《生物化學實驗》ppt.ppt

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生物化學實驗 生物化學實驗內(nèi)容 1 醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)2 雙縮脲測定蛋白質(zhì)的含量3 血液葡萄糖的測定4 牛乳酪蛋白提取與鑒定5 維生素C的提取與含量的測定6 琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制7 酶的基本性質(zhì)要求 課前預習 試驗中做記錄 課后寫實驗報告 兩人一組 離開實驗室時簽字 實驗一血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳 一 目的 了解電泳技術基本原理 掌握醋酸纖維薄膜電泳操作技術 二 原理 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì) 在非等電點狀態(tài)下在電場中會向一定電極移動 在堿性條件下多數(shù)蛋白質(zhì)帶負電荷 在電場中向正極移動 不同蛋白質(zhì)由于大小 所帶電荷及形狀不同 在電場中的遷移率不同 經(jīng)過電泳可將其分開 結果經(jīng)染色 漂洗 得電泳圖譜 材料 血清 pH8 6巴比妥緩沖液濾紙吸去膜上液體醋酸 浸泡 點樣纖維薄膜10min沾血清點在無光澤面上2mA 條膜染色液漂洗液 電泳 染色 漂洗40min5min浸泡漂洗數(shù)次 觀察電泳譜帶 三 步驟 電泳裝置 點樣 實驗二雙縮脲測定蛋白質(zhì)含量 一 實驗目的掌握雙縮脲測定蛋白質(zhì)的方法和原理二 實驗原理雙縮脲在堿性溶液中與Cu2 產(chǎn)生紫色的絡合物 這一反應稱 雙縮脲反應 蛋白質(zhì)分子中肽鍵 也能與Cu2 發(fā)生雙縮脲反應 溶液紫色的深淺與蛋白質(zhì)含量在一定范圍內(nèi)成正比 而與蛋白質(zhì)的氨基酸組成及分子量無關 該紫色的絡合物在580nm處有最大吸收值 三 實驗步驟 1 標準曲線制作 已制好 2 樣品測定 3 結果計算 100 豆粉 g 樣品蛋白質(zhì)含量 標準曲線上查得蛋白質(zhì)含量 g 實驗三血液葡萄糖的測定 一 實驗目的學習和掌握Folin 吳憲法測定血糖的方法二 實驗原理 三 實驗步驟 四 計算 實驗四牛奶中蛋白質(zhì)的提取與鑒定 一 實驗目的學習從牛奶中制備酪蛋白的方法并進行鑒定試驗二 實驗原理蛋白質(zhì)等電點沉淀三 實驗步驟1 酪蛋白的制備 鮮牛乳3Oml 40 3Om醋酸緩沖液 40 邊加邊搖動 離心3000r 5min 冷卻至室溫 繼續(xù)放置5分鐘 清液 乳清 沉淀 加熱觀察現(xiàn)象 醇醚混合物洗2次 沉淀 清液 晾干 鑒定 棄掉 2 酪蛋白的性質(zhì)鑒定 1 溶解度觀察 2 米倫反應 少許酪蛋白 lmlH2O 米倫試劑10滴 振搖 加熱觀察其顏色變化 3 含硫 胱氨酸 半胱氨酸和蛋氨酸 測定 少量酪蛋白 lmlO 1MNaOH 5 醋酸鉛1 3滴 觀察現(xiàn)象 煮沸 實驗五維生素C的定量測定 2 6 二氯酚靛酚滴定法 一 實驗目的掌握滴定法測定Vc含量的原理和操作 二 實驗原理 三 實驗步驟 1 提取 2 0克松針 2份 少量2 草酸勻漿過濾后用2 草酸定容到50毫升 也可先定容后過濾或離心 2 滴定 1 標定染料 標準維生素C液滴定 準確吸取標準維生素C溶液10毫升 含1 0毫克維生素C 置100毫升錐形瓶中 用微量滴定管以0 1 2 6一二氯酚靛酚滴至淡紅色出現(xiàn) 15秒鐘不退色即為滴定終點 記錄所用染料體積計算出1毫升染料相當于多少毫克維生素C K值 即1 染料ml 2 樣液滴定 準確吸取濾液10毫升放人100毫升錐形瓶內(nèi) 滴定方法同前 做兩次平行試驗 記錄染料體積 3 空白液滴定 準確吸取10毫升2 草酸溶液 放入100毫升錐形瓶中 用上述方法滴定至終點 記錄所用染料體積 滴定過程宜迅速 一般不超過2分鐘 X 100克樣品所含維生素C毫克數(shù)W 稱取樣品毫克數(shù)V1 滴定樣品所用染料毫升數(shù)V2 滴定空白所用染料毫升數(shù)V3 樣品測定時所用濾液毫升數(shù) 即10毫升 V 樣品提取液稀釋至總體積 即50毫升 K 1毫升染料所能氧化維生素C之毫克數(shù) 可由標定算出 3 計算 實驗六琥珀酸脫氫酶的作用及其競爭性抑制的觀察 一 實驗目的了解琥珀酸脫氫酶的作用及其競爭性抑制劑對其活性的抑制 二 實驗原理 甲烯白 三 實驗步驟 1 酶的制備豬心1 5 2g 1 15M磷酸氫二鈉溶液3 4ml勻漿1 15M磷酸氫二鈉溶液6 7ml 放置30min2000r min離心10min 取上清備用 加好混勻 立即在各管中加入一層 約8滴 液體石蠟油 置37度恒溫水浴保溫30分 觀察各管顏色變化 分析原因 然后用力振搖1號管 觀察變化記錄并解釋 2 酶促反應 實驗一 溫度 pH及酶的激活劑 抑制劑對酶活性的影響 一 目的 了解酶催化的特異性以及pH 溫度 抑制劑和激活劑對酶活力的影響 二 實驗原理 以唾液淀粉酶為例 觀察溫度 pH 激活劑和抑制劑對其活性的影響 唾液淀粉酶可水解淀粉生成糊精 麥芽糖 葡萄糖等物質(zhì) 淀粉遇碘呈呈藍色 糊精按分子從大到小的順序 遇碘可呈藍色 紫色 暗褐色和紅色 最小的糊精和麥芽糖遇碘不呈現(xiàn)顏色反應 酶具有極高的催化效率 過氧化氫酶比鐵粉的催化效率高出許多倍 三 操作步驟 一 溫度對酶活性的影響 唾液淀粉酶的制備 取漱口水0 5Ml 稀釋至50ml 以下簡稱酶液 1 取3支試管 編號后按下表操作 2 在比色板上 置碘液2滴于各孔中 每隔1分鐘 從第二管中取出反應液1滴與碘混合 觀察顏色變化 3 待第二管中反應液遇碘不發(fā)生顏色變化時 向各管中加入碘液1滴 搖勻 觀察并記錄各管顏色 做出解釋 二 pH對酶活性的影響取試管5支 編號 按下表操作 搖勻 37 水浴中保溫 每隔l分鐘從pH6 8的管中 2號 取出1滴于白瓷板上 加碘液1滴 觀察淀粉水解的程度 待顏色不變時 向各管中加碘液1 3滴 觀察顏色 比較水解程度 做出解釋 三 酶的激活劑 抑制劑對酶活性的影響 氯離子是唾液淀粉酶的激活劑 銅離子是抑制劑 取小試管3支 按表操作 將3支試管放入37 水浴中 在比色板上用碘液檢查第2管 待不變色時向各管中加碘液1滴 記錄顏色并解釋 四 酶的高效性酶具有極高的催化效率 比普通催化劑活性高出很多倍 過氧化氫酶能催化過氧化氫分解為二氧化碳和水 鐵粉也能催化此反應 但二者的催化效率有很大差距 取小試管4支 編號 按下表操作 恒溫水浴鍋 電磁爐水浴鍋 電子天平 需冷藏 冷凍試劑和材料放在冰柜和冰箱 注意 生物材料及試劑在冰箱中 取完放回原處 請勿將固體物質(zhì)扔進水槽 臺面上有垃圾盆 水槽上有蒸餾水管 節(jié)約使用 用過器皿立即用水洗凈 做完實驗清理臺面 將實驗用具清洗后放入洗滌柜 實驗報告 一 目的二 原理 必須寫清楚 三 實驗材料四 實驗步驟五 結果與分析 標出正負極 說明從正極到負極的條帶依次是