利用CRISPCAS9技術(shù)改良水稻YN6的香味品質(zhì)分析研究生物技術(shù)專業(yè)

論文題目：利用CRISP/CAS9技術(shù)改良水稻YN6的香味品質(zhì)摘要稻米的香味品質(zhì)是稻米品質(zhì)的重要內(nèi)容之一。對稻米品種的香味品質(zhì)改良，有利于增加其市場經(jīng)濟(jì)價值。研究表明，稻米的香味性狀主要由水稻第8染色體上的甜菜堿醛脫氫酶（Betaine Aldehyde Dehydrogenase，OSBadh2）控制。該基因失活使芳香物質(zhì)2-乙?；?1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2AP）在稻米中大量積累，產(chǎn)生香味。本次實驗使用了最近幾年新興的定點基因敲除技術(shù)CRISP/CAS9，本實驗通過基因敲除技術(shù)來對北方粳稻品系YN6進(jìn)行改良，通過敲除YN6水稻基因組中OSBadh2基因，改良基因香味品質(zhì)。具體操作結(jié)果如下：1 實驗過程中實現(xiàn)了對具有定點敲除功能的CRISP/CAS9載體的構(gòu)建；2轉(zhuǎn)化CRISP/CAS9載體，獲得了1000個獨立抗性愈傷，從中分化出732個獨立的轉(zhuǎn)基因植株。3 通過對CRISP/CAS9修飾的OSBadh2目標(biāo)位點處的序列進(jìn)行測序分析，從中獲得了兩株發(fā)生了基因編輯。目標(biāo)基因經(jīng)修飾后產(chǎn)生了移碼突變，經(jīng)加代純合后，產(chǎn)生了香味表型。關(guān)鍵詞香味基因；CRISP/CAS9；定點突變技術(shù)；轉(zhuǎn)基因AbstractFragrance is one of the most significant rice qualities. Improvement of rice fragrance quality will undoubtedly enlarge rice marketing value. Rice fragrance was suggested to be controlled by a betaine aldehyde dehydrogenase (OsBadh2) gene，which is located in rice chromosome 8. The disfunction of this gene will lead to massive production of an aromatic compound 2-acetyl-1-pyrroline (2AP) in rice，which consequently generate rice fragrance phenotype.This study applied a recently developed gene-editing technology，which is mediated by a transcription activator-like effector nuclease (CRISP/CAS9）and is，in result，capable of modifying the target gene. Through CRISP/CAS9 technology，we successfully disenable the OsBadh2 gene in an elite japonica variety YN6，strongly adding the material the rice fragrance. The main results were concluded as follows:1.A functional CRISP/CAS9 vectors was established.2.Through transformation of CRISP/CAS9 via Agrobacterium mediated genetic transformation，we obtained 1000 independent hygromacin-resistant calli，and among them，732 independent transgenic plants were differentiated. 3.Through analysis by sequencing the CRISP/CAS9 aimed site in the target gene OsBadh2，we identified 2 plants，in which several bases were occurred deletion，leading to gene frame shift mutation. The homologous lines were able to produce readily perceivable fragrance.Key wordsFragrance gene; CRISP/CAS9;gene editing technology; genetically modified III目錄摘要IAbstractII1. 前言11.1香稻米的定義及我過香稻米的現(xiàn)狀11.2 水稻香味的研究進(jìn)展11.2.1 水稻香味的形成機制11.2.2香味的鑒定方法21.3 CRISP/CAS9技術(shù)原理21.4實驗?zāi)康募耙饬x32. 材料與方法42.1材料42.1.1材料42.1.2轉(zhuǎn)化相關(guān)試劑52.1.3 PCR鑒定分析所用試劑52.1.4試驗引物62.2試驗相關(guān)儀器62.3方法72.3.1水稻轉(zhuǎn)化體系建立與再生轉(zhuǎn)基因苗的建立72.3.2轉(zhuǎn)基因苗子鑒定分析82.3.3水稻香味的鑒定方法93. 結(jié)果與分析93.1 YN6香味基因的序列分析93.2載體的構(gòu)建及分析94. 討論114.1選擇CRISP/CAS技術(shù)構(gòu)建載體114.2基因定點編輯技術(shù)124.3實驗展望13結(jié)論14參考文獻(xiàn)15致謝171. 前言水稻是世界上許多國家重要的糧食作物。隨著人們經(jīng)濟(jì)生活的水平的提高，稻米的食用口感越來越受到關(guān)注。香米在國內(nèi)外市場上倍受消費者的追捧，具有非常良好的市場效益，這使對水稻香味的研究有了重大意義，包括對控制香味的基因，遺傳特性和香味的鑒別。1.1香稻米的定義及我過香稻米的現(xiàn)狀我國是稻作歷史最悠久、水稻遺傳資源最豐富的國家之一，浙江河姆渡、湖南羅家角、河南賈湖出土的炭化稻谷證實，中國的稻作栽培至少已有7000年以上的歷史。我國科學(xué)家在矮化育種、雜種優(yōu)勢利用的雜交水稻、超級稻育種、水稻生物技術(shù)研究等方面，均走在世界的前列1。根據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) ( 香稻NY / T596-2002)，對香稻米的定義是:自身含有香味物質(zhì)，其香味強度超過人對香味的識別閾，在蒸煮或生熟品嘗過程中，能夠逸出或散發(fā)令人敏感香味的稻米。世界上各水稻生產(chǎn)國均有香稻種植，其普遍分布在東南亞和南亞地區(qū)，主要在印度、巴基斯坦、中國臺灣、孟加拉國、阿富汗、伊朗、中國和美國等地。國際市場上著名的香米品種主要有巴基斯坦的Basmati種群、泰國 Khao Dawk Mai1105、Jasmine、RD6、Siamati等。中國的香稻資源也很豐富，如陜西的洋縣香米、湖南的江永香米、山東的曲阜香米、福建的過山香米等2。1.2 水稻香味的研究進(jìn)展1.2.1 水稻香味的形成機制許多研究人員對香米的成分進(jìn)行分析，被檢測出來且具有揮發(fā)性的物質(zhì)有上百種，但是經(jīng)過眾多學(xué)者的研究，控制香米香味的主要物質(zhì)是2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrrolin，2AP）3。但是對于香米香味的遺傳方式，各個研究人員產(chǎn)生了分歧4。對于香味遺傳所產(chǎn)生的分歧，主要是因為對香味不能進(jìn)行一個定量的分析，各個研究人員的對香味的評判方式并不一致，而且對香味定量也有一定的難度。盡管有這些分歧，研究者們還是得到了一個被眾人認(rèn)可的結(jié)論，即水稻香味是受隱性單基因遺傳控制5。1.2.2香味的鑒定方法對于香味的鑒定，有五種方法。熱水法是將研磨后的稻粒放入試管中加熱，通過嗅其產(chǎn)生的味道來鑒別是否有香味。但這種方法存在風(fēng)險，有可能會因為其他物質(zhì)的揮發(fā)產(chǎn)生干擾。故目前大多數(shù)研究者很少使用這種方法。咀嚼法是一個常用的香味鑒別方法。即通過咀嚼稻米粒直觀的鑒別是否產(chǎn)生了香味6。蒸煮法是將水稻煮熟成為米飯，來鑒別香味是否產(chǎn)生。氫氧化鉀浸泡法實驗室中較為常用，其鑒別結(jié)果比較準(zhǔn)確，不易被其他物質(zhì)干擾，其原理是因為KOH可以與香稻的香味產(chǎn)生物質(zhì)2-乙酰-1-吡咯啉特異性結(jié)合，且不能與稻米里其他物質(zhì)反應(yīng)。以上四種方法事項未鑒定的定性檢測方法。其中KOH浸泡法最為實用，結(jié)果也很準(zhǔn)確。另外三種方法比較簡便，但不夠準(zhǔn)確。因為每個人的味覺嗅覺有差異。會使實驗結(jié)果不準(zhǔn)確。第五種方法是一種較為準(zhǔn)確的定量分析法，氣-質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)法有很多的有點，其結(jié)果準(zhǔn)確，是目前鑒別香味的最準(zhǔn)確的方法之一。主要的方法是先將稻米研碎，用溶液溶解。再用蒸餾法將提取出的稻米主要物質(zhì)蒸餾，使主要物質(zhì)變成氣體，再將氣體注入氣相色譜儀進(jìn)行分析，最后再用質(zhì)譜法定性牌7。1.3 CRISP/CAS9技術(shù)原理基因組編輯技術(shù)是一種新興的一種對基因組進(jìn)行準(zhǔn)確修飾的技術(shù)，它能在基因組上進(jìn)行定點突變、插入或刪除、基因置換、在兩位點或多位點同時定點突變或小片段缺失等操作，已經(jīng)成為目前發(fā)育生物學(xué)中的重要工具8。該技術(shù)可以用于系統(tǒng)地研究基因、調(diào)控元件在特定生理或發(fā)育過程中所起到的作用，或者用于作物性狀的定向改良9。CRISPR/CAS 系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)非常簡單，是CRISPR位點附近410個編碼CAS蛋白的基因連接組成10。CRISPR位點由同向保守重復(fù)序列(directed repeats)、間隔序列(spacers)和5端的前導(dǎo)序列(leader sequence)排列組成11。其中，間隔序列來源于外源基因片段即原間隔序列(protospacers)，重復(fù)序列與間隔序列排列，可以擁有2100個重復(fù)12。 CRISPR序列基因被轉(zhuǎn)錄為pre- crRNA(precursor CRISPR RNA)，然后被剪切為較短的CRISPR RNAs (crRNAs)，指導(dǎo)Cas蛋白的識別與降解13。Cas基因則主要編碼切割、修飾核酸相關(guān)的蛋白14。在進(jìn)行基因組編輯時，CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要起兩個作用15：一是與RNA相結(jié)合，這個作用在識別序列的過程中起決定性作用；另一個是間隔序列(protospacer adjacent motif，PAM)也參與識別靶序列16。PAM序列是有物種特異性的，不同細(xì)菌中序列不同17。目前在基因組編輯中，應(yīng)用最廣泛的是Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)，它的PAM序列是5'-NGG-3'18。自 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)被開發(fā)為基因組編輯工具后，很快就成功應(yīng)用于各種動物和微生物等多個物種中19。但直到2013年，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞實驗室才首次將該技術(shù)應(yīng)用到水稻、小麥中，證明了CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠應(yīng)用于植物基因組編輯中20。1.4實驗?zāi)康募耙饬x本研究所用水稻材料為北方優(yōu)良粳稻品系YN6。YN6米粒與北方其它普通粳稻相比，抗冷與抗病性強、生育期短但結(jié)實率好，粒長且米飯口感好。與黑龍江省的優(yōu)質(zhì)香米稻花香2號相比，YN6不易倒伏，適種性廣， 但不具有香味。本研究利用CRISP/CAS9基因定點編輯技術(shù)，定向敲除失活YN6的OsBadh2基因，使YN6產(chǎn)生香味表型。香稻是一種各個器官均能散發(fā)香味的特殊水稻品種，香稻的營養(yǎng)物質(zhì)含量很高，含有大量的氨基酸和蛋白質(zhì)，受到了各國人民的追捧。香稻具有良好的口干，清新的香味，豐富的營養(yǎng)價值，是各種水稻中的珍品，其歷史大約已有2000年21。眾所周知，中國是世界第一水稻生產(chǎn)和消費大國，擁有豐富多樣香稻品種，但出口型優(yōu)質(zhì)香稻品種廖廖無幾，占領(lǐng)國際香米市場一席之地的中國香米幾乎為零，搶占國際香米交易市場的主要是印度Basmati香 米品系、泰國KDML105、中國臺灣Jasmine。加強中國香稻育種研究工作，提升中國香米生產(chǎn)水平和出口競爭水平，是當(dāng)前中國稻作科研的迫切任務(wù)22。2. 材料與方法2.1材料2.1.1材料本研究所用水稻材料為黑龍江省粳稻品種YN6。YN6米粒與北方其它普通粳稻相比，抗冷與抗病性強、生育期短但結(jié)實率好，粒長（如圖2-1）且米飯口感好。與黑龍江省的優(yōu)質(zhì)香米稻花香2號相比，YN6不易倒伏，適種性廣， 但不具有香味。稻花香2號YN6圖2-1 稻花香與YN6生育期與粒型比較Figure 2-1 The comparisons of two traits between Daohuaxiang and YN62.1.2轉(zhuǎn)化相關(guān)試劑農(nóng)桿菌EHA105菌種，由本實驗室提供。實驗中所用的誘導(dǎo)、繼代、選擇、分化和生根培養(yǎng)基的組成，見表3-1表3-1水稻再生及轉(zhuǎn)化體系用到的培養(yǎng)基Table 2-1 The medium of rice regeneration and transformation system2.1.3 PCR鑒定分析所用試劑CTAB 緩沖液、TE 緩沖液、氯仿/異戊醇（V:V=24:1），70%乙醇，無水乙醇，異丙醇、RNA 酶、蒸餾水、液氮、5×TBE 母液、10×TBE 母液、10過硫酸胺 (APS)、6%聚丙烯酰胺膠儲存液、Loading Buffer 溶液、2%剝離硅烷、0.5%親和硅烷、固定液（冰醋酸 100mL 加蒸餾水至 1000mL）、銀染液（1 gAgNO3+1.5 mL 37%甲醛+1 LH2O）；顯影液（1L 30g/L Na2CO3+1.5 mL 37%甲醛+200L 10 mg/ml 硫代硫酸鈉）。2.1.4試驗引物由于利用CRISPR/CAS9技術(shù)敲除水稻OsBadh2基因，當(dāng)載體導(dǎo)入細(xì)胞體內(nèi)所結(jié)合的位點有多個。為了防止誤差，我們需對位點進(jìn)行檢測，鑒定CRISPR/CAS9鑒定體中的T-DNA轉(zhuǎn)移整合到待改良水稻品系YN6中。此處我們利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)方法進(jìn)行鑒定，所用引物為Ubiq1/Ubiq2。第二步對轉(zhuǎn)基因的編輯作用位點進(jìn)行PCR鑒定分析和測序分析，所用引物為TALfr F/TALfr R。引物均由上海生工有限公司合成，具體序列參見表2-1。表2-1 用于篩選和鑒定轉(zhuǎn)基因和基因編輯事件的引物序列Table 2-1 The primer sequences for screening and identification of the transgenic and gene-editing events.引物名稱引物序列(53)TALfr FTALfr RUbiq1Ubiq25-ACACAGCAATCTTTCCTGAAC-35-TGAAATACCAAGGTGTGATC-35- GTAACCTCGGATTCAGC-35-GTCAATCTAGCCTAATCTGTC-32.2試驗相關(guān)儀器實驗中所使用的儀器和設(shè)備均由黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供如表2-2。表2-2 實驗所用儀器Table 2-2 Laboratory instruments2.3方法2.3.1水稻轉(zhuǎn)化體系建立與再生轉(zhuǎn)基因苗的建立將種子去殼浸泡在濃度為65%的乙醇溶液中20s，取出后吸干水分，放入升汞溶液中，20分鐘后沖洗掉升汞。將洗干凈的種子吸干水分，放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，等待種子發(fā)芽。兩周后長出愈傷組織，但生長出的愈傷組織很不規(guī)則，則需要進(jìn)行兩次約為20個小時的繼代培養(yǎng)，便可以長出微黃色的形狀規(guī)則的胚性愈傷組織。此時先后放入預(yù)分化培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別為14天和20天，此時會生長出分化的幼苗。統(tǒng)計各個品種愈傷組織中誘導(dǎo)和分化的比例。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化體系如下：1）菌液準(zhǔn)備：將帶有CRISPR/CAS9載體的EHA105農(nóng)桿菌制成菌懸液，進(jìn)行梯度稀釋，稀釋完成后涂布祖平板上，培養(yǎng)一段時間，挑取菌落在新培養(yǎng)基上培養(yǎng)，放置備用。2）植物體備用：取植株的愈傷組織，切成1cm的小塊。取用時要輕拿輕放，防止愈傷組織有破損。 3）滅菌和培養(yǎng)：將培養(yǎng)基放入0.103MPa、121、20min高壓蒸汽滅菌。將愈傷組織放入滅菌好的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。經(jīng)常觀察植株生長情況，期間如果植株不生長要更換培養(yǎng)基。每天記錄生長情況 4）篩選和檢測：分別取被侵染培養(yǎng)3天的愈傷組織和滅菌7天的水稻愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有25mg/L的潮霉素篩選培養(yǎng)基上，用篩選培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，平均每兩周一次。培養(yǎng)過程中會有部分愈傷組織死亡，選取存活部分培養(yǎng)1-2次，培養(yǎng)完成后放入分化培養(yǎng)基中分化培養(yǎng)，大約15-20天左右即可分化出淡黃色的幼苗，再將幼苗小心放入生根培養(yǎng)基培養(yǎng)20天獲得植株。再用PCR技術(shù)測其序列，確認(rèn)基因是否重組。統(tǒng)計各個表型的植株的數(shù)量，并選出表型最佳的植株。2.3.2轉(zhuǎn)基因苗子鑒定分析按 Edwards et al(1991)且稍有改進(jìn)的 CTAB 法提取轉(zhuǎn)基因材料的 DNA。用PCR法進(jìn)行分子鑒定。PCR 反應(yīng)體系采用 10L 體系：包括20 ng/l DNA 1.00L，10×PCR buffer（含 Mg2+）1.00L，10 mmol/L dNTP 0.75L，2mol/L Primer 1.00L，5 U/L Taq DNA polymerase 0.25 L，最后加 ddH2O 6.00L。擴(kuò)增程序為：94預(yù)變性 5 min，55-65（根據(jù)不同反應(yīng)）退火 30 s，72延伸 1 min 后回到 95變性 30 s，共循環(huán) 37 次左右；然后 72 延伸 10 min，待溫度降至 10以下，取出用于電泳。采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定轉(zhuǎn)基因事件；用6%的聚丙烯酰胺 (Acrilamide) 凝膠電泳和銀染法檢測目標(biāo)基因編輯事件，聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳和染色方法按Panaud et al.1996描述的方法進(jìn)行。2.3.3水稻香味的鑒定方法采用1.7% KOH浸泡法和咀嚼法兩種方法來驗證鑒定改良水稻植株的香味。(1) 1.7% KOH浸泡法鑒定香味：將水稻葉片剪成1cm左右置于10mL試管中，倒入約8mL 1.7% KOH溶液浸泡，同時蓋緊管口，10min后打開管口，即可辨別出是否有香氣逸出。(2) 咀嚼法鑒定香味：取1粒米于口中，仔細(xì)咀嚼品嘗，用鼻子吸一口氣，然后呼氣，即可辨別出是否有香氣呼出。此方法需要反復(fù)試驗，一般連續(xù)2-3次咀嚼即可完成一個樣品的鑒定，檢驗第二個樣品前須漱口。3. 結(jié)果與分析3.1 YN6香味基因的序列分析我們首先比較了水稻YN6和稻花香2號香味基因自起始密碼子上游3kb處到終止密碼子間的基因序列，確定了YN6的香味基因Badh2基因與稻花香品種在DNA序列第7外顯子上存在序列差異，其余序列部分兩者之間完全一致。序列差異情況與文獻(xiàn)報道情況一致，如圖3.1A所示，其中稻花香在OsBadh2第7外顯子存在短序列缺失，造成移碼突變。據(jù)此，我們認(rèn)為，通過失活YN6的OsBadh2基因，將可能改良該品種的香味品質(zhì)。3.2載體的構(gòu)建及分析根據(jù)上述的序列分析，我們在YN6的OsBadh2基因第2外顯子處選取了一段序列作為CRISPR/CAS9酶識別和編輯位點，如圖3.1B所示。CRISPR/CAS9識別序列為：L-arm: GCTGGATGCTTTGAGT A構(gòu)建識別目標(biāo)編輯位點的左側(cè)序列的CRISPR/CAS9載體 (L-CRISPR/CAS9 vector)，其對應(yīng)的氨基酸序列設(shè)計如下:L-sequence: 圖3.1 YN6香味基因序列分析及轉(zhuǎn)化CRISPR/CAS9載體的構(gòu)建Figure 3.1 The sequence analysis of fragrance gene in YN6 and the schedule of transform-CRISPR/CAS9 vector constructionCRISPR/CAS9識別序列為：R-arm：GCCTTTTGTCCAAGGA T構(gòu)建識別目標(biāo)編輯位點的右側(cè)序列的CRISPR/CAS9載體 (R-CRISPR/CAS9 vector)，其對應(yīng)的氨基酸序列設(shè)計如下:R-sequence: 上述識別目標(biāo)編輯位點的左右兩側(cè)序列的CRISPR/CAS9載體示意圖如圖3.1 b，c對上述的構(gòu)建好的轉(zhuǎn)化CRISPR/CAS9載體進(jìn)行SacI，出現(xiàn)預(yù)期的兩條帶，大小分別為包含R-sequence的4kb片段和轉(zhuǎn)化CRISPR/CAS9栽體的其它序列12 kb（如圖3.1d）。對上述兩片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收純化，并進(jìn)行測序分析，與預(yù)期的結(jié)果完全一致，表明轉(zhuǎn)化CRISPR/CAS9載體構(gòu)建成功。4. 討論4.1選擇CRISP/CAS技術(shù)構(gòu)建載體和傳統(tǒng)的誘變技術(shù)相比較，基因定點編輯技術(shù)完全可以按照我們的意愿去對任意位點進(jìn)行誘變。另外，修飾后的基因會隨染色體DNA復(fù)制而進(jìn)行復(fù)制，進(jìn)而進(jìn)行遺傳，這也有便于后續(xù)的實驗統(tǒng)計與觀察研究。近年來CRISP/CAS技術(shù)以其獨特的優(yōu)勢得以迅速發(fā)展，CRISP/CAS技術(shù)由于其簡單的技術(shù)原理和實驗操作等優(yōu)點，這個技術(shù)對細(xì)胞的要求不是那么嚴(yán)格，所以可以應(yīng)用到各種物種和所有的體外培養(yǎng)的細(xì)胞。這一技術(shù)是目前應(yīng)用最廣，效率較高，最具有實踐應(yīng)用前景的基因打靶技術(shù)。在糧食作物和各種經(jīng)濟(jì)物種中，利用CRISP/CAS可以人為的改變?nèi)我庑誀?，從而培育出我們所需要的，含有各種好性狀的超級植物。同時，CRISP/CAS技術(shù)也可以應(yīng)用到醫(yī)學(xué)研究方面，建立突變體庫，為人類的疾病是如何發(fā)生的以及怎樣發(fā)展的提供依據(jù)。但是，這一技術(shù)仍然存在缺點，它會引起細(xì)胞的兩種修復(fù)機制，從而也會發(fā)生一些有違我們意愿的突變，另外，也會出現(xiàn)概率極少的不能識別目標(biāo)基因位點的現(xiàn)象。但是，這一技術(shù)仍然具有巨大潛力，我們有理由相信，隨著科技的發(fā)展，這一技術(shù)必將會對科學(xué)界做出巨大的貢獻(xiàn)。實驗有待進(jìn)一步改進(jìn)。最主要的是先保證選取的CRISP/CAS識別區(qū)域和載體的剪切的高效性。我們可以嘗試不同濃度的菌懸液優(yōu)化實驗環(huán)節(jié)中的每個方法及步驟，從而增加陽性植株的轉(zhuǎn)化效率。進(jìn)而能夠得到足夠多的陽性植株，在保證陽性植株數(shù)量的前提下再進(jìn)一步篩選出我們想要的定向編輯植株。4.2基因定點編輯技術(shù)在目前看來，要想在各種高等植物中采用這個技術(shù)獲得不菲成就，我們還要克服許多的問題。近年來，科學(xué)家們通過多種途徑不懈努力和探索，已經(jīng)取得了一些令人振奮的結(jié)果。一個具有參考價值的實驗為我們積攢了十分重要的數(shù)據(jù)和技術(shù)。就是借鑒大馬哈魚的基因打靶的成功經(jīng)驗，并且成功篩選出最初我們設(shè)計想要得到的突變體，從而最終達(dá)到基因的定點編輯目的。這一實驗也為植物基因組的定點敲除，基因敲入和堿基的定點置換提供了巨大的參考意義。并且這一技術(shù)是目前最有利用價值的植物基因組定點編輯技術(shù)。因為大多數(shù)基因功能的改變是由基因內(nèi)部某一個或者某幾個堿基的突變而引起的，所以利用寡核苷酸介導(dǎo)基因的單堿基突變在植物育種中具有十分重要的理論和實踐利用價值。但是這一技術(shù)的修復(fù)的效率不穩(wěn)定和后期的篩選困難等缺陷大大的限制了該技術(shù)的發(fā)展與使用。在實驗操作中我們還可以調(diào)節(jié)和控制基因遺傳過程中的相關(guān)路徑，如對相關(guān)中間代謝產(chǎn)物和相關(guān)酶進(jìn)行改良，從而最終達(dá)到高效率的基因打靶目的。但是，我們也不得不考慮到事情的反方面，也就是這一技術(shù)也有可能對目標(biāo)基因以外的其他有益基因進(jìn)行修飾更改，從而造成一些優(yōu)良性狀的退化。綜上所述，要想根據(jù)人們的意愿將一些植物的某些基因進(jìn)行定點修飾、將兩種或多種有益基因進(jìn)行結(jié)合，將不益于植株生長的基因替換掉，這些基因的定點編輯技術(shù)依然存在著我們預(yù)想不到的困難?？傊覀兛梢酝ㄟ^各種各樣的生物學(xué)理論的結(jié)合和生物實驗技術(shù)的合作，相信在未來，這個技術(shù)一定可以為我國的水稻育種提供不錯的作用。4.3實驗展望鑒于已成功獲得了YN6的Badh2基因獲得了定點敲除的植株，并且已經(jīng)證實產(chǎn)生了香味，再接下來的實驗中我們會對獲得的植株進(jìn)行檢測，觀察其內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)，并且檢測是否含有其他有害物質(zhì)。檢測完成后應(yīng)用孟德爾遺傳定律多培養(yǎng)幾代，計算出有香味表型的植株的遺傳概率，尋求一定的方法，找出能讓香味基因穩(wěn)定遺傳的親本組合。相信通過CRISP/CAS9技術(shù)不僅可以改良水稻的香味基因，還可以改良水稻的抗冷、抗病、抗旱等基因，來獲得生存穩(wěn)定易活的，產(chǎn)量高的，高品質(zhì)的優(yōu)良水稻。結(jié)論根據(jù)水稻香味基因Badh2的表達(dá)機理，本試驗選取了Badh2基因的第七外顯子一段序列作為CRISP/CAS9的識別和切割作用位點，運用酶切酶連方法將兩個識別位點成功地連接到了CRISP/CAS9骨架上，并將這對CRISP/CAS9骨架連接到表達(dá)載體上，最后成功的將這一表達(dá)載體運用電轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)入到了農(nóng)桿菌中，經(jīng)PCR檢測，測序檢測挑選連接完全正確的載體待用。利用實驗室的組織培養(yǎng)條件，無菌操作技術(shù)。經(jīng)過前期的水稻愈傷細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，愈傷組織的侵染及清洗，最后成功的篩選出抗性愈傷組織并將其分化成苗，經(jīng)過大田的栽培及田間的成功管理收獲種子。經(jīng)過PCR鑒定、尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定、目標(biāo)區(qū)域的基因組測序分析、KOH浸泡法和咀嚼法鑒定。成功篩選出了具有怡人香味的水稻品種。經(jīng)過測序分析YN6的Badh2基因發(fā)生了8個堿基的缺失，另一株發(fā)生了4個堿基的缺失和2個堿基的置換。從而使YN6水稻品種本身存在的Badh2基因發(fā)生了功能的缺失。使原本不具有香味的YN6品種獲得了香味表型。參考文獻(xiàn)1虞國平，朱鴻英.我國水稻生產(chǎn)現(xiàn)狀及發(fā)展對策研究J.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009(06):122-126+130.2楊揚，謝震澤，王軻，晏月明.水稻香味的遺傳研究進(jìn)展J.首都師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2010，31(03):24-29.3Cooked 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