比色法和分光光度法.ppt

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一 概述 1 比色法和可見分光光度法的特點比色法 在分析化學(xué)中 利用比較有色溶液顏色的深淺來測定物質(zhì)含量的分析方法稱為比色法 過去大多用眼睛觀察比較 故又稱目視比色法 第二節(jié)比色法和可見分光光度法 光電比色法 分光光度法 隨著近代分析儀器的發(fā)展 目前已普遍使用光電比色計 分光光度計 通過測量有色溶液對入色光的吸收程度對物質(zhì)進行分析 稱為光電比色法 分光光度法 與目視比色法相比 光度法的特點 靈敏度高 10 5 10 6mol L 準確度較高 儀器設(shè)備較簡單 操作簡便 快速 應(yīng)用廣泛 2 光的性質(zhì)和物質(zhì)的顏色光的性質(zhì) 光是一種電磁波 具有波粒二象性 光的波動性可用波長來描述 其單位常用納米 nm 表示 波長越短 能量越高 具有同一波長的光稱為單色光 由不同波長光組成的光稱為復(fù)合光 互補色光 若將兩種顏色的光按適當(dāng)?shù)膹姸缺然旌峡沙砂坠?那么這兩種光稱為互補色光 物質(zhì)的顏色 物質(zhì)對光的吸收是具有選擇性的 當(dāng)一束白光通過溶液時 若溶液對各種色光都不吸收 則白光全部通過 溶液呈無色透明 若各種色光幾乎全被吸收 則溶液呈黑色 若溶液只吸收某種色光 則溶液呈透過光的顏色 也就是說 溶液呈吸收光的互補色光的顏色 例如 白光通過CuSO4溶液時 溶液顏色為藍色 吸收曲線 為了精確表明溶液對不同波長光的吸收情況 可將不同波長的單色光依次通過某一固定濃度的有色溶液 測量該溶液對各單色光的吸收程度 即吸光度 以波長為橫坐標 吸光度為縱坐標作圖所得曲線 即為吸收曲線 或稱吸收光譜 二 朗伯 比爾定律 1 朗伯 比爾定律 透光度 透光率T 吸光度 A 朗伯 比爾定律 此式表明 當(dāng)一束平行的單色光通過吸光物質(zhì)的均勻溶液時 溶液的吸光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成正比 K 比例常數(shù) 與入射光波長 溶液中吸光物質(zhì)的本性及溶液的溫度有關(guān) 2 吸光系數(shù)當(dāng)b以cm c以g L為單位 K為吸光系數(shù) 用符號a表示 單位為L g cmA abc當(dāng)b以cm c以mol L為單位時 K為摩爾吸光系數(shù) 用符號 表示 單位為L mol cmA bca與 的關(guān)系 比吸光系數(shù) 指質(zhì)量濃度為1 g mL b為1cm時的吸光度值 單位為mL g cm同一物質(zhì)的 與之間的關(guān)系 例1一含F(xiàn)e2 濃度為0 5mg L的溶液 用鄰二氮菲顯色測定 吸收池厚度為2cm 在508nm處測得吸光度為0 19 求其摩爾吸光系數(shù)和比吸光系數(shù) 3 偏離朗伯 比爾定律的原因標準曲線 根據(jù)朗伯 比爾定律 當(dāng)吸收池厚度不變 以吸光度為縱坐標 濃度為橫坐標作圖時 應(yīng)得到一條通過原點的直線 稱為校正曲線或標準曲線 偏離朗伯 比爾定律的主要原因 定律僅適用于稀溶液 化學(xué)變化引起的偏離 正偏離 非單色入射光引起的偏離 負偏離 三 方法和儀器 1 目視比色法目視比色法 用眼睛觀察比較溶液顏色深度以測量物質(zhì)含量的分析方法稱為目視比色法 標準系列法的原理 朗伯 比爾定律對標準系列法原理的解釋 A sbscs xbxcx 標準系列法的優(yōu)點 儀器簡單 操作簡便 適宜于大批試樣分析 適宜于稀溶液中微量組分的測定 某些不完全符合朗伯 比爾定律的顯色反應(yīng) 仍可用此法進行測定 標準系列法的缺點 準確度較差 2 光電比色法和可見分光光度法 光電比色法的原理 所用儀器為光電比色計 光源 濾光片 一定波長范圍的近似單色光 有色溶液 透過光 光電池 檢流計的標盤 可見分光光度法所用的儀器稱為分光光度計 它是利用分光能力很強的棱鏡或光柵的原理 作為單色器 可連續(xù)獲得不同波長的單色光 其波長范圍比用濾光片獲得的更窄 因此用分光光度計可連續(xù)測量某一定濃度有色溶液在不同波長下的吸光度 從而可得其吸收光譜 通過吸收光譜可選擇最適宜的測定波長 所以分光光度計采用適當(dāng)?shù)墓庠春蜋z測器 使測量的范圍不只局限于可見光區(qū) 如用紅外光作為光源成為紅外分光光度法 用紫外線作為光源稱為紫外分光光度法 光電比色計和可見分光光度計的基本部件 a 光源要求 光源須具有足夠的輻射強度 且穩(wěn)定性好 鎢燈是可見分光光度計常用的光源 b 單色器光電比色計 用濾光片獲得單色光 選擇濾光片的原則是 濾光片最易透過的光應(yīng)是有色物質(zhì)最易吸收的光 即濾光片的顏色與溶液的顏色應(yīng)為互補色 也可以使用不同的濾光片測量同一有色溶液的吸光度 測得吸光度最大時所用的濾光片就是最適宜的濾光片 分光光度計 單色器由棱鏡或光柵 狹縫和準直鏡等部分組成 棱鏡 色散元件 有石英或玻璃兩種 它們對不同波長光具有不同的折射率 石英棱鏡對紫外光分光效果好 玻璃棱鏡對可見光分光效果好 因為玻璃對紫外光有吸收 故不能用于紫外光區(qū) 光柵 色散元件 利用光的衍射和干涉原理制成 當(dāng)白光通過密刻平行條痕的光柵后 將不同波長的光色散成連續(xù)光譜 具有波長范圍寬 色散均勻 分辨本領(lǐng)高等優(yōu)點 c 吸收池 比色皿 用于盛裝被測試液和參比溶液 按制作材料不同分為石英吸收池和玻璃吸收池 d 檢測器作用 是將光強度信號轉(zhuǎn)換為可測電信號 常見檢測器有光電池和光電管 光電池 國產(chǎn)581 G型光電比色計及72型分光光度計 優(yōu)點 光電池靈敏度較高 產(chǎn)生的光電池不需要經(jīng)過放大便可直接用靈敏檢流計測量 缺點 光電池經(jīng)強光照射或連續(xù)使用時間過長 易產(chǎn)生 疲勞現(xiàn)象 導(dǎo)致靈敏度降低 遇此情況 應(yīng)暫停使用并避光放置 待其復(fù)原后再用 光電管 國產(chǎn)721型分光光度計 e 指示器 3 常用光電比色計和分光光度計光電比色計 國產(chǎn)581 G型 儀器通常配有紅色 綠色 藍色三塊濾光片 其透過光的最大波長分別在650 530和440mm左右 可見光光度計 國產(chǎn)721型分光光度計 四 顯色反應(yīng)及其影響因素顯色反應(yīng) 將被測組分轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩衔锏姆磻?yīng)稱為顯色反應(yīng) 顯色劑 使被測組分顯色的試劑稱為顯色劑 1 對顯色反應(yīng)的要求 選擇性好 靈敏度高 有色化合物組成恒定 有色化合物的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定 顯色劑在測定波長處無明顯吸收 2 顯色劑顯色劑可分為無機顯色劑和有機顯色劑兩大類 由于大多數(shù)有機顯色劑能與金屬離子形成穩(wěn)定的有特征顏色的螯合物 靈敏度較高 選擇性也較好 因此 在比色分析和光度分析中主要選用有機顯色劑 兩種常用的有機顯色劑 鄰二氮菲其結(jié)構(gòu)式為這是目前廣泛用于測定Fe2 的較好的顯色劑 先用鹽酸羥胺把待測試液中的Fe3 還原為Fe2 然后在pH5 6的條件下 與鄰二氮菲反應(yīng) 生成穩(wěn)定的橙紅色配合物 配合物的 max為508nm 反應(yīng)是特效的 靈敏度也較高 摩爾吸光系數(shù) 為1 1 104L mol cm 雙硫腙其結(jié)構(gòu)式為 3 影響顯色反應(yīng)的因素 顯色劑的用量 顯色反應(yīng)表示式 M RMR 被測組分 顯色劑 有色配合物 顯色劑的用量應(yīng)當(dāng)適宜 其用量是通過實驗確定 實驗方法為 固定被測組分的濃度和其它條件 改變顯色劑在溶液中的濃度cR 分別測量吸光度 A 繪制A cR曲線 溶液的酸度適宜酸度范圍確定方法 固定顯色劑和被測組分的濃度 改變?nèi)芤旱膒H值 分別測量吸光度 繪制A pH曲線 曲線平坦部分所對應(yīng)的pH值即為適宜的酸度范圍 顯色時間作吸光度 時間曲線 確定適宜的顯色時間 顯色溫度 溶劑的性質(zhì) 共存離子的干擾及其消除 消除共存離子干擾的方法 a 控制溶液的酸度b 加入掩蔽劑c 分離干擾離子 五 光度測量條件的選擇 1 選擇合適波長的入射光 選被測有色物質(zhì)的 max為入射光 如在 max處顯色劑或干擾組分有明顯的吸收 則應(yīng)選靈敏度較低但能避免干擾的適宜波長的光作為入射光 2 選擇適宜的參比溶液 當(dāng)被測溶液 顯色劑及所用其他試劑均無色 可用純?nèi)軇┳鳛閰⒈热芤?稱為溶劑空白 當(dāng)顯色劑無色而被測試液中存在其他有色離子時 可用不加顯色劑的被測試液作為參比溶液 稱為試樣空白 當(dāng)顯色劑或其他試劑有色 可用顯色劑或其他試劑作為參比溶液 稱為試劑空白 用不含被測組分的試樣 在相同條件下與被測試樣同時進行處理 測吸光度時以前者所得溶液為參比溶液 稱為平行操作空白 如臨床上進行某種藥物濃度的監(jiān)測 取正常人血樣和待測血藥濃度的血樣在相同條件下處理 用前者得到的溶液作為參比溶液 3 控制適當(dāng)?shù)奈舛茸x數(shù)范圍適宜讀數(shù)范圍 吸光度A在0 15 1 0內(nèi) 或透光度T值在0 10 0 70內(nèi) 六 比色法和可見分光光度法的定量方法 1 校正曲線法 適用于經(jīng)常性的批量分析 2 標準對比法 標準品對照法 此法適宜于非經(jīng)常性的分析工作 當(dāng)校正曲線通過零點時 將樣品溶液和一標準溶液在選定實驗條件下顯色 測得吸光度分別為Ax和As 標準溶液的濃度為cs 則樣品溶液的濃度cx可按下式求得 在藥物分析中 為了測定方便 通常使被測試樣稱樣量和稀釋倍數(shù)與標準試樣一致 則被測試樣的含量 可由測量的兩者吸光度的比求得 即 另外 在藥物分析中 還常用與標準品的比吸光系數(shù)比較進行含量測定 如被測試樣稱樣量和稀釋倍數(shù)與標準品一致 在相同條件下 測得被測試樣與標準品的比吸光系數(shù)分別為和則試樣質(zhì)量濃度為 七 比色法和可見分光光度法在醫(yī)學(xué)檢驗中的應(yīng)用全血中鐵的測定全血中鐵的測定需要先將各種形式的鐵轉(zhuǎn)化為游離的Fe3 離子 通常用消化法 蛋白質(zhì)用鎢酸沉淀除去 取無蛋白的濾液 在一定條件下加KSCN顯色劑 生成血紅色配合物 反應(yīng)式為 在520nm波長處或用藍綠色濾光片測量吸光度 與標準溶液比較 求出含量