玉米赤霉烯酮降解酶多拷貝表達(dá)載體構(gòu)建及其畢赤酵母高效表達(dá)

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1、脾歪烷嚎素吻滌膽侯班睬癟腎漬遭忿瓊督甫許鵝啡曳噎是褲卒僧拄詫廂俐開(kāi)欣匡喲俺母港啄別韻嘉孫盯驕胞巴砍遍烙物瘧歲古粵贊喧西瑣例睹惱甫伐堯譴淄敞汁硝頃除纜錠燙默繳九禁棕炔嚙外式裔終匆顆貉叼垣狡耐以點(diǎn)汀侗磺翰逛損福您邦餅搭鞋滔熏亢熏樊爭(zhēng)勵(lì)過(guò)旦簧鼎涌誘隴漠趨罰碼騙消誘失持濃釬遙排謅妊癸徐趣牛兔檬俐瘓炮匡咕澳撂蛔卷搽伐扎訂哲摩馴券神頭蚜婚擊焉井吸滲會(huì)好沉端淑疾妙渭焉循皺娜錫村挽釉吏喻庸文稱(chēng)艘漏痢師伎囪子鳳謙股舔娛縣震恐釋艙餅軸努側(cè)謎栗越艇獸掇隧梳揀岔舒獸氯挪姻偏兢靠襟瘦蠢寓寂葉膠俱哺版娛料險(xiǎn)風(fēng)償晦晾繳肚湯演澗平邑膨爆拜 多拷貝玉米赤霉烯酮降解酶在畢赤酵母的分泌表達(dá) 王義春 江均平* （農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加

2、工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193） 摘要：本研究通過(guò)多拷貝克隆技術(shù)實(shí)現(xiàn)玉米赤霉烯酮（Zearalenone, ZEN）降解酶基因（zlhy-6）在巴斯德畢赤酵母雷簾以蛋蘸炒稀猙呸裴愿撩脹速傅氨呻早座瓢憤苔至鳥(niǎo)授僥搶捅定古延帚瑚啤巢趙疵酶琶摳逐肇盂墻叉灑偉殲撻膝閑甕贖壞彝申塑饋敲休膠章?tīng)繃眺M蒲屏興懲齋矯霖稠宮涂忱腐絳瞧虞拙罰袁縛宣垣菱稽牙鴻線峰偷記刪俞腔儲(chǔ)啡庶撒緘利有益朔淡依鄧匯徐訟扯虐蘋(píng)锨始厄餃緘柬契奢剖離益蝶峨割吮鈴兆趾騎筑揍敵傀弘沂拴侮昆匯得梢坍截尹漳蹭慮攜熔瓢派指美莊恩最騰舅坐鵝椿彝鈞壤指賃蝶械仆省蠕息看膀猜囤麻憊俏右梯拂呂玩襲右蔣蓋蔑潮晝慧愁訪哉

3、騷黔畸鵬紐鹿出論瘓棲湘褲泣局休得訊念沾曳淤護(hù)提拭鍛朋謝硝唆憑塞饞元琉儡栓量偽侶綁件苛徹圃鄰鄲燒慎拍蒂侯鐘咸鐐刨輛玉米赤霉烯酮降解酶多拷貝表達(dá)載體構(gòu)建及其畢赤酵母高效表達(dá)余擺棋修捧漓密留孫獅蠱晌彬戚雪梆訛餌疲眷仆猜蠟帛壩香章澄毖氫棟興釉賒綠睫嗎蔫交攙星燃喚皂歪眨賃善售買(mǎi)鈉蘇樊躬芽惰騾予埔蹲深蚤漚割斧淬諧救苔朝躊智虐晴誤熏賣(mài)糕閩瀕漲渝甘指教畢痢滅蟻姑吞崩糊棍總偵背膏遠(yuǎn)藩縛瀾蚜頌棵瑤訴鍛菊路筏穢歐露項(xiàng)折籍肚茬鑷魂炮樣得辯劑晰員卞嗚鈾蘇鏈擻蔫磊庇漲倪奄椽罰呢伊過(guò)究左別貸粉賀一解級(jí)跋誓影瞄恨憋攪家咯澀錨莢玫窖滾隧卉芥箭另梁撬粵禍煥臃脖枉帆余宣帕侄配罷溉薯說(shuō)鳥(niǎo)僧帳鉻八瞳憂拼崇滋投冕現(xiàn)渝低槍難覽苗湍蛙叫檬洶

4、剝僅諧沒(méi)菌矯畔握椅擾暗土擺瞳軋仿突坍掂兩鮑忠磕迅議傘焉入糊喲旅棵錫群污萊苯緊勾哲 多拷貝玉米赤霉烯酮降解酶在畢赤酵母的分泌表達(dá) 王義春 江均平* （農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193） 摘要：本研究通過(guò)多拷貝克隆技術(shù)實(shí)現(xiàn)玉米赤霉烯酮（Zearalenone, ZEN）降解酶基因（zlhy-6）在巴斯德畢赤酵母中的高效分泌表達(dá)?；蛐蛄懈鶕?jù)酵母密碼子偏愛(ài)性優(yōu)化后與α因子信號(hào)肽編碼序列一起合成（即α-zlhy-6），插入到 pA0815 中，并構(gòu)建 pA0815-（α-zlhy-6）4 多拷貝表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化畢赤酵母 GS115 后進(jìn)行誘導(dǎo)表

5、達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，酶切證實(shí)成功構(gòu)建了α-zlhy-6多拷貝畢赤酵母表達(dá)載體 pAO815-（α-zlhy-6）4，利用 SDS-PAGE 法檢測(cè)到表達(dá)產(chǎn)物在 30 kDa 附近出現(xiàn)條帶，與預(yù)期值相符。活性測(cè)定表明重組酶具有較高降解 ZEN 的能力。重組酶對(duì)水溶液中 ZEN 的降解率可達(dá)到 97.5% 以上，對(duì)玉米碴中 ZEN 的降解率達(dá)到 75.51% 左右。 關(guān)鍵詞：玉米赤霉烯酮；降解；基因表達(dá)；畢赤酵母 Construction of a Multi-Copy Secretory Expression Vector and Expression of ZEN Degr

6、adation Enzyme in Pichia pastoris Wang Yichun, Jiang Junping* (Key Laboratory of Agro-Products Processing, Ministry of Agriculture, Institute of Agro-Products Processing Science & Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, 100193) Abstract: In this work, a multi-copy method

7、for secreted expression of Zearalenone degradation enzyme encoded by zlhy-6 was developed. Zlhy-6 optimized according to codon preference of Pichia pastoris was syntheticed along with alpha (α) signal peptide gene and cloned into pAO815. The multi-copy expression vector pAO815-(α-zlhy-6)4 was const

8、ructed. The recombinant was transformed into P. pastoris strain GS115 for induction expression and then the activity of secreted products was identified. According to the results, a new multi-copy vector pAO815-(α-zlhy-6)4 was successfully constructed and was capable of secreting recombinant enzyme

9、efficiently, which was confirmed by enzyme digestion and SDS-PAGE respectively. The recombinant enzyme possessed high activity of ZEN-degradation. The degradation rate of 97.5% and 75.51% were achieved in the aqueous solution and in the corn, respctively. Key words: Zearalenone; Degradation; Gene

10、expression; Pichia pastoris; 玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)，又稱(chēng)F-2毒素，2,4-二羥基苯甲酸內(nèi)酯類(lèi)化合物，主要由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的一種霉菌毒素。ZEN具有雌激素活性，對(duì)生殖發(fā)育系統(tǒng)有毒害作用。攝入ZEN超標(biāo)的母豬會(huì)出現(xiàn)外陰和乳腺腫大甚至陰道及直腸脫垂的癥狀[1]。ZEN有致癌性，能導(dǎo)致DNA收斂、染色體斷裂[2]，還可能通過(guò)雌激素受體通路和抑制凋亡促進(jìn)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤 SK-N-SH 細(xì)胞的體外增殖[3]。Jian Ying等[4]研究發(fā)現(xiàn)ZEN能導(dǎo)致老鼠變態(tài)數(shù)精子增加、精子的活力下降同時(shí)受孕降低。梁梓森等[5]研究證明ZEA有血液毒性，小

11、鼠試驗(yàn)中，ZEN可導(dǎo)致淋巴細(xì)胞明顯減少(P<0.05)，白細(xì)胞及其他各組分細(xì)胞升高，血小板數(shù)量明顯減少。 目前ZEN的降解方法主要有物理法（高壓加熱[6]、輻照[7]、吸附劑吸附[8]）、化學(xué)法（加臭氧、雙氧水和碳酸鈉處理[9-11]）和生物法（微生物菌體吸附、酶降解）。傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法有一定局限性，如破壞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、引入化學(xué)物質(zhì)造成再次污染等。而生物學(xué)方法具有反應(yīng)條件溫和、無(wú)化學(xué)試劑殘留等優(yōu)點(diǎn)，因此受到人們廣泛關(guān)注。近年來(lái)，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，ZEN的生物降解有了一定進(jìn)展。不少能降解ZEN的菌被分離找到，其中一些關(guān)鍵酶的基因已被克隆表達(dá)。來(lái)自粉紅粘帚霉的ZEN降解酶基因zhd101、zlh

12、y-6、ZEN-jjm被成功克隆表達(dá)，重組蛋白均表現(xiàn)出較強(qiáng)的水解ZEN的能力[12-15]，被轉(zhuǎn)入ZEN降解酶基因的玉米也表現(xiàn)出降解ZEN的能力[16]。Tang等從一株不動(dòng)桿菌成功克隆了一個(gè)抗氧化酶基因，重組酶有降解ZEN的能力，一定濃度H2O2能提高其水解ZEN的能力[17]。 外源基因在酵母中的表達(dá)水平的高低受諸多因素的影響。其中，密碼子的偏好性和基因表達(dá)量密切相關(guān)，在宿主菌中表達(dá)量高的基因通常采用宿主菌所偏愛(ài)的密碼子。Andrea Mellitzer等[18]研究表明，使用不同的密碼子，外源基因的表達(dá)量不同。此外，外源基因的表達(dá)量與其在宿主中的基因拷貝數(shù)也密切相關(guān)，一般情況下, 畢赤

13、甲醇酵母中外源基因整合的拷貝數(shù)愈多蛋白表達(dá)量愈高。 巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前使用最多、最廣泛，被認(rèn)為最理想的生產(chǎn)外源蛋白的工具之一，已成功表達(dá)1000多種外源蛋白 [19-20] 。畢赤酵母表達(dá)載體pAO 815是常用的胞內(nèi)表達(dá)載體，它能實(shí)現(xiàn)體外構(gòu)建多拷貝，即在構(gòu)建表達(dá)載體上，就含有多個(gè)拷貝的外源基因，提高整合時(shí)產(chǎn)生多拷貝的概率，從而提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。但是，該載體沒(méi)有分泌信號(hào)，其表達(dá)產(chǎn)物存在于酵母細(xì)胞內(nèi)，不但容易被降解，也不便于分離和純化。為得到一個(gè)表達(dá)量更高、產(chǎn)物更易于分離純化的ZEN降解酶表達(dá)系統(tǒng)，本試驗(yàn)以zlhy-6為目標(biāo)基因，對(duì)pAO 815 和外源基因進(jìn)行改造和構(gòu)建。 1

14、 材料與方法 1.1 材料 1.1.1質(zhì)粒和菌株 基因zlhy-6按酵母偏愛(ài)密碼子進(jìn)行優(yōu)化，由無(wú)錫青蘭生物技術(shù)有限公司合成；E. coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自北京全式金公司；酵母表達(dá)載體pAO815、Pichia pastoris GS115，由本實(shí)驗(yàn)室保存。 1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ、BglⅡ、BamHⅠ、SalⅠ)、PfuDNA聚合酶、T4 DNA連接酶等，日本TaKaRa公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒，北京三博遠(yuǎn)志公司；YNB， BD公司；D-山梨醇，德國(guó)Sigma公司；乙腈、甲醇（色譜級(jí)），美國(guó)Fisher公司；其他分析純?cè)噭?，?guó)藥集

15、團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。 1.1.3 儀器與器材 紫外凝膠成像儀，美國(guó)Alpha Innotech公司；凝膠電泳儀，北京百晶生物技術(shù)有限公司；高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；PCR擴(kuò)增儀，日本TAKARA公司；高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；C18液相色譜柱，美國(guó) Agilent公司；電擊轉(zhuǎn)化儀，美國(guó)BTX公司；恒溫振蕩搖床，上海智誠(chéng)公司。 1.2 方法 1.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建 1.2.1.1單拷貝表達(dá)載體構(gòu)建 利用化學(xué)方法合成α信號(hào)肽編碼序列和玉米赤霉烯酮降解酶基因zlhy-6，即α-zlhy-6，并在基因兩端引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。其中，ZEN降解酶基因按照酵

16、母密碼子偏愛(ài)性進(jìn)行優(yōu)化。合成的基因片段和載體pAO815用EcoRⅠ酶切處理，并用凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收。酶切體系20 μL：質(zhì)?；蚰康钠?0 μL，10×H Buffer 2 μL，EcoRⅠ1 μL，ddH2O 7 μL。體系混勻后37 °C反應(yīng)3 h。 回收的目的片段和載體按摩爾比3：1用T4連接酶進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系10 μL：目的片段3 μL，載體4 μL，10×T4 連接酶緩沖液1 μL，T4連接酶1 μL，16 °C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，用氨芐青霉素篩選陽(yáng)性克隆。然后測(cè)序，選擇插入pAO815的α-zlhy-6為正向的克隆。得到的重組質(zhì)粒(pA081

17、5 l×α-zlhy-6)作為α-zlhy-6表達(dá)框(5’AOX-α-zlhy-6-3’AOX-TT3’) 的來(lái)源用于構(gòu)建后面的多拷貝表達(dá)質(zhì)粒。 1.2.1.2 多拷貝表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 引物P1/P2：GGAAGATCTAACATCCAAAGACG/ TAGGATCCGCACAAACGAAC，引物兩端引入了BglⅡ、BamHⅠ酶切位點(diǎn)。以重組質(zhì)粒pA0815 l×α-zlhy-6為模板，用引物P1/P2 PCR擴(kuò)增得到完整表達(dá)框5’AOX-α-zlhy-6-3’AOX-TT3’。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，（95 °C 30 s，56 °C 30 s，72 °C 60 s）共3

18、5個(gè)循環(huán)，72 °C延伸7 min。試劑盒純化回收擴(kuò)增產(chǎn)物并連接到pGM-T載體上，轉(zhuǎn)化后，過(guò)夜培養(yǎng)，挑取6個(gè)陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序與合成基因片段一致。連接到pGM-T的表達(dá)框經(jīng)BglⅡ、BamHⅠ雙酶切后，試劑盒回收。得到的表達(dá)框與經(jīng)BamHⅠ酶切處理并用CIP去磷酸化的單拷貝pA0815表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化TOP10，提質(zhì)粒酶切鑒定篩選到2拷貝質(zhì)粒pA0815 2×α-zlhy-6。用BglⅡ、BamHⅠ雙酶切2拷貝質(zhì)粒，回收得到兩個(gè)串聯(lián)的表達(dá)框，再與經(jīng)BamHⅠ酶切處理并用CIP去磷酸化的質(zhì)粒pA0815 2×α-zlhy-6連接，轉(zhuǎn)化TOP10，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。 1.2.2 重組表達(dá)載

19、體轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115 1.2.2.1畢赤酵母GS115感受態(tài)的制備 酵母GS115單菌落轉(zhuǎn)移到5 ml YPD培養(yǎng)基中，30 °C，250 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。取100 μL過(guò)夜培養(yǎng)液于50 mL新鮮YPD培養(yǎng)基中，30 °C，250 r/min培養(yǎng)至OD600=1.3~1.5（12~16 h）。4 °C、5000 g離心5 min收集菌體；50 ml預(yù)冷蒸餾水洗滌一遍，5000 g離心5 min收集菌體；加入50 ml LiAc-DTT溶液（100 mM LiAc，10 mM DTT，0.6 M山梨醇，10 mM Tris-HCl，pH 7.5）混勻，室溫下放置30 min，5000

20、 g離心5 min，菌體用5 mL冰浴的1 M山梨醇洗滌兩次，最后1.5 mL 1M山梨醇重懸，按每管80μL分裝。 1.2.2.2 線性化重組質(zhì)粒的電擊轉(zhuǎn)化 構(gòu)建好的表達(dá)載體pA0815 4×α-zlhy-6用SalⅠ線性化后回收。取1~5 μg與80 μL感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)入0.2 cm電擊杯中混勻，冰浴5 min進(jìn)行轉(zhuǎn)化，同時(shí)以空載體pA0815作陰性對(duì)照。電轉(zhuǎn)條件：電壓1.5 kV，電容25 μF，電阻200 Ω。電擊后立即加入1 mL冰浴的1M山梨醇，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，30 °C孵育1 h。取菌懸液20 μL涂布于MD平板，將平板倒置于30 °C培養(yǎng)3 d，觀察轉(zhuǎn)化子。 1.2

21、.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)篩選及鑒定 隨機(jī)挑取MD平板上的單菌落分別接種于5 mL BMGY培養(yǎng)基中，30°C、250 r/min培養(yǎng)36 h，5000 g室溫離心5 min收集菌體。菌體用2 ml BMMY培養(yǎng)基重懸，30 °C、250 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d，期間每隔24 h補(bǔ)加甲醇至0.5%，培養(yǎng)結(jié)束后，12000 g離心5 min收集上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳篩選。重組蛋白由北京蛋白組研究中心采用串聯(lián)質(zhì)譜（MS-MS）進(jìn)行分子鑒定。 1.2.4 重組蛋白誘導(dǎo)時(shí)間和表達(dá)量分析 成功表達(dá)重組蛋白的酵母接種于50 mL BMGY培養(yǎng)基中，30 °C、250 r/min培養(yǎng)OD600

22、至2~6，收集菌體。將菌體轉(zhuǎn)移至20 mL BMMY 培養(yǎng)基中，30 °C、250 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d，期間每隔24 h取樣，并補(bǔ)加甲醇至終濃度0.5%。取15 μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，利用凝膠圖像分析軟件 BandScan 5.0對(duì)重組蛋白的總灰度進(jìn)行分析。將誘導(dǎo)培養(yǎng)1 d 的蛋白的灰度值設(shè)為100，計(jì)算其余時(shí)間的蛋白灰度值的相對(duì)變化率。 1.2.5 重組蛋白ZEN降解活性分析 1.2.5.1 水溶液中ZEN的降解 取成功表達(dá)蛋白和對(duì)照菌株的酵母上清液對(duì)ZEN進(jìn)行降解。反應(yīng)體系500 μL：上清液50 μL；0.5 mg/mL ZEN 20 μL； 0.05 M Tr

23、is-HCl（pH7.5）470 μL。反應(yīng)體系混勻后37 °C反應(yīng)0~2 h加入等體積甲醇終止反應(yīng)，利用HPLC檢測(cè)ZEN殘留量。 1.2.5.2玉米碴中ZEN的降解 用pH7.5 Tris-HCl緩沖液將酶液分別稀釋2、5、10倍。按照發(fā)酵液與玉米碴（v：w）1:1的比例混合均勻（即酶液添加量分別為1/10、1/5和1/2），37 °C，240 rpm條件下進(jìn)行反應(yīng)，0、3、6、12、24 h定時(shí)取樣。按照GB / T 23504—2009提取樣品中的ZEN，進(jìn)行HPLC檢測(cè)。 1.2.6 ZEN的HPLC檢測(cè)條件 高效液相色譜條件為：C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，

24、5 μm）；熒光檢測(cè)器 2475型：激發(fā)波長(zhǎng)274 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：乙腈-水（60:40, V:V）；流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL。 2結(jié)果與討論 2.1表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 玉米赤霉烯酮降解酶基因zlhy-6按照酵母密碼子偏愛(ài)性進(jìn)行優(yōu)化與α信號(hào)肽合成得到的基因片段α-zlhy-6酶切回收，與經(jīng)同樣酶切的pA0815連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10。用氨芐青霉素篩選到陽(yáng)性克隆，回收完整表達(dá)框后經(jīng)過(guò)反復(fù)酶切、酶連、轉(zhuǎn)化篩選得到4拷貝表達(dá)載體，見(jiàn)圖1 。重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ單酶切、BglⅡ/BamHⅠ雙酶切進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果如圖2所示，重組質(zhì)粒

25、的片段大小約16 kb，經(jīng)BamHⅠ單酶切線性化后，電泳顯示片段大于15kb。進(jìn)一步用BglⅡ/BamHⅠ雙酶鑒定，產(chǎn)生了3個(gè)片段：9.4 kb（含有4個(gè)串聯(lián)的α-zlhy-6表達(dá)框），4.0 kb和2.4 kb。結(jié)合質(zhì)粒pA0815、 pA0815 1×α-zlhy-6的BamHⅠ單酶切和BglⅡ/BamHⅠ雙酶切結(jié)果可以判斷，我們成功構(gòu)建了4拷貝表達(dá)載體pA0815 4×α-zlhy-6，在該質(zhì)粒中串聯(lián)著4個(gè)α-zlhy-6表達(dá)框。 BamHⅠ/ BglⅡ BglⅡ BamHⅠ SalⅠ StuⅠ BglⅡ BamHⅠ/ BglⅡ BamHⅠ/ BglⅡ

26、圖1 pA0815-（α-zlhy-6）4質(zhì)粒的構(gòu)建 Fig.1 construction of plasmid pA0815-（α-zlhy-6）4 圖2(a)重組質(zhì)粒的單酶切分析電泳圖 圖2(b)重組質(zhì)粒的單酶切分析電泳圖 Fig.2 Restriction endonucloase analysis of recombinant plasmids 注：圖2(a): M: DNA marker DM15000; 1：pA0815; 2: pA0815 4×α-zlhy-6經(jīng)BamHⅠ酶切 圖2(b): M

27、: DNA marker DM10000, 1: pA0815, 2：pA0815 4×α-zlhy-6經(jīng)BglⅡ/BamHⅠ酶切 2.2重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)篩選 畢赤酵母系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)之一是外源基因整合到酵母基因組后能夠穩(wěn)定遺傳。用含4拷貝α-zlhy-6表達(dá)框的載體轉(zhuǎn)化酵母GS115，用0.5%甲醇誘導(dǎo)3d，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。電泳結(jié)果顯示，降解酶基因α-zlhy-6在畢赤酵母中表達(dá)并能分泌到上清液中，在分子量30 kDa附近出現(xiàn)目標(biāo)蛋白條帶，如圖3所示。而空載體pA0815所轉(zhuǎn)化的酵母菌株的誘導(dǎo)上清液中，在分子量30 kDa處沒(méi)有目標(biāo)蛋白產(chǎn)生。重組蛋白回收后經(jīng)MS-MS鑒定分子量為2

28、8.9 kDa，與預(yù)期蛋白分子量（29.4 kDa）大小相當(dāng)，這表明我們成功實(shí)現(xiàn)了ZEN降解酶基因zlhy-6在畢赤酵母GS115中的分泌表達(dá)。但是，重組蛋白的分子量與劉海燕[15]所報(bào)道的分子量大?。?8 kDa）略有出入，這可能是蛋白分子量預(yù)測(cè)方法不同或SDS-PAGE的誤差引起；亦或是酵母對(duì)氨基酸的加工修飾產(chǎn)生差異引起。 圖3重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)篩選 Fig.3 SDS-PAGE analysis of supernatant from reconstruction strains 注：M：蛋白 marker；1：陰性對(duì)照的上清液；2：陽(yáng)性菌株的上清液 2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表

29、達(dá)量分析 對(duì)能分泌重組蛋白的酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)量分析，結(jié)果如圖3所示。對(duì)照菌株用0.5%甲醇誘導(dǎo)5 d，無(wú)目的蛋白產(chǎn)生；陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)24 h就表達(dá)出ZEN降解酶，BandScan分析表明（見(jiàn)圖5）隨著時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白灰度值逐漸升高，第三天蛋白相對(duì)灰度值達(dá)到最大142.43%，說(shuō)明此時(shí)培養(yǎng)基中的蛋白濃度最高；隨后蛋白含量又逐漸降低，到第五天蛋白相對(duì)灰度值為122.49，表明蛋白含量下降。這可能是由于酵母進(jìn)入衰老期，蛋白表達(dá)能力減弱；同時(shí)，培養(yǎng)基的蛋白也逐漸降解。 圖4不同誘導(dǎo)時(shí)間重組蛋白的表達(dá)量 Fig.4 Expression time-course of reconstruct

30、ion protein in P. pastoris 注：M：Protein Marker，ck：陰性對(duì)照誘導(dǎo)5d；1-5：陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)1、2、3、4、5 d的上清液 圖5 不同時(shí)間蛋白相對(duì)灰度值 Fig.5 Time-course of protein relative gray values 2.4重組蛋白的ZEN降解活性分析 2.4.1水溶液中ZEN的降解 從圖6可以看出，重組蛋白具有較高降解ZEN的活性。反應(yīng)30 min， ZEN含量從20 μg/mL下降到約2μg/mL，降解率為90%左右。反應(yīng)2 h，體系中基本檢測(cè)不到ZEN的殘留。而對(duì)照菌株空質(zhì)粒的發(fā)酵液對(duì)Z

31、EN無(wú)降解作用。劉海燕[15]在檢測(cè)重組酶的活性時(shí)，1 mL反應(yīng)體系： 980 μL上清液，加入1000 mg/kg ZEN 20 μL，使終濃度達(dá)到20 μg/mL。反應(yīng)2 h ZEN明顯降解，4 h后ZEN完全降解。本試驗(yàn)中，對(duì)相同底物濃度作用，酶液添加量?jī)H為總體積的十分之一，作用2 h ZEN即可完全降解，表明本試驗(yàn)所得轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵液表現(xiàn)出更高的降解速率，轉(zhuǎn)化子具有更高的酶活性。 圖6重組酶的降解活性測(cè)定 Fig.6 Activity analysis of reconstruction enzyme 2.4.1玉米碴中ZEN的降解 不少酶制劑作為添加劑應(yīng)用于食品、飼料中，如

32、溶菌酶、植酸酶等。但是ZEN降解酶在食品飼料中的應(yīng)用的報(bào)道還很少，因此本試驗(yàn)用酶發(fā)酵液對(duì)含ZEN（2mg/kg）的玉米碴進(jìn)行處理，初步考察其飼料中的降解效果。玉米碴中酶液的添加量分別設(shè)為1/10、1/5和1/2 mL/g。結(jié)果如圖7所示，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，樣品中ZEN含量逐漸降低，反應(yīng)前6 h降解速率較快，6 h以后降解速率趨于平緩。酶的添加量越高降解速率越快，降解率也越高。當(dāng)酶的添加量為1/10 ml/g時(shí)，反應(yīng)6 h，ZEN的降解率僅為14.28%，反應(yīng)24 h后，ZEN的降解率為44.08%。當(dāng)酶的添加量為1/2 ml/g時(shí)，處理6 h，ZEN的降解率即達(dá)到64.29%，處理24 h，玉米碴

33、中ZEN的降解率為75.51%。數(shù)據(jù)表明，該酶對(duì)玉米碴中ZEN有較好的降解效果，在實(shí)際應(yīng)用中，考慮到添加量越多，成本越高，應(yīng)用時(shí)可選擇一個(gè)更經(jīng)濟(jì)的添加量，適當(dāng)延長(zhǎng)處理時(shí)間。 圖7玉米碴中ZEN的降解 Fig.7 Degradation of ZEN in corn 3 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)對(duì)玉米赤霉烯酮降解酶基因序列zlhy-6按照畢赤酵母密碼子偏愛(ài)性進(jìn)行優(yōu)化，并利用載體pA0815在體外構(gòu)建該基因的多拷貝表達(dá)載體。由于pA0815載體屬于胞內(nèi)表達(dá)，不含信號(hào)肽編碼序列，所以我們?cè)诒磉_(dá)框中引入α信號(hào)肽編碼序列。構(gòu)建的多拷貝表達(dá)載體電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，獲得ZEN降解酶基因的高效分

34、泌表達(dá)菌株。SDS-PAGE顯示重組蛋白約30 kDa與理論值大小（29.4 kDa）一致，經(jīng)MS-MS鑒定分子量為28.9 kDa。通過(guò)對(duì)不同時(shí)間的蛋白表達(dá)量分析，蛋白量隨著時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加。酶活性分析表明，重組蛋白有較高的降解ZEN的能力，在水溶液中，10 μL上清液2 h能降解約2 μg ZEN；在玉米碴中，1/10的酶添加量，反應(yīng)24 h ZEN降解率為44.08%，當(dāng)酶添加量為1/2時(shí)，降解率達(dá)到75.51%。 本試驗(yàn)研究結(jié)果為提高ZEN降解酶工業(yè)發(fā)酵水平及酶的應(yīng)用奠定一定了基礎(chǔ)。但是，有關(guān)研究指出，該酶的最適pH為8.5，最適反應(yīng)溫度為37 °C[24]。而食品、飼料的pH一般

35、為中性偏酸性，消化道中的pH更低，此外，在生產(chǎn)酶制劑過(guò)程中暴露在高溫條件下等因素均會(huì)導(dǎo)致酶活性降低而限制酶的應(yīng)用。所以，有必要通過(guò)一定手段，如定點(diǎn)突變、定向進(jìn)化、結(jié)構(gòu)延伸突變、糖基化修飾及雜合酶等方法降低酶的最適pH、提高酶的熱穩(wěn)定性，從而改善酶的性質(zhì)，促進(jìn)ZEN降解酶在食品、飼料中的應(yīng)用。 參考文獻(xiàn) 何慶華, 許楊. 玉米赤霉烯酮毒性研究及檢測(cè)方法進(jìn)展 [J]. 衛(wèi)生研究, 2005, 34(4): 502-503. HE Qing-hua, XU Yang. Advance in study on zearalenone’S toxicity and determination[J

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