利用CRISPCAS9技術(shù)改良水稻YN6的香味品質(zhì)分析研究生物技術(shù)專(zhuān)業(yè)

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1、論文題目：利用CRISP/CAS9技術(shù)改良水稻YN6的香味品質(zhì)摘要稻米的香味品質(zhì)是稻米品質(zhì)的重要內(nèi)容之一。對(duì)稻米品種的香味品質(zhì)改良，有利于增加其市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。研究表明，稻米的香味性狀主要由水稻第8染色體上的甜菜堿醛脫氫酶（Betaine Aldehyde Dehydrogenase，OSBadh2）控制。該基因失活使芳香物質(zhì)2-乙?；?1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2AP）在稻米中大量積累，產(chǎn)生香味。本次實(shí)驗(yàn)使用了最近幾年新興的定點(diǎn)基因敲除技術(shù)CRISP/CAS9，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因敲除技術(shù)來(lái)對(duì)北方粳稻品系YN6進(jìn)行改良，通過(guò)敲除YN6水稻基因組中OSBadh2基因，改良基

2、因香味品質(zhì)。具體操作結(jié)果如下：1 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中實(shí)現(xiàn)了對(duì)具有定點(diǎn)敲除功能的CRISP/CAS9載體的構(gòu)建；2轉(zhuǎn)化CRISP/CAS9載體，獲得了1000個(gè)獨(dú)立抗性愈傷，從中分化出732個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因植株。3 通過(guò)對(duì)CRISP/CAS9修飾的OSBadh2目標(biāo)位點(diǎn)處的序列進(jìn)行測(cè)序分析，從中獲得了兩株發(fā)生了基因編輯。目標(biāo)基因經(jīng)修飾后產(chǎn)生了移碼突變，經(jīng)加代純合后，產(chǎn)生了香味表型。關(guān)鍵詞香味基因；CRISP/CAS9；定點(diǎn)突變技術(shù)；轉(zhuǎn)基因AbstractFragrance is one of the most significant rice qualities. Improvement of rice

3、fragrance quality will undoubtedly enlarge rice marketing value. Rice fragrance was suggested to be controlled by a betaine aldehyde dehydrogenase (OsBadh2) gene，which is located in rice chromosome 8. The disfunction of this gene will lead to massive production of an aromatic compound 2-acetyl-1-pyr

4、roline (2AP) in rice，which consequently generate rice fragrance phenotype.This study applied a recently developed gene-editing technology，which is mediated by a transcription activator-like effector nuclease (CRISP/CAS9）and is，in result，capable of modifying the target gene. Through CRISP/CAS9 techno

5、logy，we successfully disenable the OsBadh2 gene in an elite japonica variety YN6，strongly adding the material the rice fragrance. The main results were concluded as follows:1.A functional CRISP/CAS9 vectors was established.2.Through transformation of CRISP/CAS9 via Agrobacterium mediated genetic tra

6、nsformation，we obtained 1000 independent hygromacin-resistant calli，and among them，732 independent transgenic plants were differentiated. 3.Through analysis by sequencing the CRISP/CAS9 aimed site in the target gene OsBadh2，we identified 2 plants，in which several bases were occurred deletion，leading

7、 to gene frame shift mutation. The homologous lines were able to produce readily perceivable fragrance.Key wordsFragrance gene; CRISP/CAS9;gene editing technology; genetically modified III目錄摘要IAbstractII1. 前言11.1香稻米的定義及我過(guò)香稻米的現(xiàn)狀11.2 水稻香味的研究進(jìn)展11.2.1 水稻香味的形成機(jī)制11.2.2香味的鑒定方法21.3 CRISP/CAS9技術(shù)原理21.4實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙饬x

8、32. 材料與方法42.1材料42.1.1材料42.1.2轉(zhuǎn)化相關(guān)試劑52.1.3 PCR鑒定分析所用試劑52.1.4試驗(yàn)引物62.2試驗(yàn)相關(guān)儀器62.3方法72.3.1水稻轉(zhuǎn)化體系建立與再生轉(zhuǎn)基因苗的建立72.3.2轉(zhuǎn)基因苗子鑒定分析82.3.3水稻香味的鑒定方法93. 結(jié)果與分析93.1 YN6香味基因的序列分析93.2載體的構(gòu)建及分析94. 討論114.1選擇CRISP/CAS技術(shù)構(gòu)建載體114.2基因定點(diǎn)編輯技術(shù)124.3實(shí)驗(yàn)展望13結(jié)論14參考文獻(xiàn)15致謝171. 前言水稻是世界上許多國(guó)家重要的糧食作物。隨著人們經(jīng)濟(jì)生活的水平的提高，稻米的食用口感越來(lái)越受到關(guān)注。香米在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上倍

9、受消費(fèi)者的追捧，具有非常良好的市場(chǎng)效益，這使對(duì)水稻香味的研究有了重大意義，包括對(duì)控制香味的基因，遺傳特性和香味的鑒別。1.1香稻米的定義及我過(guò)香稻米的現(xiàn)狀我國(guó)是稻作歷史最悠久、水稻遺傳資源最豐富的國(guó)家之一，浙江河姆渡、湖南羅家角、河南賈湖出土的炭化稻谷證實(shí)，中國(guó)的稻作栽培至少已有7000年以上的歷史。我國(guó)科學(xué)家在矮化育種、雜種優(yōu)勢(shì)利用的雜交水稻、超級(jí)稻育種、水稻生物技術(shù)研究等方面，均走在世界的前列1。根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) ( 香稻NY / T596-2002)，對(duì)香稻米的定義是:自身含有香味物質(zhì)，其香味強(qiáng)度超過(guò)人對(duì)香味的識(shí)別閾，在蒸煮或生熟品嘗過(guò)程中，能夠逸出或散發(fā)令人敏感香味的稻

10、米。世界上各水稻生產(chǎn)國(guó)均有香稻種植，其普遍分布在東南亞和南亞地區(qū)，主要在印度、巴基斯坦、中國(guó)臺(tái)灣、孟加拉國(guó)、阿富汗、伊朗、中國(guó)和美國(guó)等地。國(guó)際市場(chǎng)上著名的香米品種主要有巴基斯坦的Basmati種群、泰國(guó) Khao Dawk Mai1105、Jasmine、RD6、Siamati等。中國(guó)的香稻資源也很豐富，如陜西的洋縣香米、湖南的江永香米、山東的曲阜香米、福建的過(guò)山香米等2。1.2 水稻香味的研究進(jìn)展1.2.1 水稻香味的形成機(jī)制許多研究人員對(duì)香米的成分進(jìn)行分析，被檢測(cè)出來(lái)且具有揮發(fā)性的物質(zhì)有上百種，但是經(jīng)過(guò)眾多學(xué)者的研究，控制香米香味的主要物質(zhì)是2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-py

11、rrolin，2AP）3。但是對(duì)于香米香味的遺傳方式，各個(gè)研究人員產(chǎn)生了分歧4。對(duì)于香味遺傳所產(chǎn)生的分歧，主要是因?yàn)閷?duì)香味不能進(jìn)行一個(gè)定量的分析，各個(gè)研究人員的對(duì)香味的評(píng)判方式并不一致，而且對(duì)香味定量也有一定的難度。盡管有這些分歧，研究者們還是得到了一個(gè)被眾人認(rèn)可的結(jié)論，即水稻香味是受隱性單基因遺傳控制5。1.2.2香味的鑒定方法對(duì)于香味的鑒定，有五種方法。熱水法是將研磨后的稻粒放入試管中加熱，通過(guò)嗅其產(chǎn)生的味道來(lái)鑒別是否有香味。但這種方法存在風(fēng)險(xiǎn)，有可能會(huì)因?yàn)槠渌镔|(zhì)的揮發(fā)產(chǎn)生干擾。故目前大多數(shù)研究者很少使用這種方法。咀嚼法是一個(gè)常用的香味鑒別方法。即通過(guò)咀嚼稻米粒直觀的鑒別是否產(chǎn)生了香味6

12、。蒸煮法是將水稻煮熟成為米飯，來(lái)鑒別香味是否產(chǎn)生。氫氧化鉀浸泡法實(shí)驗(yàn)室中較為常用，其鑒別結(jié)果比較準(zhǔn)確，不易被其他物質(zhì)干擾，其原理是因?yàn)镵OH可以與香稻的香味產(chǎn)生物質(zhì)2-乙酰-1-吡咯啉特異性結(jié)合，且不能與稻米里其他物質(zhì)反應(yīng)。以上四種方法事項(xiàng)未鑒定的定性檢測(cè)方法。其中KOH浸泡法最為實(shí)用，結(jié)果也很準(zhǔn)確。另外三種方法比較簡(jiǎn)便，但不夠準(zhǔn)確。因?yàn)槊總€(gè)人的味覺(jué)嗅覺(jué)有差異。會(huì)使實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。第五種方法是一種較為準(zhǔn)確的定量分析法，氣-質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)法有很多的有點(diǎn)，其結(jié)果準(zhǔn)確，是目前鑒別香味的最準(zhǔn)確的方法之一。主要的方法是先將稻米研碎，用溶液溶解。再用蒸餾法將提取出的稻米主要物質(zhì)蒸餾，使主要物質(zhì)變成氣

13、體，再將氣體注入氣相色譜儀進(jìn)行分析，最后再用質(zhì)譜法定性牌7。1.3 CRISP/CAS9技術(shù)原理基因組編輯技術(shù)是一種新興的一種對(duì)基因組進(jìn)行準(zhǔn)確修飾的技術(shù)，它能在基因組上進(jìn)行定點(diǎn)突變、插入或刪除、基因置換、在兩位點(diǎn)或多位點(diǎn)同時(shí)定點(diǎn)突變或小片段缺失等操作，已經(jīng)成為目前發(fā)育生物學(xué)中的重要工具8。該技術(shù)可以用于系統(tǒng)地研究基因、調(diào)控元件在特定生理或發(fā)育過(guò)程中所起到的作用，或者用于作物性狀的定向改良9。CRISPR/CAS 系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)非常簡(jiǎn)單，是CRISPR位點(diǎn)附近410個(gè)編碼CAS蛋白的基因連接組成10。CRISPR位點(diǎn)由同向保守重復(fù)序列(directed repeats)、間隔序列(spacers)和

14、5端的前導(dǎo)序列(leader sequence)排列組成11。其中，間隔序列來(lái)源于外源基因片段即原間隔序列(protospacers)，重復(fù)序列與間隔序列排列，可以擁有2100個(gè)重復(fù)12。 CRISPR序列基因被轉(zhuǎn)錄為pre- crRNA(precursor CRISPR RNA)，然后被剪切為較短的CRISPR RNAs (crRNAs)，指導(dǎo)Cas蛋白的識(shí)別與降解13。Cas基因則主要編碼切割、修飾核酸相關(guān)的蛋白14。在進(jìn)行基因組編輯時(shí)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要起兩個(gè)作用15：一是與RNA相結(jié)合，這個(gè)作用在識(shí)別序列的過(guò)程中起決定性作用；另一個(gè)是間隔序列(protospacer adj

15、acent motif，PAM)也參與識(shí)別靶序列16。PAM序列是有物種特異性的，不同細(xì)菌中序列不同17。目前在基因組編輯中，應(yīng)用最廣泛的是Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)，它的PAM序列是5-NGG-318。自 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)被開(kāi)發(fā)為基因組編輯工具后，很快就成功應(yīng)用于各種動(dòng)物和微生物等多個(gè)物種中19。但直到2013年，中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞實(shí)驗(yàn)室才首次將該技術(shù)應(yīng)用到水稻、小麥中，證明了CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠應(yīng)用于植物基因組編輯中20。1.4實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙饬x本研究所用水稻材料為北方優(yōu)良粳稻品系YN6。YN6米粒與北方其

16、它普通粳稻相比，抗冷與抗病性強(qiáng)、生育期短但結(jié)實(shí)率好，粒長(zhǎng)且米飯口感好。與黑龍江省的優(yōu)質(zhì)香米稻花香2號(hào)相比，YN6不易倒伏，適種性廣， 但不具有香味。本研究利用CRISP/CAS9基因定點(diǎn)編輯技術(shù)，定向敲除失活YN6的OsBadh2基因，使YN6產(chǎn)生香味表型。香稻是一種各個(gè)器官均能散發(fā)香味的特殊水稻品種，香稻的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量很高，含有大量的氨基酸和蛋白質(zhì)，受到了各國(guó)人民的追捧。香稻具有良好的口干，清新的香味，豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是各種水稻中的珍品，其歷史大約已有2000年21。眾所周知，中國(guó)是世界第一水稻生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，擁有豐富多樣香稻品種，但出口型優(yōu)質(zhì)香稻品種廖廖無(wú)幾，占領(lǐng)國(guó)際香米市場(chǎng)一席之地的中國(guó)

17、香米幾乎為零，搶占國(guó)際香米交易市場(chǎng)的主要是印度Basmati香 米品系、泰國(guó)KDML105、中國(guó)臺(tái)灣Jasmine。加強(qiáng)中國(guó)香稻育種研究工作，提升中國(guó)香米生產(chǎn)水平和出口競(jìng)爭(zhēng)水平，是當(dāng)前中國(guó)稻作科研的迫切任務(wù)22。2. 材料與方法2.1材料2.1.1材料本研究所用水稻材料為黑龍江省粳稻品種YN6。YN6米粒與北方其它普通粳稻相比，抗冷與抗病性強(qiáng)、生育期短但結(jié)實(shí)率好，粒長(zhǎng)（如圖2-1）且米飯口感好。與黑龍江省的優(yōu)質(zhì)香米稻花香2號(hào)相比，YN6不易倒伏，適種性廣， 但不具有香味。稻花香2號(hào)YN6圖2-1 稻花香與YN6生育期與粒型比較Figure 2-1 The comparisons of two

18、traits between Daohuaxiang and YN62.1.2轉(zhuǎn)化相關(guān)試劑農(nóng)桿菌EHA105菌種，由本實(shí)驗(yàn)室提供。實(shí)驗(yàn)中所用的誘導(dǎo)、繼代、選擇、分化和生根培養(yǎng)基的組成，見(jiàn)表3-1表3-1水稻再生及轉(zhuǎn)化體系用到的培養(yǎng)基Table 2-1 The medium of rice regeneration and transformation system2.1.3 PCR鑒定分析所用試劑CTAB 緩沖液、TE 緩沖液、氯仿/異戊醇（V:V=24:1），70%乙醇，無(wú)水乙醇，異丙醇、RNA 酶、蒸餾水、液氮、5TBE 母液、10TBE 母液、10過(guò)硫酸胺 (APS)、6%聚丙烯酰胺膠儲(chǔ)

19、存液、Loading Buffer 溶液、2%剝離硅烷、0.5%親和硅烷、固定液（冰醋酸 100mL 加蒸餾水至 1000mL）、銀染液（1 gAgNO3+1.5 mL 37%甲醛+1 LH2O）；顯影液（1L 30g/L Na2CO3+1.5 mL 37%甲醛+200L 10 mg/ml 硫代硫酸鈉）。2.1.4試驗(yàn)引物由于利用CRISPR/CAS9技術(shù)敲除水稻OsBadh2基因，當(dāng)載體導(dǎo)入細(xì)胞體內(nèi)所結(jié)合的位點(diǎn)有多個(gè)。為了防止誤差，我們需對(duì)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，鑒定CRISPR/CAS9鑒定體中的T-DNA轉(zhuǎn)移整合到待改良水稻品系YN6中。此處我們利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)方法進(jìn)行鑒定，所用引物

20、為Ubiq1/Ubiq2。第二步對(duì)轉(zhuǎn)基因的編輯作用位點(diǎn)進(jìn)行PCR鑒定分析和測(cè)序分析，所用引物為T(mén)ALfr F/TALfr R。引物均由上海生工有限公司合成，具體序列參見(jiàn)表2-1。表2-1 用于篩選和鑒定轉(zhuǎn)基因和基因編輯事件的引物序列Table 2-1 The primer sequences for screening and identification of the transgenic and gene-editing events.引物名稱(chēng)引物序列(53)TALfr FTALfr RUbiq1Ubiq25-ACACAGCAATCTTTCCTGAAC-35-TGAAATACCAAGGTG

21、TGATC-35- GTAACCTCGGATTCAGC-35-GTCAATCTAGCCTAATCTGTC-32.2試驗(yàn)相關(guān)儀器實(shí)驗(yàn)中所使用的儀器和設(shè)備均由黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供如表2-2。表2-2 實(shí)驗(yàn)所用儀器Table 2-2 Laboratory instruments2.3方法2.3.1水稻轉(zhuǎn)化體系建立與再生轉(zhuǎn)基因苗的建立將種子去殼浸泡在濃度為65%的乙醇溶液中20s，取出后吸干水分，放入升汞溶液中，20分鐘后沖洗掉升汞。將洗干凈的種子吸干水分，放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，等待種子發(fā)芽。兩周后長(zhǎng)出愈傷組織，但生長(zhǎng)出的愈傷組織很不規(guī)則，則需要進(jìn)行兩次約為20個(gè)小時(shí)的繼代培養(yǎng)，便可以長(zhǎng)出微黃色的形

22、狀規(guī)則的胚性愈傷組織。此時(shí)先后放入預(yù)分化培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別為14天和20天，此時(shí)會(huì)生長(zhǎng)出分化的幼苗。統(tǒng)計(jì)各個(gè)品種愈傷組織中誘導(dǎo)和分化的比例。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化體系如下：1）菌液準(zhǔn)備：將帶有CRISPR/CAS9載體的EHA105農(nóng)桿菌制成菌懸液，進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)♂屚瓿珊笸坎甲嫫桨迳?，培養(yǎng)一段時(shí)間，挑取菌落在新培養(yǎng)基上培養(yǎng)，放置備用。2）植物體備用：取植株的愈傷組織，切成1cm的小塊。取用時(shí)要輕拿輕放，防止愈傷組織有破損。 3）滅菌和培養(yǎng)：將培養(yǎng)基放入0.103MPa、121、20min高壓蒸汽滅菌。將愈傷組織放入滅菌好的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。經(jīng)常觀察植株生長(zhǎng)情況，期間如果植株不生長(zhǎng)要更換

23、培養(yǎng)基。每天記錄生長(zhǎng)情況 4）篩選和檢測(cè)：分別取被侵染培養(yǎng)3天的愈傷組織和滅菌7天的水稻愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有25mg/L的潮霉素篩選培養(yǎng)基上，用篩選培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，平均每?jī)芍芤淮?。培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)有部分愈傷組織死亡，選取存活部分培養(yǎng)1-2次，培養(yǎng)完成后放入分化培養(yǎng)基中分化培養(yǎng)，大約15-20天左右即可分化出淡黃色的幼苗，再將幼苗小心放入生根培養(yǎng)基培養(yǎng)20天獲得植株。再用PCR技術(shù)測(cè)其序列，確認(rèn)基因是否重組。統(tǒng)計(jì)各個(gè)表型的植株的數(shù)量，并選出表型最佳的植株。2.3.2轉(zhuǎn)基因苗子鑒定分析按 Edwards et al(1991)且稍有改進(jìn)的 CTAB 法提取轉(zhuǎn)基因材料的 DNA。用PCR法進(jìn)行分子鑒定。P

24、CR 反應(yīng)體系采用 10L 體系：包括20 ng/l DNA 1.00L，10PCR buffer（含 Mg2+）1.00L，10 mmol/L dNTP 0.75L，2mol/L Primer 1.00L，5 U/L Taq DNA polymerase 0.25 L，最后加 ddH2O 6.00L。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4預(yù)變性 5 min，55-65（根據(jù)不同反應(yīng)）退火 30 s，72延伸 1 min 后回到 95變性 30 s，共循環(huán) 37 次左右；然后 72 延伸 10 min，待溫度降至 10以下，取出用于電泳。采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定轉(zhuǎn)基因事件；用6%的聚丙烯酰胺 (Acrilamid

25、e) 凝膠電泳和銀染法檢測(cè)目標(biāo)基因編輯事件，聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳和染色方法按Panaud et al.1996描述的方法進(jìn)行。2.3.3水稻香味的鑒定方法采用1.7% KOH浸泡法和咀嚼法兩種方法來(lái)驗(yàn)證鑒定改良水稻植株的香味。(1) 1.7% KOH浸泡法鑒定香味：將水稻葉片剪成1cm左右置于10mL試管中，倒入約8mL 1.7% KOH溶液浸泡，同時(shí)蓋緊管口，10min后打開(kāi)管口，即可辨別出是否有香氣逸出。(2) 咀嚼法鑒定香味：取1粒米于口中，仔細(xì)咀嚼品嘗，用鼻子吸一口氣，然后呼氣，即可辨別出是否有香氣呼出。此方法需要反復(fù)試驗(yàn)，一般連續(xù)2-3次咀嚼即可完成一個(gè)樣品的鑒定，檢驗(yàn)第二個(gè)樣品前

26、須漱口。3. 結(jié)果與分析3.1 YN6香味基因的序列分析我們首先比較了水稻YN6和稻花香2號(hào)香味基因自起始密碼子上游3kb處到終止密碼子間的基因序列，確定了YN6的香味基因Badh2基因與稻花香品種在DNA序列第7外顯子上存在序列差異，其余序列部分兩者之間完全一致。序列差異情況與文獻(xiàn)報(bào)道情況一致，如圖3.1A所示，其中稻花香在OsBadh2第7外顯子存在短序列缺失，造成移碼突變。據(jù)此，我們認(rèn)為，通過(guò)失活YN6的OsBadh2基因，將可能改良該品種的香味品質(zhì)。3.2載體的構(gòu)建及分析根據(jù)上述的序列分析，我們?cè)赮N6的OsBadh2基因第2外顯子處選取了一段序列作為CRISPR/CAS9酶識(shí)別和編輯

27、位點(diǎn)，如圖3.1B所示。CRISPR/CAS9識(shí)別序列為：L-arm: GCTGGATGCTTTGAGT A構(gòu)建識(shí)別目標(biāo)編輯位點(diǎn)的左側(cè)序列的CRISPR/CAS9載體 (L-CRISPR/CAS9 vector)，其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列設(shè)計(jì)如下:L-sequence: 圖3.1 YN6香味基因序列分析及轉(zhuǎn)化CRISPR/CAS9載體的構(gòu)建Figure 3.1 The sequence analysis of fragrance gene in YN6 and the schedule of transform-CRISPR/CAS9 vector constructionCRISPR/CAS9識(shí)別

28、序列為：R-arm：GCCTTTTGTCCAAGGA T構(gòu)建識(shí)別目標(biāo)編輯位點(diǎn)的右側(cè)序列的CRISPR/CAS9載體 (R-CRISPR/CAS9 vector)，其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列設(shè)計(jì)如下:R-sequence: 上述識(shí)別目標(biāo)編輯位點(diǎn)的左右兩側(cè)序列的CRISPR/CAS9載體示意圖如圖3.1 b，c對(duì)上述的構(gòu)建好的轉(zhuǎn)化CRISPR/CAS9載體進(jìn)行SacI，出現(xiàn)預(yù)期的兩條帶，大小分別為包含R-sequence的4kb片段和轉(zhuǎn)化CRISPR/CAS9栽體的其它序列12kb（如圖3.1d）。對(duì)上述兩片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收純化，并進(jìn)行測(cè)序分析，與預(yù)期的結(jié)果完全一致，表明轉(zhuǎn)化CRISPR/CAS9

29、載體構(gòu)建成功。4. 討論4.1選擇CRISP/CAS技術(shù)構(gòu)建載體和傳統(tǒng)的誘變技術(shù)相比較，基因定點(diǎn)編輯技術(shù)完全可以按照我們的意愿去對(duì)任意位點(diǎn)進(jìn)行誘變。另外，修飾后的基因會(huì)隨染色體DNA復(fù)制而進(jìn)行復(fù)制，進(jìn)而進(jìn)行遺傳，這也有便于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)與觀察研究。近年來(lái)CRISP/CAS技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)得以迅速發(fā)展，CRISP/CAS技術(shù)由于其簡(jiǎn)單的技術(shù)原理和實(shí)驗(yàn)操作等優(yōu)點(diǎn)，這個(gè)技術(shù)對(duì)細(xì)胞的要求不是那么嚴(yán)格，所以可以應(yīng)用到各種物種和所有的體外培養(yǎng)的細(xì)胞。這一技術(shù)是目前應(yīng)用最廣，效率較高，最具有實(shí)踐應(yīng)用前景的基因打靶技術(shù)。在糧食作物和各種經(jīng)濟(jì)物種中，利用CRISP/CAS可以人為的改變?nèi)我庑誀?，從而培育出我?/p>

30、所需要的，含有各種好性狀的超級(jí)植物。同時(shí)，CRISP/CAS技術(shù)也可以應(yīng)用到醫(yī)學(xué)研究方面，建立突變體庫(kù)，為人類(lèi)的疾病是如何發(fā)生的以及怎樣發(fā)展的提供依據(jù)。但是，這一技術(shù)仍然存在缺點(diǎn)，它會(huì)引起細(xì)胞的兩種修復(fù)機(jī)制，從而也會(huì)發(fā)生一些有違我們意愿的突變，另外，也會(huì)出現(xiàn)概率極少的不能識(shí)別目標(biāo)基因位點(diǎn)的現(xiàn)象。但是，這一技術(shù)仍然具有巨大潛力，我們有理由相信，隨著科技的發(fā)展，這一技術(shù)必將會(huì)對(duì)科學(xué)界做出巨大的貢獻(xiàn)。實(shí)驗(yàn)有待進(jìn)一步改進(jìn)。最主要的是先保證選取的CRISP/CAS識(shí)別區(qū)域和載體的剪切的高效性。我們可以嘗試不同濃度的菌懸液優(yōu)化實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)中的每個(gè)方法及步驟，從而增加陽(yáng)性植株的轉(zhuǎn)化效率。進(jìn)而能夠得到足夠多的陽(yáng)性

31、植株，在保證陽(yáng)性植株數(shù)量的前提下再進(jìn)一步篩選出我們想要的定向編輯植株。4.2基因定點(diǎn)編輯技術(shù)在目前看來(lái)，要想在各種高等植物中采用這個(gè)技術(shù)獲得不菲成就，我們還要克服許多的問(wèn)題。近年來(lái)，科學(xué)家們通過(guò)多種途徑不懈努力和探索，已經(jīng)取得了一些令人振奮的結(jié)果。一個(gè)具有參考價(jià)值的實(shí)驗(yàn)為我們積攢了十分重要的數(shù)據(jù)和技術(shù)。就是借鑒大馬哈魚(yú)的基因打靶的成功經(jīng)驗(yàn)，并且成功篩選出最初我們?cè)O(shè)計(jì)想要得到的突變體，從而最終達(dá)到基因的定點(diǎn)編輯目的。這一實(shí)驗(yàn)也為植物基因組的定點(diǎn)敲除，基因敲入和堿基的定點(diǎn)置換提供了巨大的參考意義。并且這一技術(shù)是目前最有利用價(jià)值的植物基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)。因?yàn)榇蠖鄶?shù)基因功能的改變是由基因內(nèi)部某一個(gè)或者

32、某幾個(gè)堿基的突變而引起的，所以利用寡核苷酸介導(dǎo)基因的單堿基突變?cè)谥参镉N中具有十分重要的理論和實(shí)踐利用價(jià)值。但是這一技術(shù)的修復(fù)的效率不穩(wěn)定和后期的篩選困難等缺陷大大的限制了該技術(shù)的發(fā)展與使用。在實(shí)驗(yàn)操作中我們還可以調(diào)節(jié)和控制基因遺傳過(guò)程中的相關(guān)路徑，如對(duì)相關(guān)中間代謝產(chǎn)物和相關(guān)酶進(jìn)行改良，從而最終達(dá)到高效率的基因打靶目的。但是，我們也不得不考慮到事情的反方面，也就是這一技術(shù)也有可能對(duì)目標(biāo)基因以外的其他有益基因進(jìn)行修飾更改，從而造成一些優(yōu)良性狀的退化。綜上所述，要想根據(jù)人們的意愿將一些植物的某些基因進(jìn)行定點(diǎn)修飾、將兩種或多種有益基因進(jìn)行結(jié)合，將不益于植株生長(zhǎng)的基因替換掉，這些基因的定點(diǎn)編輯技術(shù)依然

33、存在著我們預(yù)想不到的困難?？傊覀兛梢酝ㄟ^(guò)各種各樣的生物學(xué)理論的結(jié)合和生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)的合作，相信在未來(lái)，這個(gè)技術(shù)一定可以為我國(guó)的水稻育種提供不錯(cuò)的作用。4.3實(shí)驗(yàn)展望鑒于已成功獲得了YN6的Badh2基因獲得了定點(diǎn)敲除的植株，并且已經(jīng)證實(shí)產(chǎn)生了香味，再接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中我們會(huì)對(duì)獲得的植株進(jìn)行檢測(cè)，觀察其內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并且檢測(cè)是否含有其他有害物質(zhì)。檢測(cè)完成后應(yīng)用孟德?tīng)栠z傳定律多培養(yǎng)幾代，計(jì)算出有香味表型的植株的遺傳概率，尋求一定的方法，找出能讓香味基因穩(wěn)定遺傳的親本組合。相信通過(guò)CRISP/CAS9技術(shù)不僅可以改良水稻的香味基因，還可以改良水稻的抗冷、抗病、抗旱等基因，來(lái)獲得生存穩(wěn)定易活的，產(chǎn)量高的

34、，高品質(zhì)的優(yōu)良水稻。結(jié)論根據(jù)水稻香味基因Badh2的表達(dá)機(jī)理，本試驗(yàn)選取了Badh2基因的第七外顯子一段序列作為CRISP/CAS9的識(shí)別和切割作用位點(diǎn)，運(yùn)用酶切酶連方法將兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)成功地連接到了CRISP/CAS9骨架上，并將這對(duì)CRISP/CAS9骨架連接到表達(dá)載體上，最后成功的將這一表達(dá)載體運(yùn)用電轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)入到了農(nóng)桿菌中，經(jīng)PCR檢測(cè)，測(cè)序檢測(cè)挑選連接完全正確的載體待用。利用實(shí)驗(yàn)室的組織培養(yǎng)條件，無(wú)菌操作技術(shù)。經(jīng)過(guò)前期的水稻愈傷細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，愈傷組織的侵染及清洗，最后成功的篩選出抗性愈傷組織并將其分化成苗，經(jīng)過(guò)大田的栽培及田間的成功管理收獲種子。經(jīng)過(guò)PCR鑒定、尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳

35、鑒定、目標(biāo)區(qū)域的基因組測(cè)序分析、KOH浸泡法和咀嚼法鑒定。成功篩選出了具有怡人香味的水稻品種。經(jīng)過(guò)測(cè)序分析YN6的Badh2基因發(fā)生了8個(gè)堿基的缺失，另一株發(fā)生了4個(gè)堿基的缺失和2個(gè)堿基的置換。從而使YN6水稻品種本身存在的Badh2基因發(fā)生了功能的缺失。使原本不具有香味的YN6品種獲得了香味表型。參考文獻(xiàn)1虞國(guó)平，朱鴻英.我國(guó)水稻生產(chǎn)現(xiàn)狀及發(fā)展對(duì)策研究J.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009(06):122-126+130.2楊揚(yáng)，謝震澤，王軻，晏月明.水稻香味的遺傳研究進(jìn)展J.首都師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2010，31(03):24-29.3Cooked rice aroma and 2-acety

36、l-1-pyrroline. Buttery R G，Ling L C，Juliano B O，et al. Journal of Agriculture . 19834 Genetic analysis of aroma in rice landrace. Tomar J B，Prassad S C. Oryza . 19975唐傲，邵高能，胡培松.水稻香味基因的研究進(jìn)展J.中國(guó)稻米，2009(04):1-4.6程式華，胡培松.中國(guó)水稻科技發(fā)展戰(zhàn)略J.中國(guó)水稻科學(xué)，2008(03):223-226.7林作敏. 弱極性香味成分提取及液質(zhì)聯(lián)用分析方法研究D.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)，2017.8單奇?zhèn)ィ?/p>

37、高彩霞.植物基因組編輯及衍生技術(shù)最新研究進(jìn)展J.遺傳，2015，37(10):953-973.9鄭小梅，張曉立，于建東，鄭平，孫際賓.CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)的研究進(jìn)展J.生物技術(shù)進(jìn)展，2015，5(01):1-9+78-79.10Cas9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Mali P，Aach J，Stranges P B，et al. Nature Biotechnology

38、 . 201311Multiplex and homologous recombinationmediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Li JF，Norville JE，Aach J，McCormack M，Zhang DN，Bush J，Church GM，Sheen J. Nature Biotechnology . 2013 12景潤(rùn)春，盧洪.CRISPR/Cas9基因組定向編輯技術(shù)的發(fā)展與在作物遺傳育種中的應(yīng)用J.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，49(0

39、7):1219-1229.13馬興亮，劉耀光.植物CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)與突變分析J.遺傳，2016，38(02):118-125.14曾秀英，侯學(xué)文.CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)在植物基因功能研究及植物改良中的應(yīng)用J.植物生理學(xué)報(bào)，2015，51(09):1351-1358.15趙海衛(wèi)，呂欣，尹文.CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向基因組編輯的新策略J.中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2015，10(03):281-284.16解莉楠，宋鳳艷，張旸.CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物基因組定點(diǎn)編輯中的研究進(jìn)展J.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48(09):1669-1677.17李聰，曹文廣.

40、CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展J.生物工程學(xué)報(bào)，2015，31(11):1531-1542.18劉志國(guó).CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)基因組編輯的研究進(jìn)展J.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，45(10):1567-1583.19方銳，暢飛，孫照霖，李寧，孟慶勇.CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)J.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2013，40(08):691-702.20 平文麗，李雪君，林娟，丁燕芳，孫煥，孫計(jì)平.CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)及其在作物品種改良中的應(yīng)用J.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2016，32(05):16-22.21張濤，鄭家奎，徐建第，蔣開(kāi)鋒，吳先軍，

41、汪旭東.香稻品種的遺傳多樣性研究J.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008(03):625-635.22林光.香稻的發(fā)展現(xiàn)狀與研究進(jìn)展J.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25(08):164-168.16致謝在整整的大學(xué)四年中，我在黑龍江大學(xué)中經(jīng)歷了豐富多彩的四年，在生活中，輔導(dǎo)員老師、同學(xué)、室友都給予了我很大的幫助，作為一個(gè)之前從未單獨(dú)生活的學(xué)生，有了他們的存在，讓我很快適應(yīng)獨(dú)立的生活，讓我學(xué)會(huì)了處世原則，學(xué)會(huì)了獨(dú)立自主，學(xué)會(huì)了做人做事的道理。在學(xué)習(xí)中，我系統(tǒng)地學(xué)習(xí)了生物方面的知識(shí)，從宏觀到微觀，從理論到實(shí)踐。經(jīng)過(guò)老師的教導(dǎo)，我對(duì)生物知識(shí)產(chǎn)生了濃厚的興趣，我學(xué)會(huì)了專(zhuān)業(yè)的生物知識(shí)，并且培養(yǎng)了我的動(dòng)手能力，對(duì)我未來(lái)的生活有深遠(yuǎn)的影響。在本次論文的創(chuàng)作過(guò)程中，我的導(dǎo)師姜老師給予了我很大的幫助，從論文題目講解，到實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的幫助，到文章結(jié)構(gòu)、文章格式的指導(dǎo)。姜老師都認(rèn)真負(fù)責(zé)，使我的論文寫(xiě)作較為順利。在此，我要感謝的輔導(dǎo)員，我的同學(xué)，我的室友，是他們讓我的大學(xué)生活不會(huì)感到孤單。我要感謝我的老師，我的導(dǎo)師姜老師，是他們讓我學(xué)會(huì)了知識(shí)，讓我充實(shí)的度過(guò)了大學(xué)生活，讓我學(xué)會(huì)了知識(shí)，有了一技之長(zhǎng)。最后我要感謝黑龍江大學(xué)給了我學(xué)習(xí)的平臺(tái)，能讓我遇到這些幫助過(guò)我的人。讓我步入社會(huì)開(kāi)始一段嶄新的人生！17