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ELISA方法在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用.doc

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ELISA方法在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用.doc

ELISA方法在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用來源:www.nearlw.com1. ELISA的基本原理ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ),將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合的一種具有高特異性和高敏感性的實驗技術(shù),幾乎所有的可溶性抗原一抗體系統(tǒng)均可用以檢測,它的最小可測值達(dá)ng甚至pg水平。該方法的基本原理如下:(1)將抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體(目前以聚苯乙烯微量滴定板最為常用)表面,并保持其免疫活性。此步驟稱為“固相載體的包被”,在商品化試劑盒中均已完成。(2)再將抗原或抗體與某種酶(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等)連接成酶標(biāo)抗原或酶標(biāo)抗體,這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性,又保留酶的活性。檢測時,按相應(yīng)順序加入待檢標(biāo)本(測定其中的抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或酶標(biāo)抗體,使其與固相載體上的抗原或抗體發(fā)生反應(yīng)。以洗滌的方法洗去各步驟中過量的未結(jié)合物質(zhì),結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。(3)最后加入酶反應(yīng)的底物,底物即被酶催化生成有色產(chǎn)物,而有色產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定量分析。此種顯色反應(yīng)可通過酶標(biāo)儀進(jìn)行定量測定,這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來,使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。2. ELISA技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用ELISA步驟復(fù)雜,試劑制備困難,只有應(yīng)用符合要求的試劑和標(biāo)準(zhǔn)化的操作,才能獲得滿意的結(jié)果。目前應(yīng)用較廣的檢測項目一般均有試劑盒出售,完整的ELISA試劑盒應(yīng)包含已包被好的固相載體、酶結(jié)合物、底物和各種濃縮的稀釋液、緩沖液等。在醫(yī)學(xué)研究中,ELISA試劑檢測的項目主要可分為以下幾類:(1)各種病原體及其抗體的檢測:如肝炎病毒、巨細(xì)胞病毒、風(fēng)疹病毒、皰疹病毒、艾滋病病毒等;(2)蛋白質(zhì):腫瘤標(biāo)志物如甲胎蛋白、癌胚抗原等;激素如HCG、FSH、TSH等;細(xì)胞因子如TNF0l、VEGF、NFKB等;載脂蛋白如Apo AI、ApoE等;(3)非肽類激素:如T3、rr4、雌二醇、皮質(zhì)醇等;(4)檢測血液中的藥物濃度:如治療心臟病的藥物地高辛、抗癲癇藥物茶堿、抗生素慶大霉素等 。用于基礎(chǔ)研究的標(biāo)本來源多種多樣,如臨床血液標(biāo)本,實驗動物的血液標(biāo)本,實驗動物的組織標(biāo)本,培養(yǎng)的細(xì)胞以及細(xì)胞培養(yǎng)上清等,均可作為待測樣本用于檢測其中某種物質(zhì)的含量。具體應(yīng)選取何種樣本進(jìn)行特定指標(biāo)的檢測,取決于實驗研究的目的以及待測物質(zhì)的表達(dá)特性。3. ELISA在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用特點ELISA方法在基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用與其在臨床檢驗工作中具有很大不同,區(qū)別之處主要如下:(1)基礎(chǔ)研究中ELISA檢測所用標(biāo)本來源廣泛,涉及人、大鼠、小鼠、兔、豬、犬等多種常用實驗動物種屬的血液、組織、細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清液等,而臨床檢驗所用標(biāo)本則以人的血液(血清或血漿)和尿液等為主;(2)基礎(chǔ)研究具有探索性,其結(jié)果也具有不確定性,沒有正常值范圍而言,需要根據(jù)ELISA檢測指標(biāo)的具體數(shù)值判斷不同實驗組間樣品測定值的意義;而臨床檢驗的ELISA檢測結(jié)果具有陽性或陰性的界定,或者存在正常值范圍作為判讀測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)。(3)對于臨床檢驗標(biāo)本如血清和血漿而言,各種指標(biāo)的ELISA檢測試劑盒均會給出對待測樣品的最佳稀釋倍數(shù);而在基礎(chǔ)研究中,尤其當(dāng)所測指標(biāo)是在組織中表達(dá)時,即待測樣品來源于組織時,ELISA檢測試劑盒通常不會推薦對待測樣品的稀釋倍數(shù);此時,研究者必須先通過預(yù)實驗摸索出一個最佳稀釋倍數(shù)之后再進(jìn)行檢測,因此,對組織樣本的檢測步驟較為復(fù)雜和繁瑣。4. ELISA的分類及主要操作流程ELISA方法既可用于測定抗原,也可用于測定抗體。根據(jù)樣本中待測物質(zhì)的種類及性質(zhì)不同,可以設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。臨床檢驗工作中用到的ELISA方法主要分為以下幾種類型:(1)用于檢測抗原的:雙抗體夾心法和競爭法;(2)用于檢測抗體的:雙抗原夾心法、間接法、競爭法及捕獲包被法等。然而,在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中,涉及到的檢測指標(biāo)大多數(shù)為抗原性物質(zhì),因此,下文僅就雙抗體夾心法和競爭法這兩種測定抗原性物質(zhì)的方法進(jìn)行詳細(xì)說明。41 雙抗體夾心法檢測抗原研究表明,充血性心力衰竭患者循環(huán)及組織中自介素一6(interleukin-6,IL-6)升高,持續(xù)過度的IL-6產(chǎn)生會破壞細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)并可能導(dǎo)致心肌損傷及功能障礙的進(jìn)展,因此,循環(huán)IL-6水平與左室功能障礙的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。在此,以檢測大鼠血漿IL-6為例說明雙抗體夾心法的ELISA操作步驟和要點。411 操作流程(1)取出試劑盒,置室溫平衡30min;(2)按照說明書要求配制各種工作液:洗液、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液及樣品稀釋液等;(3)根據(jù)說明書推薦的樣品稀釋度對待測樣品進(jìn)行稀釋,同時按照說明書要求配制各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(從空白對照至低濃度一直到高濃度共設(shè)8個濃度梯度);(4)加標(biāo)準(zhǔn)品和樣品:分別在標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品各50 L孔,貼上封板膜,室溫孵育2h;(5)洗板:棄去孔內(nèi)液體,在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干,每孔加洗液3001L,每次浸泡1 min,共如此重復(fù)洗4次;(6)加酶標(biāo)記的抗體:每孔加酶標(biāo)記抗體100IzL,室溫孵育2h;在此孵育等待期間打開酶標(biāo)儀,預(yù)先建立相應(yīng)的檢測程序;(7)洗板:重復(fù)(5)中的步驟;(8)加酶的底物:每孔加lOOp,L酶底物溶液,室溫避光孵育30 min(30 min內(nèi),肉眼觀察可見標(biāo)準(zhǔn)品孔從低濃度至高濃度的淡藍(lán)色逐漸加深,至高濃度的34孔呈現(xiàn)明顯的梯度藍(lán)色,而低濃度的34孔梯度不明顯時,即可終止);(9)終止反應(yīng):每孔加100mL終止液,此時藍(lán)色立即轉(zhuǎn)為黃色;(10)讀數(shù):加終止液后1015rain以內(nèi)在酶標(biāo)儀的450nm波長測量各孔的光密度值(使用步驟(6)中預(yù)先建立的檢測程序)。412 雙抗體夾心法檢測大鼠血漿IL-6的標(biāo)準(zhǔn)曲線在多功能酶標(biāo)儀(所用儀器:TECAN,GENios plus)中的檢測程序設(shè)定步驟中,可以詳細(xì)設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線上各點的濃度數(shù)值和樣品的稀釋倍數(shù),因此,在最終輸出檢測數(shù)據(jù)時,程序軟件能夠根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線上各點的OD值及其對應(yīng)的濃度,將樣品的OD值自動轉(zhuǎn)換計算出相應(yīng)的濃度,檢測便捷、直觀且結(jié)果準(zhǔn)確。42 競爭法檢測抗原性物質(zhì)競爭法檢測抗原的步驟與雙抗體法大致相似,不同之處如下:雙抗體夾心法檢測抗原時,先加入待檢樣品使之與固相載體上包被的抗體進(jìn)行反應(yīng),完成特異性結(jié)合反應(yīng)后洗去未結(jié)合的抗原,然后加入酶標(biāo)記的第二抗體,使之與固相載體上的抗原繼續(xù)反應(yīng)形成夾心式復(fù)合物,對該夾心復(fù)合物上的標(biāo)記物進(jìn)行測定,即可得到待測樣品中抗原的含量;而在競爭法檢測抗原的過程中,是將待檢樣品和一定量的標(biāo)記抗原同時加入,使二者與固相載體表面有限的抗體進(jìn)行競爭反應(yīng),反應(yīng)一段時間后洗去游離的抗原,由于競爭反應(yīng)的結(jié)果,使結(jié)合在固相載體上的標(biāo)記物的量與樣品中抗原的量成反比,由此可測定樣品中抗原的含量。Apo AI占高密度脂蛋白(HDL)的67 ,能促進(jìn)高密度脂蛋白的成熟 。43 雙抗體夾心法與競爭法檢測抗原的主要區(qū)別(1)雙抗體夾心法適用于檢測蛋白質(zhì)等大分子抗原,一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗,分別用于包被固相載體和制備酶標(biāo)記抗體。而小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點,不能形成兩位點夾心,故通常選擇競爭法模式檢測。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的特點不同。在雙抗體夾心法中,結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗原(或抗體)的量成正比,因此,樣品的吸光度值(OD值)與濃度呈正比,標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。然而,在競爭法中,標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原與固相抗體競爭結(jié)合,也就是說,標(biāo)本中抗原含量愈多,結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少,最后的顯色也愈淺。因此,樣品的吸光度值(OD值)與濃度呈反比。5. ELISA試驗的注意事項51 如何訂購試劑盒目前用于基礎(chǔ)研究的EL1SA試劑盒有別于臨床檢驗所用試劑盒,不可用于醫(yī)學(xué)診斷,而僅能用于研究。當(dāng)確定了待測指標(biāo)后,需要根據(jù)樣本的種屬來源購買相應(yīng)種類的試劑盒。然后,根據(jù)待測樣品數(shù)量計算所需試劑盒的數(shù)量。以最為常用的96孔酶標(biāo)板為例,每塊板均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線,一般情況標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)6至8個不同的濃度值,若按照8個點計算,每個樣品均需做復(fù)孔,則每塊板可以檢測的樣品數(shù)量最多為40個。用待測樣品數(shù)量除以40即是所需購買試劑盒的數(shù)量。在訂購ELISA試劑盒之前還要注意一點:某些試劑盒說明書中要求樣品的前期處理必須使用同一公司生產(chǎn)的特定配套試劑,因此,如果測定組織中某個指標(biāo)的含量時,需要用到相應(yīng)的組織蛋白提取試劑及蛋白濃度檢測試劑,這種情況下,應(yīng)盡量按照說明書要求提前將所有相關(guān)試劑購買完全,以免延誤實驗。52試劑盒在使用前需要先從冰箱中取出,在室溫平衡30min左右再用于檢測。53 標(biāo)本的采集與保存采集血清樣品時,需將全血標(biāo)本于室溫放置2h或4過夜后,離心分離出上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜赺20C或以下保存以備用。為避免反復(fù)凍融導(dǎo)致血清中待測物質(zhì)降解,需適量分裝血清后再凍存。若需用血漿樣品進(jìn)行ELISA檢測,則可將抗凝劑(如EDTA、肝素或枸櫞酸鈉等)加入血液標(biāo)本,在30min內(nèi)離心分離上清檢測或分裝凍存?zhèn)溆?。對于?xì)胞培養(yǎng)上清,需要在1000rpm離心5min,取上清用于檢測,目的是為了去除混懸在其中的漂浮細(xì)胞。進(jìn)行ELISA測定之前,需要按照相應(yīng)說明書要求,對樣品進(jìn)行稀釋之后用于檢測。54 樣品的稀釋倍數(shù)當(dāng)待測樣品為血清或血漿時,ELISA檢測試劑說明書通常會給出建議的稀釋倍數(shù),便于操作。較為復(fù)雜和繁瑣的情況是檢測組織樣本中某種物質(zhì)的定量表達(dá)。任何ELISA試劑說明書都不會說明一個關(guān)鍵的問題,那就是:從組織樣本中提取蛋白之后,以多大倍數(shù)對樣品進(jìn)行稀釋后最適宜檢測?因為待測物質(zhì)在不同組織中的表達(dá)豐度可能不一樣;同時,對于不同的研究者而言,即便用同種組織進(jìn)行檢測,如果對組織的勻漿或裂解的程度不同的話,所提取的蛋白濃度自然就不相同,因此,對樣品的稀釋倍數(shù)就會存在差異。這種情況下,研究者必須首先提取組織蛋白上清,并測定出蛋白濃度,然后結(jié)合文獻(xiàn)所報道的待測物質(zhì)在該組織中的濃度值(一般為每克組織蛋白中所含待測物質(zhì)的質(zhì)量),對蛋白上清的稀釋倍數(shù)進(jìn)行估算。然后在此估算的稀釋倍數(shù)基礎(chǔ)上,還需要以該稀釋倍數(shù)為中心,另設(shè)23個稀釋度,通過預(yù)實驗摸索出最佳稀釋倍數(shù),最后再進(jìn)行正式實驗。55 抗凝劑的選擇對于某些特殊的檢測指標(biāo),為了使測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠,需要了解相關(guān)的知識。例如,用血漿樣品進(jìn)行脂蛋白分析時,需要注意抗凝劑的選擇。由于枸櫞酸鈉和氟化鈉等低分子量抗凝劑的低滲效應(yīng),使得大量水分子進(jìn)入血漿造成血漿成分的稀釋。而二價陽離子螯合劑EDTA,因其分子量較大,產(chǎn)生的低滲效應(yīng)小,對血漿蛋白濃度影響很小,僅降低3或4 ;肝素比EDTA的分子量更大,其在產(chǎn)生抗凝作用的濃度時未檢測到對血漿的稀釋效應(yīng)。因此,EDTA和肝素均可用作脂蛋白分析研究的抗凝劑;同時,由于EDTA能抑制在血漿凍存過程中發(fā)生的氧化反應(yīng)和酶組分的改變,故在實際操作中EDTA是最常用的抗凝劑。用于基礎(chǔ)研究的ELISA試劑盒,在說明書中一般都會推薦該檢測指標(biāo)需使用的抗凝劑,取血液標(biāo)本之前要注意查看。56 其他需要準(zhǔn)備的儀器及耗材除了酶標(biāo)儀之外,還用到的儀器有酶標(biāo)板專用控溫?fù)u床、37C孵箱和漩渦混勻器等,需根據(jù)不同試劑盒操作要求而選擇使用。此外,各個量程的移液器、一次性吸頭、吸水紙、乳膠手套、燒杯和量筒、去離子水、冰盒、試管及離心管等。在檢測開始之前應(yīng)準(zhǔn)備好以上所有物品放置于手邊,以使檢測過程順利進(jìn)行。57 ELISA操作要點在ELISA操作中有以下幾個步驟較為關(guān)鍵:(1)加樣:加樣要準(zhǔn)確,試劑應(yīng)垂直滴加,不得傾斜、人為的加大試劑量。使用一次性吸頭,防止交叉污染。定期校準(zhǔn)加樣器。標(biāo)本應(yīng)加在微孔底部,避免加在孔壁上部,并注意不要濺出及產(chǎn)生氣泡。(2)溫育:96孔酶標(biāo)板結(jié)構(gòu)特別,易產(chǎn)生邊緣效應(yīng),抗原抗體結(jié)合及酶促反應(yīng)對溫度有嚴(yán)格要求,酶標(biāo)板周圍孔與內(nèi)部孔的升降溫速率不同,造成周邊與內(nèi)部孔結(jié)果有差異。因此,溫育過程中應(yīng)該用封板膜封閉整塊板,盡量避免邊緣效應(yīng)的產(chǎn)生。溫箱溫度必須嚴(yán)格控制,溫育時間也應(yīng)按說明書規(guī)定力求準(zhǔn)確。(3)洗板:冼滌是ELISA操作的重要環(huán)節(jié),手洗條件一致性較差,對結(jié)果影響較大,半自動與全自動洗板機(jī)使用不當(dāng)也會影響結(jié)果。洗滌時確認(rèn)洗液注滿每個板孔,但不可溢出板孔,棄液后將孔內(nèi)液體在吸水紙上拍干。為了洗滌效果更好,實驗室可采用機(jī)器與人工洗滌相結(jié)合的方法,在機(jī)器洗滌后再進(jìn)行人工洗板1-2次,或適當(dāng)增加洗板的次數(shù)。(4)顯色終止:顯色時間應(yīng)嚴(yán)格按說明書的規(guī)定。應(yīng)在顯色終止15min內(nèi)進(jìn)行酶標(biāo)儀讀取。58 使用全自動多功能酶標(biāo)儀建立檢測程序針對具體檢測指標(biāo)而言,使用酶標(biāo)儀及其相關(guān)軟件設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品的濃度、樣品的數(shù)量、樣品的稀釋倍數(shù)、樣品的排布及數(shù)據(jù)輸出格式等條件,在顯色反應(yīng)終止之前預(yù)先建立好檢測程序。待顯色終止后,即可將反應(yīng)板放置于酶標(biāo)儀中,打開檢測程序進(jìn)行讀數(shù),接著可通過連接的打印機(jī)立即打印結(jié)果,操作簡便、快捷。綜上所述,盡管ELISA法操作簡便,但影響測定結(jié)果的因素較多,因此,在實際操作過程中,需要加強(qiáng)質(zhì)量管理,嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行實驗操作。全自動酶標(biāo)儀的應(yīng)用,可實現(xiàn)ELISA標(biāo)準(zhǔn)化檢測,以避免或減少相關(guān)因素的影響,力求結(jié)果準(zhǔn)確,為醫(yī)學(xué)科學(xué)研究提供可靠的依據(jù)。

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