有雜質(zhì)，影響就很大。②生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)許多常見的污染雜質(zhì)十分敏感，如金屬離子（鈣、鎂離子等）、去污劑和有機(jī)物殘基等，因此玻璃儀器（包括離心管等塑料器皿）是否徹底清洗凈就是非常重要的。 ⑴ 初用玻璃儀器的清洗 新購買的玻璃儀器表面常附著有游離的堿性物質(zhì)，可先用0.5％的去污劑洗刷，再用自來水洗凈，然后浸泡在1％～2％鹽酸溶液中過夜（不可少于四小時(shí)），再用自來水沖洗，最后用無離子水沖洗兩次，在100℃～120℃烘箱內(nèi)烘干備用。 ⑵ 使用過的玻璃儀器的清洗 先用自來水洗刷至無污物，再用合適的毛刷沾去污劑（粉）洗刷，或浸泡在0.5％的清洗劑中超聲清洗（比色皿決不可超聲），然后用自來水徹底洗凈去污劑，用無離子水洗兩次，烘干備用（計(jì)量儀器不可烘干）。清洗后器皿內(nèi)外不可掛有水珠，否則重洗，若重洗后仍掛有水珠，則需用洗液浸泡數(shù)小時(shí)后（或用去污粉擦洗），重新清洗。 ⑶ 石英和玻璃比色皿的清洗 決不可用強(qiáng)堿清洗，因?yàn)閺?qiáng)堿會(huì)浸蝕拋光的比色皿。只能用洗液或1％ ～2％的去污劑浸泡，然后用自來水沖洗，這時(shí)使用一支綢布包裹的小棒或棉花球棒刷洗，效果會(huì)更好，清洗干凈的比色皿也應(yīng)內(nèi)外壁不掛水珠。 1.5.2 塑料器皿的清洗 聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中已用的越來越多。第一次使用塑料器皿時(shí)，可先用8mol/L尿素（用濃鹽酸調(diào)pH = 1）清洗，接著依次用無離子水、1 mol/L KOH和無離子水清洗，然后用10—3 mol/L EDTA 除去金屬離子的污染，最后用無離子水徹底清洗，以后每次使用時(shí)，可只用0.5％的去污劑清洗，然后用自來水和無離子水洗凈即可。 1.5.3 洗液的配制 因己確定鉻有致癌作用，因此配制和使用洗液時(shí)要極為小心，常用兩種配制方法如下： ⑴ 取100mL 工業(yè)濃硫酸置于燒杯內(nèi)，小心加熱，然后慢慢加入5g重鉻酸鉀粉末，邊加邊攪拌，待全部溶解并緩慢冷卻后，貯存在磨口玻璃塞的細(xì)口瓶內(nèi)。 ⑵ 稱取5g重鉻酸鉀粉末，置于250mL 燒杯中，加5mL 水使其溶解，然后慢慢加入100mL 濃硫酸，溶液溫度將達(dá)80℃，待其冷卻后貯存于磨口玻璃瓶內(nèi)。 1.5.4 其他洗滌液 ⑴ 工業(yè)濃鹽酸：可洗去水垢或某些無機(jī)鹽沉淀。 ⑵ 5％草酸溶液：用數(shù)滴硫酸酸化，可洗去高錳酸鉀的痕跡。 ⑶ 5％～10％磷酸三鈉（Na3PO412H2O）溶液：可洗滌油污物。 ⑷ 30％硝酸溶液：洗滌二氧化碳測(cè)定儀及微量滴管。 ⑸ 5％～10％乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）溶液：加熱煮沸可洗脫玻璃儀器內(nèi)壁的白色沉淀物。 ⑹ 尿素洗滌液：為蛋白質(zhì)的良好溶劑，適用于洗滌盛過蛋白質(zhì)制劑及血樣的容器。 ⑺ 有機(jī)溶劑：如丙酮、乙醚、乙醇等可用于洗脫油脂、脂溶性染料污痕等，二甲苯可洗脫油漆的污垢。 ⑻ 氫氧化鉀的乙醇溶液和含有高錳酸鉀的氫氧化鈉溶液：這是兩種強(qiáng)堿性的洗滌液，對(duì)玻璃儀器的侵蝕性很強(qiáng)，可清除容器內(nèi)壁污垢，洗滌時(shí)間不宜過長，使用時(shí)應(yīng)小心慎重。 1.5.5 玻璃和塑料器皿的干燥： 生化實(shí)驗(yàn)中用到的玻璃和塑料器皿經(jīng)常需要干燥，通常都是用烘箱或烘干機(jī)在110℃～120℃進(jìn)行干燥，而不要用丙酮蕩洗再吹干的方法來干燥，因?yàn)槟菢訒?huì)有殘留的有機(jī)物覆蓋在器皿的內(nèi)表面，從而干擾生物化學(xué)反應(yīng)。硝酸纖維素的塑料離心管加熱時(shí)會(huì)發(fā)生爆炸，所以決不能放在烘箱中干燥，只能用冷風(fēng)吹干。 1.5.6 移液 準(zhǔn)確的分析方法對(duì)于生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)是極為重要的，在各種生物化學(xué)分析技術(shù)中，首先要熟練掌握的就是準(zhǔn)確的移液技術(shù)。為此要用到各種形式的移液管，其中有一些是學(xué)生們?cè)诨瘜W(xué)實(shí)驗(yàn)中未用過而在生化實(shí)驗(yàn)中是常用的。下圖列出了一些生化實(shí)驗(yàn)中常用的移液器具。 ⑴ 滴管（圖1－1 中(E)） 使用方便，可用于半定量移液，其移液量為1mL—5mL，常用2mL，可換不同大小的滴頭（圖1－1 中(A)）。滴管有長、短兩種，新出一種帶刻度和緩沖泡的滴管，可以比普通滴管更準(zhǔn)確地移液，并防止液體吸入滴頭。 ⑵ 移液管（吸管） 吸管使用前應(yīng)洗至內(nèi)壁不掛水珠，1mL 以上的吸管，用吸管專用刷刷洗，0.1mL、0.2mL和0.5mL 的吸管可用洗滌劑浸泡，必要時(shí)可以用超聲清洗器清洗。由于鉻酸洗液致癌，應(yīng)盡量避免使用。若有大量成批的吸管洗后沖洗，可使用沖洗桶，將吸管尖端向上置于桶內(nèi)，用自來水多次沖洗后再用蒸餾水或無離子水沖洗。 吸管分為兩種，一種是無分度的，稱為胖肚吸管（圖1－1 中(F)），精確度較高，其相對(duì)誤差A(yù)級(jí)為0.7％ ~ 0.8％，B級(jí)為1.5％ ~ 0.16％，液體自標(biāo)線流至口端（留有殘液），A級(jí)等待15s，B級(jí)等待3s。 另一種吸管為分度吸管（圖1－1 中(G)），管身為一粗細(xì)均勻的玻璃管，上面均勻刻有表示容積的分度線，其準(zhǔn)確度低于胖肚吸管，相對(duì)誤差A(yù)級(jí)為0.8％ ~ 0.2％，B級(jí)為1.6％—0.4％，A級(jí)、B級(jí)在吸管管身上有A、B字樣，有“快”字則為快流式，有“吹”字則為吹出式，無“吹”字的吸管不可將管尖的殘留液吹出。吸、放溶液前要用吸水紙擦拭管尖。 圖1－1 生化實(shí)驗(yàn)中常用的移液器具 圖1－1 (H)為血清吸管，其刻度一直刻到管端出口處，由于沒有管尖，不會(huì)殘留液體，但需在液體流完后仃留15～20秒，常用于吸取血清等粘度大的液體。 圖1－1 (I)是微量λ吸管，用于1～500ml （1λ= 1ml）的移液，用吸水紙蘸出多吸的液體。 圖1－1 (J)是毛細(xì)微量吸管，用于1～20ml的移液，常用于薄層層析和紙層析。 吸管吸取溶液最常用的是洗耳球（圖1 中(B)）。此外，為便于移液，還可以使用新式的吸液球（圖1－1 中(C)），球上有A、B、C三個(gè)玻璃珠閥門，吸液之前，先用拇指和食指按捏A閥，用其他手指擠壓球體，由A閥排氣，使球內(nèi)形成負(fù)壓，插入吸管吸液時(shí)，用拇指和食指按捏B閥，將溶液吸至所需刻度，放液時(shí)按捏C閥，直至溶液流盡，若需吹出管尖殘液時(shí)，可在按捏C閥的同時(shí)，用中指擠壓C閥前面的小球泡，即可吹出管尖殘液。 還有一種“吸管泵”（圖1－1 中(D)）使用更為方便，插入吸管后，用拇指轉(zhuǎn)動(dòng)上部的小輪，即可使園柱形泵內(nèi)的柱塞上下移動(dòng)，將溶液吸入或排出吸管，尤其是在移取10mL 以上的溶液時(shí)，用“吸管泵”最為方便。 ⑶ 微量進(jìn)樣器 微量進(jìn)樣器常用作氣相和液相色譜儀的進(jìn)樣器，在生化實(shí)驗(yàn)中主要是用作電泳實(shí)驗(yàn)的加樣器，通?？煞譃闊o存液和有存液兩種。 1) 0.5mL ～5mL無存液微量進(jìn)樣器： 進(jìn)樣器的不銹鋼芯子直接通到針尖端處，不會(huì)出現(xiàn)存液，所以可用于5mL以下的極微量液體進(jìn)樣。 2) 10mL～100mL有存液微量進(jìn)樣器： 不銹鋼的針尖管部分是空管，進(jìn)樣器的柱塞不能到達(dá)，因而管內(nèi)會(huì)存有空氣或液體，其使用注意事項(xiàng)是：① 不可吸取濃堿溶液，以免腐蝕玻璃和不銹鋼零件。 ② 因?yàn)橛写嬉?，所以吸液時(shí)要來回多拉幾次，將針尖管內(nèi)的氣泡全部排盡。 ③ 針尖管內(nèi)孔極小，使用后，尤其是吸取過蛋白質(zhì)溶液后，必須立即清洗針尖管，防止堵塞。若遇針尖管堵塞，不可用火燒，只能用φ0.1mm的不銹鋼絲耐心串通。 ④ 進(jìn)樣器未潤濕時(shí)不可來回干拉芯子，以免磨損而漏氣。 ⑤ 若進(jìn)樣器內(nèi)發(fā)黑，有不銹鋼氧化物，可用芯子蘸少量肥皂水，來回拉幾次即可除之。 ⑷ 自動(dòng)取液器 這種取液器在生化實(shí)驗(yàn)中大量地使用，它們主要用于多次重復(fù)的快速定量移液，可以只用一只手操作，十分方便。移液的準(zhǔn)確度（即容量誤差）為 (0.5％～1.5％)，移液的精密度（即重復(fù)性誤差）更小些，為 ≤0.5％。 取液器可分為二種：一種是固定容量的，常用的有100ml 、200mL和1000mL等幾種；另一種是可調(diào)容量的取液器，常用的有200mL、1000mL和5000mL等多種規(guī)格。每種取液器都有其專用的聚丙烯塑料吸頭，吸頭通常是一次性使用，當(dāng)然也可以超聲清洗后重復(fù)使用，而且此種吸頭還可以進(jìn)行120℃高壓滅菌。 可調(diào)式自動(dòng)取液器的操作方法是用拇指和食指旋轉(zhuǎn)取液器上部的旋鈕，使數(shù)字窗口出現(xiàn)所需容量體積的數(shù)字，在取液器下端插上一個(gè)塑料吸頭，并旋緊以保證氣密，然后四指并攏握住取液器上部，用拇指按住柱塞桿頂端的按鈕，向下按到第一停點(diǎn)，將取液器的吸頭插入待取的溶液中，緩慢松開按鈕，吸上液體，并停留1～2秒鐘（粘性大的溶液可加長停留時(shí)間），將吸頭沿器壁滑出容器，用吸水紙擦去吸頭表面可能附著的液體，排液時(shí)吸頭接觸傾斜的器壁，先將按鈕按到第一停點(diǎn)，停留一秒鐘（粘性大的液體要加長停留時(shí)間），再按壓到第二停點(diǎn)，吹出吸頭尖部的剩余溶液，如果不便于用手取下吸頭，可按下除吸頭推桿，將吸頭推入廢物缸。 自動(dòng)取液器的使用注意事項(xiàng)是： ① 吸取液體時(shí)一定要緩慢平穩(wěn)地松開拇指，絕不允許突然松開，以防將溶液吸入過快而沖入取液器內(nèi)腐蝕柱塞而造成漏氣。 ② 為獲得較高的精度，吸頭需予先吸取一次樣品溶液，然后再正式移液，因?yàn)槲⊙宓鞍踪|(zhì)溶液或有機(jī)溶劑時(shí)，吸頭內(nèi)壁會(huì)殘留一層“液膜”，造成排液量偏小而產(chǎn)生誤差。③ 濃度和粘度大的液體，會(huì)產(chǎn)生誤差，為消除其誤差的補(bǔ)償量，可由試驗(yàn)確定，補(bǔ)償量可用調(diào)節(jié)旋鈕改變讀數(shù)窗的讀數(shù)來進(jìn)行設(shè)定。④ 可用分析天平稱量所取純水的重量并進(jìn)行計(jì)算的方法，來校正取液器，1mL 蒸餾水20℃時(shí)重0.9982g。 圖1－2 自動(dòng)取液器示意圖 1.6 緩沖溶液與pH測(cè)定 緩沖溶液是一類能夠抵制外界加入少量酸和堿的影響，仍能維持pH值基本不變的溶液。該溶液的這種抗pH變化的作用稱為緩沖作用。緩沖溶液通常是由一或兩種化合物溶于溶劑（即純水）所得的溶液，溶液內(nèi)所溶解的溶質(zhì)（化合物）稱之為緩沖劑，調(diào)節(jié)緩沖劑的配比即可制得不同pH的緩沖液。 緩沖溶液的正確配制和pH值的準(zhǔn)確測(cè)定，在生物化學(xué)的研究工作中有著極為重要的意義，因?yàn)樵谏矬w內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)過程都是在精確的pH值下進(jìn)行的，而且受到氫離子濃度的嚴(yán)格調(diào)控，能夠做到這一點(diǎn)是因?yàn)樯矬w內(nèi)有完善的天然緩沖系統(tǒng)。生物體內(nèi)細(xì)胞的生長和活動(dòng)需要一定的pH值，體內(nèi)pH環(huán)境的任何改變都將引起與代謝有關(guān)的酸堿電離平衡移動(dòng)，從而影響生物體內(nèi)細(xì)胞的活性。為了在實(shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確地模擬生物體內(nèi)的天然環(huán)境，就必須保持體外生物化學(xué)反應(yīng)過程有體內(nèi)過程完全相同的pH值，此外，各種生化樣品的分離純化和分析鑒定，也必須選用合適的pH值，因此，在生物化學(xué)的各種研究工作中和生物技術(shù)的各種開發(fā)工作中，深刻地了解各種緩沖試劑的性質(zhì)，準(zhǔn)確恰當(dāng)?shù)剡x擇和配制各種緩沖溶液，精確地測(cè)定溶液的pH值，就是非常重要的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)工作。下表列出某些人體體液的pH值： 表1—3 人體體液pH 體 液 pH 體 液 pH 血 清 7.35～7.45 大腸液 8.3～8.4 成人胃液 0.9～1.5 淚 6.6～6.9 唾 液 6.3～7.1 尿 4.8～7.5 胰 液 7.5～8.0 腦脊液 7.35～7.45 1.6.1 基本概念 ⑴ Brnsted-Lowry酸堿理論（又稱酸堿質(zhì)子理論）。1923年由丹麥化學(xué)家J.N.Brnsted和英國化學(xué)家T.M.Lowry同時(shí)提出了酸堿質(zhì)子學(xué)說，發(fā)展了酸堿理論，被后人稱為酸堿質(zhì)子理論或Brnsted-Lowry酸堿理論。他們認(rèn)為凡能釋放質(zhì)子的分子或離子（如：H2O，HCl，NH4+，HSO4— 等）稱為酸，凡能接受質(zhì)子的分子或離子（如：H2O，NH3，Cl—等）稱為堿。因此，一種酸釋放質(zhì)子后即成為堿，稱為該酸的共軛堿，同樣一種堿與質(zhì)子結(jié)合后，形成對(duì)應(yīng)的酸，稱為該堿的共軛酸。 A—H ＋ B— A ＋ B—H 酸1 堿2 堿1 酸2 酸1 是 堿1的共軛酸， 堿2 是 酸2 的共軛堿。 如鹽酸在水中的解離： HCl Cl— ＋ H+ HCl是酸，Cl—是它的共軛堿。 ⑵ 緩沖體系的設(shè)計(jì)： 強(qiáng)電解質(zhì)溶于水幾乎全部解離為正負(fù)離子，弱電解質(zhì)溶于水時(shí)，則不完全解離，只有部分的分子解離出正負(fù)離子，其馀以分子形式存在于溶液中。例如弱酸（HA）及其鹽溶于水時(shí)，只有部分HA解離為 H+ 和 A—離子，其平衡方程式如下： K1 HA A— ＋ H+ (1-1) K2 ∴ (1-2) (1-2)式兩邊取負(fù)對(duì)數(shù)： (1-3) (1-3)式中： [HA] — 為弱酸的濃度 [H+] — 為HA解離出的氫離子濃度 [A—] — 為HA的共軛堿的離子濃度 K1 — 為酸解離的速度常數(shù) K2 — 為A—與H+ 締合的速度常數(shù) Ka — 為反應(yīng)方程(1-1)達(dá)平衡時(shí)HA的解離平衡常數(shù) 現(xiàn)將HA的pKa 定義為 －lg Ka，將HA溶液的pH定義為 －log[H+]， ∴ (1-3)式可寫為 ： (1-4) 或： (1-5) 方程(1-4)稱為：Henderson-Hassel-Balch方程，此方程對(duì)于生物化學(xué)學(xué)科，在理論與實(shí)踐上都具有重要意義。該方程表示了溶液pH與溶質(zhì)中可解離基團(tuán)pKa之間的關(guān)系。很明顯，當(dāng)[A—]＝[HA]時(shí)： ∴ pH ＝ pKa 這就意味著當(dāng)[HA]有一半解離時(shí)，溶液的pH等于 pKa，此弱酸－堿緩沖體系的pKa即代表緩沖范圍的中點(diǎn)。一個(gè)緩沖體系的有效緩沖范圍，通常是在pKa值為中點(diǎn)的兩個(gè)pH單位范圍內(nèi)，即：緩沖劑的有效pH范圍＝pKa1，所以，當(dāng)緩沖溶液的pH等于該緩沖劑的pKa時(shí)，緩沖能力最大。若要設(shè)計(jì)一個(gè)新的緩沖體系時(shí)，只需按所要求的pH值查出pKa值等于此pH值的各種緩沖劑并從中進(jìn)行挑選即可。 1960年，N.E.Good和他的同事們提出，適合生命科學(xué)研究使用的緩沖體系應(yīng)具有以下特性： ① pKa值在6～8之間； ② 在水中的溶解度高；③ 不易穿透生物膜；④ 鹽效應(yīng)?。虎?離子濃度、溶液組成和溫度對(duì)解離的影響小；⑥ 不與金屬離子生成復(fù)合物或沉淀； ⑦ 該緩沖劑化學(xué)穩(wěn)定；⑧ 紫外和可見光波長范圍內(nèi)光吸收??；⑨ 易制得高純度的鹽。 按照這些要求可以設(shè)計(jì)和選擇最為合適的緩沖劑來配制所需的緩沖溶液。 1.6.2 生物化學(xué)常用緩沖液 ⑴ 磷酸鹽緩沖液 磷酸鹽是生物化學(xué)研究中使用最廣泛的一種緩沖劑，由於它們是二級(jí)解離，有二個(gè)pKa值，所以用它們配制的緩沖液，pH范圍最寬： NaH2PO4： pKa1＝2.12， pKa2＝7.21 Na2HPO4： pKa1＝7.21， pKa2＝12.32 配酸性緩沖液： 用 NaH2PO4，pH＝1～4， 配中性緩沖液： 用混合的兩種磷酸鹽，pH＝6～8， 配堿性緩沖液： 用 Na2HPO4，pH＝10～12。 用鉀鹽比鈉鹽好，因?yàn)榈蜏貢r(shí)鈉鹽難溶，鉀鹽易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的緩沖液時(shí)，只能用磷酸鈉而不能用磷酸鉀，因?yàn)镾DS（十二烷基硫酸鈉）會(huì)與鉀鹽生成難溶的十二烷基硫酸鉀。 磷酸鹽緩沖液的優(yōu)點(diǎn)為：①容易配制成各種濃度的緩沖液；②適用的pH范圍寬；③pH受溫度的影響?。虎芫彌_液稀釋后pH變化小，如稀釋十倍后pH的變化小于0.1。 其缺點(diǎn)為：①易與常見的鈣Ca++離子、鎂Mg++離子以及重金屬離子締合生成沉淀；②會(huì)抑制某些生物化學(xué)過程，如對(duì)某些酶的催化作用會(huì)產(chǎn)生某種程度的抑制作用。 ⑵Tris（三羥甲基氨基甲烷，N-Tris(hydroxymethyl)aminomethane）緩沖液 　 Tris緩沖液在生物化學(xué)研究中使用的越來越多，有超過磷酸鹽緩沖液的趨勢(shì)，如在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中已都使用Tris緩沖液，而很少再用磷酸鹽。 Tris緩沖液的常用有效pH范圍是在“中性”范圍，例如： Tris-HCl緩沖液： pH＝7.5～8.5 Tris-磷酸鹽緩沖液： pH＝5.0～9.0 配制常用的緩沖液的方法有兩種：①按書后附錄中所列該緩沖液表中的方法，分別配制0.05mol/L Tris和0.05mol/L HCl溶液，然后按表中所列體積混合。由于標(biāo)準(zhǔn)濃度的稀鹽酸不易配制，所以常用另一種方法；②若配1L 0.1mol/L的Tris-HCl緩沖液：先稱12.11g Tris堿溶于950mL～970mL 無離子水中，邊攪拌邊滴加4N HCl，用pH計(jì)測(cè)定溶液pH值至所需的pH值，然后再加水補(bǔ)足到1L。 Tris-HCl緩沖液的優(yōu)點(diǎn)是： ①因?yàn)門ris堿的堿性較強(qiáng)，所以可以只用這一種緩沖體系配制pH范圍由酸性到堿性的大范圍pH值的緩沖液；②對(duì)生物化學(xué)過程干擾很小，不與鈣、鎂離子及重金屬離子發(fā)生沉淀。 其缺點(diǎn)是：①緩沖液的pH值受溶液濃度影響較大，緩沖液稀釋十倍，pH值的變化大于0.1；②溫度效應(yīng)大，溫度變化對(duì)緩沖液pH值的影響很大，即： △pKa／℃＝－0.031 ，例如：4℃時(shí)緩沖液的pH＝8.4，則37℃時(shí)的pH＝7.4，所以一定要在使用溫度下進(jìn)行配制，室溫下配制的Tris-HCl緩沖液不能用于0℃～4℃。 ③易吸收空氣中的CO2，所以配制的緩沖液要蓋嚴(yán)密封。 ④此緩沖液對(duì)某些pH電極發(fā)生一定的干擾作用，所以要使用與Tris溶液具有兼容性的電極。 ⑶ 有機(jī)酸緩沖液 這一類緩沖液多數(shù)是用羧酸與它們的鹽配制而成，pH范圍為酸性，即pH＝3.0～6.0，最常用的是甲酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸等。 甲酸～甲酸鹽緩沖液很有用，因其揮發(fā)性強(qiáng)，使用后可以用減壓法除之。乙酸～乙酸鈉和檸檬酸～檸檬酸鈉緩沖體系也使用的較多，檸檬酸有三個(gè)pKa值：pKa1＝3.10， pKa2＝4.75， pKa3＝6.40。琥珀酸有二個(gè)pKa值：pKa1＝4.18， pKa2＝5.60。 有機(jī)酸緩沖液的缺點(diǎn)是：①所有這些羧酸都是天然的代謝產(chǎn)物，因而對(duì)生化反應(yīng)過程可能發(fā)生干擾作用；②檸檬酸鹽和琥珀酸鹽可以和過渡金屬離子（Fe3+、Zn++、Mg++等）結(jié)合而使緩沖液受到干擾；③這類緩沖液易與Ca++離子結(jié)合，所以樣品中有Ca++離子時(shí)，不能用這類緩沖液。 ⑷ 硼酸鹽緩沖液 常用的有效pH范圍是：pH＝8.5～10.0，因而它是堿性范圍內(nèi)最常用的緩沖液，其優(yōu)點(diǎn)是配制方便，只使用一種試劑，缺點(diǎn)是能與很多代謝產(chǎn)物形成絡(luò)合物，尤其是能與糖類的羥基反應(yīng)生成穩(wěn)定的復(fù)合物而使緩沖液受到干擾。 ⑸ 氨基酸緩沖液 此緩沖液使用的范圍寬，可用于pH=2.0～11.0，例如最常用的有： 甘氨酸—HCl緩沖液：pH=2.0～5.0， 甘氨酸—NaOH緩沖液：pH=8.0～11.0，　 　 　 　 甘氨酸—Tris緩沖液：pH=8.0～11.0，（此緩沖液用于廣泛使用的SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳的電極緩沖液）， 組氨酸緩沖液：pH=5.5～6.5， 甘氨酰胺（glycine amide）緩沖液：pH=7.8～8.8， 甘氨酰甘氨酸（glycylglycine）緩沖液：pH=8.0～9.0。 此類緩沖體系的優(yōu)點(diǎn)是：為細(xì)胞組份和各種提取液提供更接近的天然環(huán)境。其缺點(diǎn)是：①與羧酸鹽和磷酸鹽緩沖體系相似，也會(huì)干擾某些生物化學(xué)反應(yīng)過程，如代謝過程等。②試劑的價(jià)格較高。 ⑹ 兩性離子緩沖液（Zwitterionic buffers），又稱Good’s緩沖液 1960年，N.E.Good和他的同事們總結(jié)了現(xiàn)有的各種緩沖試劑的優(yōu)缺點(diǎn)后認(rèn)為，必須用人為設(shè)計(jì)和人工合成的方法來找到專門用于生命科學(xué)研究的特定的緩沖體系，這些緩沖體系應(yīng)具有前面所述的九條要求和特性。他們合成的一系列Good’s緩沖液可查閱有關(guān)的資料。 Good’s緩沖液的主要優(yōu)點(diǎn)是不參加和不干擾生物化學(xué)反應(yīng)過程，對(duì)酶化學(xué)反應(yīng)等無抑制作用，所以它們專門用于細(xì)胞器和極易變性的、對(duì)pH敏感的蛋白質(zhì)和酶的研究工作。其缺點(diǎn)是：①價(jià)格昂貴，②對(duì)測(cè)定蛋白質(zhì)含量的雙