《【生物化學(xué)實驗】血清γ球蛋白分離純化與鑒定課件》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《【生物化學(xué)實驗】血清γ球蛋白分離純化與鑒定課件（40頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。
1、 一、一、鹽析法粗分鹽析法粗分-球蛋白球蛋白 二、二、凝膠過濾方法脫鹽凝膠過濾方法脫鹽 三、離子交換層析方法純化三、離子交換層析方法純化-球蛋白球蛋白 四、醋酸纖維素薄膜電泳法鑒定四、醋酸纖維素薄膜電泳法鑒定-球蛋白的純度球蛋白的純度 本實驗本實驗綜合多種實驗技術(shù)和方法，共同完成一個實綜合多種實驗技術(shù)和方法，共同完成一個實驗?zāi)繕?，所以屬于綜合性實驗。驗?zāi)繕?，所以屬于綜合性實驗。 1學(xué)習(xí)了解凝膠層析和離子交換層析分離純化學(xué)習(xí)了解凝膠層析和離子交換層析分離純化 蛋白質(zhì)的基本原理及應(yīng)用蛋白質(zhì)的基本原理及應(yīng)用2掌握醋酸纖維薄膜電泳技術(shù)的原理及應(yīng)用掌握醋酸纖維薄膜電泳技術(shù)的原理及應(yīng)用【基本原理【基本原理
2、】 蛋白質(zhì)的分離、純化及鑒定蛋白質(zhì)的分離、純化及鑒定是研究蛋白質(zhì)化學(xué)是研究蛋白質(zhì)化學(xué)性質(zhì)及生物學(xué)功能的重要手段之一。性質(zhì)及生物學(xué)功能的重要手段之一。 分離純化蛋白質(zhì)的方法分離純化蛋白質(zhì)的方法是利用不同蛋白質(zhì)的某些是利用不同蛋白質(zhì)的某些物理、化學(xué)性質(zhì)的不同而建立的方法，其中有鹽析、物理、化學(xué)性質(zhì)的不同而建立的方法，其中有鹽析、離子交換、凝膠過濾、親和層析、制備電泳、離心等。離子交換、凝膠過濾、親和層析、制備電泳、離心等。在分離純化時，根據(jù)情況選用幾種方法，相互配合才在分離純化時，根據(jù)情況選用幾種方法，相互配合才能達到分離純化一種蛋白質(zhì)的目的。能達到分離純化一種蛋白質(zhì)的目的?！緦嶒炘怼緦嶒炘怼?/p>
3、 本實驗采用硫酸銨鹽析、葡聚糖凝本實驗采用硫酸銨鹽析、葡聚糖凝膠過濾、離子交換層析方法，分離純化膠過濾、離子交換層析方法，分離純化血清血清- -球蛋白。最后用醋酸纖維素薄膜球蛋白。最后用醋酸纖維素薄膜電泳法鑒定電泳法鑒定- -球蛋白的純度。球蛋白的純度。 原理原理 鹽析法鹽析法是根據(jù)不同蛋白質(zhì)在一定濃度的鹽溶是根據(jù)不同蛋白質(zhì)在一定濃度的鹽溶液中溶解度度不同，從而分別析出，達到彼此分液中溶解度度不同，從而分別析出，達到彼此分離的分離方法。離的分離方法。 本實驗在半飽和硫酸銨溶液中，清蛋白溶解，本實驗在半飽和硫酸銨溶液中，清蛋白溶解，球蛋白將沉淀析出，經(jīng)離心所得的沉淀即為球蛋球蛋白將沉淀析出，經(jīng)離
4、心所得的沉淀即為球蛋白的粗提液。白的粗提液。 硫酸銨是蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽硫酸銨是蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽，在，在030范圍內(nèi)溶解度變化不大；范圍內(nèi)溶解度變化不大；25時飽時飽和溶解度為和溶解度為4.1 mol/l，0時飽和溶解度為時飽和溶解度為3.9 mol/l。在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白。在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶都可以析出來。而且硫酸銨價廉易得，質(zhì)和酶都可以析出來。而且硫酸銨價廉易得，分段鹽析效果好，不容易引起蛋白質(zhì)變性。分段鹽析效果好，不容易引起蛋白質(zhì)變性。 硫酸銨分段鹽析硫酸銨分段鹽析：血清：血清1.0 ml，一邊搖一邊，一邊搖一邊緩慢加入飽和硫酸銨緩慢加入飽和硫酸銨1.0
5、 ml，混勻后室溫下，混勻后室溫下靜置靜置10分鐘，分鐘，3000 rpm離心離心10分鐘。用分鐘。用滴管仔細地吸出上清，棄去。沉淀加滴管仔細地吸出上清，棄去。沉淀加0.02 mol/l pH 6.5 磷酸緩沖液磷酸緩沖液4.0 ml溶解，此溶解，此為為球蛋白粗提液球蛋白粗提液，留作進一步純化。，留作進一步純化。 欲去除鹽析法分離得到的球蛋白粗提液中大量欲去除鹽析法分離得到的球蛋白粗提液中大量鹽，通常有鹽，通常有兩種方法兩種方法： 凝膠層析法凝膠層析法 透析透析本試驗本試驗采用葡聚糖凝膠采用葡聚糖凝膠Sephadex G 25層析方層析方法除去球蛋白粗提液中的鹽法除去球蛋白粗提液中的鹽硫酸銨硫
6、酸銨，以便下一步用離以便下一步用離子交換層析方法進一步提純球蛋白。子交換層析方法進一步提純球蛋白。 凝膠凝膠是一類具有三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的干燥顆粒，是一類具有三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的干燥顆粒，凝膠凝膠直徑大于凝膠網(wǎng)孔的直徑大于凝膠網(wǎng)孔的大分子物質(zhì)大分子物質(zhì)不能進入凝膠內(nèi)部，只能不能進入凝膠內(nèi)部，只能沿著凝膠顆粒間的間隙隨流動相向下移動，所以流程短、沿著凝膠顆粒間的間隙隨流動相向下移動，所以流程短、流速快，首先流出層析柱；而流速快，首先流出層析柱；而小分子物質(zhì)小分子物質(zhì)直徑小于凝膠網(wǎng)直徑小于凝膠網(wǎng)孔能自由出入，洗脫時間長，后流出層析柱，經(jīng)過一定時孔能自由出入，洗脫時間長，后流出層析柱，經(jīng)過一定時間間。
7、凝膠層析法又叫凝膠過濾凝膠層析法又叫凝膠過濾。基本原理是用一般的柱層析方?；驹硎怯靡话愕闹鶎游龇椒ㄊ狗肿恿坎煌娜苜|(zhì)通過具有分子篩性質(zhì)的法使分子量不同的溶質(zhì)通過具有分子篩性質(zhì)的固定相固定相從而使物從而使物質(zhì)分離。它利用一些多孔的細珠支持物，這些小孔大小不一，質(zhì)分離。它利用一些多孔的細珠支持物，這些小孔大小不一，可以允許半徑在一定范圍內(nèi)的分子透過它。把經(jīng)過充分溶脹的可以允許半徑在一定范圍內(nèi)的分子透過它。把經(jīng)過充分溶脹的凝膠裝入層析柱中，加入樣品后，由于凝膠的三維空間網(wǎng)狀結(jié)凝膠裝入層析柱中，加入樣品后，由于凝膠的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，構(gòu)，分子量小的物質(zhì)分子量小的物質(zhì)能進入凝膠，流程長，移動速度慢。
8、能進入凝膠，流程長，移動速度慢。分子分子量大的物質(zhì)量大的物質(zhì)則被排阻在交聯(lián)網(wǎng)狀物之外，沿著凝膠顆粒間的孔則被排阻在交聯(lián)網(wǎng)狀物之外，沿著凝膠顆粒間的孔隙隨溶劑流動，其流程短，移動速度快，先流出層析床。經(jīng)過隙隨溶劑流動，其流程短，移動速度快，先流出層析床。經(jīng)過分部收集流出液，分子量不同的物質(zhì)便互相分離。分部收集流出液，分子量不同的物質(zhì)便互相分離。 交聯(lián)度交聯(lián)度網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)網(wǎng)孔徑網(wǎng)孔徑吸水量吸水量機械強度機械強度耐壓力耐壓力大大致密致密小小小小大大高高小小疏松疏松大大大大小小低低應(yīng)用最多的凝膠！應(yīng)用最多的凝膠！1、層析柱保持垂直。、層析柱保持垂直。2、放蒸餾水，排沙芯下空氣，關(guān)閉出口。、放蒸餾水
9、，排沙芯下空氣，關(guān)閉出口。3、加入攪拌均勻的、加入攪拌均勻的SephadexG-50懸液，調(diào)節(jié)流速懸液，調(diào)節(jié)流速10滴滴/min，使凝膠均勻沉降，不斷補充，直至，使凝膠均勻沉降，不斷補充，直至15cm。4、上留、上留12mm的水，關(guān)閉出口。的水，關(guān)閉出口。 注意：注意： 床面上要保持少許水，床面上要保持少許水，防止膠床露出液面防止膠床露出液面。 膠面不平膠面不平，用玻棒輕輕攪動，讓凝膠自然沉降，用玻棒輕輕攪動，讓凝膠自然沉降， 使表面平整。使表面平整。1、加樣：、加樣：用滴管將鹽析后樣品加入柱床面，打開出口使樣品用滴管將鹽析后樣品加入柱床面，打開出口使樣品 溶液滲入凝膠。溶液滲入凝膠。2、洗脫
10、：、洗脫：加入洗脫液，打開出口，保持流速加入洗脫液，打開出口，保持流速10滴滴/min，收，收 集洗脫液，用鈉氏試劑檢測胺。集洗脫液，用鈉氏試劑檢測胺。3、保存：、保存：檢測洗脫液的蛋白質(zhì)量，保存含量高的進一步純化檢測洗脫液的蛋白質(zhì)量，保存含量高的進一步純化 不斷加洗脫液，使銨全部流出，為下次實驗做準備。不斷加洗脫液，使銨全部流出，為下次實驗做準備。 以管號為橫軸，蛋白以管號為橫軸，蛋白質(zhì)含量為縱軸繪制洗脫質(zhì)含量為縱軸繪制洗脫曲線，分析實驗結(jié)果。曲線，分析實驗結(jié)果。 1. 通過使用通過使用進一步進一步 純化純化-球蛋白脫鹽液，得到較純的球蛋白脫鹽液，得到較純的-球蛋白溶液球蛋白溶液 2. 學(xué)習(xí)
11、了解學(xué)習(xí)了解離子交換層析方法的基本原理和應(yīng)用范圍離子交換層析方法的基本原理和應(yīng)用范圍 離子交換層析是一種常用的、通過使用各種類型的離離子交換層析是一種常用的、通過使用各種類型的離子交換劑達到分離純化目的的層析方法。離子交換劑是通子交換劑達到分離純化目的的層析方法。離子交換劑是通過化學(xué)反應(yīng)將帶電基團引入到惰性支持物上形成的固體物過化學(xué)反應(yīng)將帶電基團引入到惰性支持物上形成的固體物質(zhì)，在實驗中作為固定相。如果其帶負電，則能結(jié)合陽離質(zhì)，在實驗中作為固定相。如果其帶負電，則能結(jié)合陽離子，成為陽離子交換劑；如果其帶正電，則能結(jié)合陰離子，子，成為陽離子交換劑；如果其帶正電，則能結(jié)合陰離子，稱為稱為陰離子交換
12、劑陰離子交換劑?？筛鶕?jù)實驗需要，選擇不同的離子交。可根據(jù)實驗需要，選擇不同的離子交換劑進行離子交換層析。換劑進行離子交換層析。 DEAE （二乙基氨基乙基）（二乙基氨基乙基） 纖維素纖維素含有可離子化的含有可離子化的堿基，可與氫離子結(jié)合，成為帶正電荷的陰離子交換劑。堿基，可與氫離子結(jié)合，成為帶正電荷的陰離子交換劑。 離子交換層析的基本原理離子交換層析的基本原理 靠靜電引力結(jié)合在交換劑上的離子，叫做平衡離子靠靜電引力結(jié)合在交換劑上的離子，叫做平衡離子 應(yīng)用離子交換層析時要找到適當?shù)臈l件，使一些化應(yīng)用離子交換層析時要找到適當?shù)臈l件，使一些化合物帶電結(jié)合到交換劑上，而使另一些化合物不結(jié)合到合物帶電結(jié)
13、合到交換劑上，而使另一些化合物不結(jié)合到交換劑上。在本實驗條件下，交換劑上。在本實驗條件下， DEAE纖維素是具有帶纖維素是具有帶多個正電荷游離堿基的聚合物，所以主要靠靜電吸引與多個正電荷游離堿基的聚合物，所以主要靠靜電吸引與帶負電的蛋白質(zhì)形成離子鍵，對蛋白質(zhì)提純有很大好處帶負電的蛋白質(zhì)形成離子鍵，對蛋白質(zhì)提純有很大好處球蛋白球蛋白 血清血清、球蛋白、清蛋白的等電點為：球蛋白、清蛋白的等電點為： 清蛋白清蛋白pI= =4.64， 2球蛋白球蛋白 pI= =5.06， 球蛋白球蛋白pI= =5.12， 球蛋白球蛋白pI= =7.3本實驗采用本實驗采用0.02 mol/l pH6.5 NH4Ac緩沖
14、液進行洗緩沖液進行洗脫。在此脫。在此pH條件下，條件下，DEAE帶正電荷，可與帶負電荷帶正電荷，可與帶負電荷的的、-球蛋白和清蛋白結(jié)合，而帶正電荷的球蛋白和清蛋白結(jié)合，而帶正電荷的-球蛋白球蛋白不與不與DEAE結(jié)合，首先從層析柱中洗脫出來，首先收結(jié)合，首先從層析柱中洗脫出來，首先收集到的既是純化的集到的既是純化的-球蛋白。球蛋白。 將脫鹽后的球蛋白加于將脫鹽后的球蛋白加于DEAE柱上（方法同柱上（方法同凝膠過濾），用凝膠過濾），用0.02 mol/l pH 6.5 NH4Ac緩緩沖液洗脫，流速沖液洗脫，流速10滴滴15滴滴/分，用小試管連分，用小試管連續(xù)收集流出液（約續(xù)收集流出液（約1.5 m
15、l/管），用紫外分光光管），用紫外分光光度計在度計在280 nm下測其吸光度值，收集含量最下測其吸光度值，收集含量最高的部分，濃縮作純度鑒定。用該緩沖液洗脫高的部分，濃縮作純度鑒定。用該緩沖液洗脫下來的是下來的是球蛋白。球蛋白。 利用葡聚糖凝膠富含羥基，吸水，不允許大利用葡聚糖凝膠富含羥基，吸水，不允許大分子蛋白進入微孔的特性，在樣品溶液中加少量分子蛋白進入微孔的特性，在樣品溶液中加少量凝膠，離心，濃縮蛋白。凝膠，離心，濃縮蛋白。 每每mlml純化純化球蛋白溶液加球蛋白溶液加SephadexG25 0.25 gSephadexG25 0.25 g，搖，搖動動2 23 3分鐘，室溫靜止分鐘，室溫
16、靜止2 2小時離心，上清即為濃縮小時離心，上清即為濃縮-球球蛋白（或用冷凍干燥儀使其濃縮）。蛋白（或用冷凍干燥儀使其濃縮）。 用醋酸纖維素薄膜電泳的方法，以用醋酸纖維素薄膜電泳的方法，以血清電泳圖譜為對照，鑒定所分離的蛋血清電泳圖譜為對照，鑒定所分離的蛋白質(zhì)種類和純度（參見血清蛋白質(zhì)醋酸白質(zhì)種類和純度（參見血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳）。纖維素薄膜電泳）。 1. 以醋酸纖維薄膜作為支持體的一種電泳方法。以醋酸纖維薄膜作為支持體的一種電泳方法。2. 在在pH8.6巴比妥緩沖液中，血清蛋白質(zhì)在電場中巴比妥緩沖液中，血清蛋白質(zhì)在電場中均帶負電荷，向正極移動。均帶負電荷，向正極移動。3. 帶電荷多、分
17、子量相對小的泳動速度快；帶電荷帶電荷多、分子量相對小的泳動速度快；帶電荷少、分子量相對大的泳動速度慢。少、分子量相對大的泳動速度慢。 點樣點樣 ：全血清：點樣一次全血清：點樣一次 脫鹽后的粗蛋白溶液：點樣脫鹽后的粗蛋白溶液：點樣35次次 濃縮后的純濃縮后的純球蛋白溶液：點樣球蛋白溶液：點樣3 35 5次次 電泳條件電泳條件：電壓：電壓：90110 V； 時間：時間：50分鐘。分鐘。染染 色色：電泳畢，關(guān)電源。取出薄膜浸入盛有氨基黑：電泳畢，關(guān)電源。取出薄膜浸入盛有氨基黑10B 10B 染色液的染色缸中染色染色液的染色缸中染色5分鐘，用分鐘，用2.5 %醋酸洗脫液漂洗，直至醋酸洗脫液漂洗，直至背
18、景呈白色。背景呈白色。取寬薄膜一張，取寬薄膜一張，3 3個樣品點在同一水平個樣品點在同一水平，以血清蛋，以血清蛋白圖譜為對照，觀察提純物屬哪種蛋白，其純度如何。白圖譜為對照，觀察提純物屬哪種蛋白，其純度如何。 區(qū)分電泳箱正負極區(qū)分電泳箱正負極快快+鉛筆標記鉛筆標記 ，垂直點樣，垂直點樣1鹽析時應(yīng)逐滴加入飽和硫酸銨，邊加邊搖，靜止要充分。鹽析時應(yīng)逐滴加入飽和硫酸銨，邊加邊搖，靜止要充分。2裝柱時柱內(nèi)要嚴防斷層與氣泡，凝膠床面要平整。裝柱時柱內(nèi)要嚴防斷層與氣泡，凝膠床面要平整。3準確配制準確配制NH4Ac緩沖液并嚴格調(diào)整其緩沖液并嚴格調(diào)整其PH至至6.5。 4保持層析柱床表面完整保持層析柱床表面完
19、整,上樣或加緩沖液時上樣或加緩沖液時,動作應(yīng)輕、慢，動作應(yīng)輕、慢， 切勿將柱床表面沖起切勿將柱床表面沖起.上樣時小心控制下端聚乙烯管上樣時小心控制下端聚乙烯管.嚴防空嚴防空 氣進入層析柱床內(nèi)。氣進入層析柱床內(nèi)。5樣品進入床內(nèi)樣品進入床內(nèi),打開出口后應(yīng)立即收集打開出口后應(yīng)立即收集.洗脫時注意收集樣洗脫時注意收集樣 品品,切勿使樣品丟失切勿使樣品丟失,并注意不要使層析柱干涸并注意不要使層析柱干涸,保留部分液保留部分液 體在凝膠柱床表面。體在凝膠柱床表面。6本次實驗填柱料本次實驗填柱料Sephadex G25和和DEAE-纖維素價錢纖維素價錢 昂貴，在使用時應(yīng)注意隨時回收重復(fù)使用。昂貴，在使用時應(yīng)注意隨時回收重復(fù)使用。1除了用凝膠過濾方法除去樣品中鹽外，還可以用哪除了用凝膠過濾方法除去樣品中鹽外，還可以用哪 些方法除鹽？些方法除鹽？2離子交換層析和凝膠過濾分離蛋白質(zhì)的原理是什么？離子交換層析和凝膠過濾分離蛋白質(zhì)的原理是什么？3如何對分離、純化后所得到的如何對分離、純化后所得到的- -球蛋白的純度和球蛋白的純度和 含量進行鑒定？含量進行鑒定？4如何從血清中分離純化免疫球蛋白如何從血清中分離純化免疫球蛋白G？
【生物化學(xué)實驗】血清γ球蛋白分離純化與鑒定課件
