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DNA的粗提取和鑒定
知識(shí)要點(diǎn):1.DNA的物理化學(xué)性質(zhì),尤其是DNA的溶解性;
2.二苯胺法鑒定DNA的方法和原理。
一、DNA的粗提取的原理
思考1:DNA存在于真核生物細(xì)胞的哪些部位?
思考2:提取生物大分子的一般思路是什么?
1、DNA的性質(zhì):
①DNA和蛋白質(zhì)的溶解性、對酶、高溫和洗滌劑的耐受性
在NaCl溶液中的溶解度
對蛋白酶的耐受性
對高溫的耐受性
對洗滌劑的耐受性
DNA
蛋白質(zhì)
?溶解度
②DNA粗提取的原理有些哪些?
i、DNA在mol/LNaCl溶液中溶解度最小
ii
2、、DNA不溶于溶液,而蛋白質(zhì)等能夠溶解
2、DNA鑒定的原理:
在的條件下,DNA遇會(huì)被染成。
二、DNA粗提取的主要步驟:
1、材料選擇:
適于作實(shí)驗(yàn)材的材料:選用的生物材料;如雞(紅)血,其適宜作為實(shí)驗(yàn)材料的
原因:①雞血(紅)細(xì)胞核的DNA含量豐富,材料易得;②雞血細(xì)胞極易吸水脹破。
哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞呢?
2、主要實(shí)驗(yàn)步驟(以雞血紅細(xì)胞為例):
「方法:將5?10mL雞血細(xì)胞液加入20mL中;用玻棒同方
1*向攪拌5min;用3?4紗布過濾,以除去顆粒較大的雜質(zhì)過濾;
:①破碎細(xì)胞,釋放J西徉
;,收集°
i*?CNA.?(格物質(zhì)???.?*:目的:破壞細(xì)胞,釋放
3、核物質(zhì)
I注意:攪拌不能用力過大,以防止打碎DNA分子;
「方法:向?yàn)V液中加入2倍體積的mol/LNaCl溶液,攪拌1min;
:②溶解細(xì)胞核;過濾獲取
:內(nèi)DNAX目的:使與DNA結(jié)合的解聚,釋放出;DNA溶解于高溶液
N"NaCl溶液中
、注意:按同一方向攪拌
「方法:沿?zé)谙驗(yàn)V液中緩慢加入蒸儲(chǔ)水,并輕輕按同一方向攪拌,使DNA析
③ DNA :
析出:
出,直到;可以在玻棒上收集到黏稠物(或過濾或離心收集黏稠物)
目的:降低NaCl溶液濃度達(dá)到mol/L左右,使DNA析出
k注意:加入的蒸儲(chǔ)水不能過多,使NaCl溶液濃度過低,DN取會(huì)
尸方法:向20mL2m
4、ol/LNaCl溶液中加入黏稠物,并按同一方向攪拌3min,使
DNA充分溶解;過濾,收集濾液;向?yàn)V液中貼壁緩慢加入50mL冷凍的
95%乙醇,并用玻棒按同一方向緩慢、均勻地?cái)嚢瑁诓0羯鲜占咨z狀物(DNA)
L原理:DNA不溶于中,而蛋白質(zhì)能溶于史二
歸納:①本實(shí)驗(yàn)中幾次過濾?過濾的目的是什么?
過濾一:
過濾二:
過濾三:
②本實(shí)驗(yàn)中幾次加入蒸儲(chǔ)水的目的各是什么?
第一次:向雞血細(xì)胞液中加入蒸儲(chǔ)水,目的:
第二次:向溶解DNA的2mol/LNaCl溶液中加入蒸儲(chǔ)水,目的:
拓展:1、以菜花為材料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí),如何獲得核物質(zhì)?
取材、剪碎一加入洗滌劑、食鹽一研磨、過
5、濾
▲加洗滌劑的目的:
▲加入食鹽的目的:
2、分析教材中方案一、二、三的原理。
萬案一:
萬案一:
方案二:
3、探究不同方法、洗滌劑、食鹽用量對DNA粗提取量的影響(說說實(shí)驗(yàn)思路)
三、DNA的鑒定:
1、方法:①取甲、乙兩支試管,并向其中加入5mL(等量)的2mol/LNaCl溶液;
②向甲試管中加入粗提取的DNA,并攪拌使DNA溶解;③向兩支試管中各加入4mL
(等量)二苯胺試劑,混勻,沸水中加熱5min,待試管冷卻后,比較兩支試管的顏色
(藍(lán)色)變化。
2、注意點(diǎn):實(shí)驗(yàn)中需要對照,目的:證明
四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)
1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià):是否提取到DNA?
6、
①觀察提取的DNA顏色:如果不是白色絲狀物,說明DNA中的雜質(zhì)較多;②二苯胺鑒定:出現(xiàn)藍(lán)色說明實(shí)驗(yàn)基本成功,如果不呈現(xiàn)藍(lán)色,可能所提取的DNA含量低,或
是實(shí)驗(yàn)操作中出現(xiàn)錯(cuò)誤,需要重新制備。
2、粗提取得到的絲狀物為什么略帶黃色?
實(shí)驗(yàn)提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)。
3、影響絲狀物總量的因素有哪些?實(shí)驗(yàn)材料種類和數(shù)量、溶解核DNA時(shí)的NaCl
溶液濃度、實(shí)驗(yàn)方法、攪拌方法(攪拌不當(dāng)可能破壞DNA)
五、案例:(快速閱讀、理解步驟原理)
以菜花為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行DNA的粗提取
【實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備】將新鮮菜花和體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液放入冰箱冷凍室24h【提取DN
7、A的具體步驟】
1、取材稱取30g菜花,去梗取花,切碎。
2、研磨將碎菜花放入研缽中,倒入10mL研磨液,充分研磨10min。
教材中建議采用洗發(fā)香波、洗滌劑等一些去污劑,使植物細(xì)胞膜破碎,釋放DNA。
學(xué)生可以設(shè)置對照實(shí)驗(yàn),比較哪一種方法可以提取到純度更高的DNA。一般實(shí)驗(yàn)室提取
高純度的DNA都采用一種陽離子去污劑一十六烷三甲基澳化俊分離緩沖液,使細(xì)胞膜破碎,同時(shí)將DNA與植物中多糖等雜質(zhì)分開,再用氯仿一異丙醇混合液(體積比為
24:1)抽提去除雜質(zhì)蛋白,得到高純度的DNA。
3、過濾在漏斗中墊上尼龍紗布,將菜花研磨液過濾到燒杯中(有條件的學(xué)校可將濾
液倒入塑料離心管中進(jìn)行
8、離心,用1000r/min的轉(zhuǎn)速,離心2?5min,取上清液放入燒
杯中)。在4c冰箱中放置幾分鐘后,再取上清液。
4、沉淀將一倍體積的上清液倒入兩倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的預(yù)冷乙醇溶液中,
并用玻璃棒緩緩、輕輕地?cái)嚢枞芤海úAО舨灰辈宓綗撞浚?。沉??5min后,可
見白色的DNA絮狀物出現(xiàn)。用玻璃棒緩緩旋轉(zhuǎn),將絮狀物纏繞在玻璃棒上。
六、訓(xùn)練題:
1 .在DNA粗提取的過程中,兩次向燒杯中加入蒸儲(chǔ)水的作用分別是
A.稀釋血液;沖洗樣品B.使血細(xì)胞破裂;降低氯化鈉的濃度
C.使血細(xì)胞破裂;增大DNA的溶解度D.使血細(xì)胞破裂;沖洗樣品
2 .下列實(shí)驗(yàn)中所用試劑錯(cuò)誤的是
9、
A.在觀察植物細(xì)胞有絲分裂實(shí)驗(yàn)中,使用醋酸洋紅溶液使染色體著色
B.在提取葉綠體色素實(shí)驗(yàn)中,使用丙酮提取色素
C.在DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)中,使用氯化鈉溶液析出DNA
D.在蛋白質(zhì)的鑒定實(shí)驗(yàn)中,使用蘇丹出染液鑒定蛋白質(zhì)
3 .NaCl的物質(zhì)量為多少mol/L時(shí),DNA的溶解度最小
A.0.12B.0.13C,0.14D,0.15
4 .在提取的細(xì)胞核物質(zhì)的溶液中,加入2mol/L的NaCl溶液40ml目的是
A.溶解雜質(zhì)B.溶解蛋白質(zhì)C.析出DNAD.溶解DNA
5 .從細(xì)胞核中提取DNA所用的提取溶液是
A.NaCl溶液B.酒精C.蒸儲(chǔ)水D.檸檬酸鈉
6 .提取含雜
10、質(zhì)較少的DNA所用的溶液
A.NaCl溶液B.冷卻90%的酒精C.加熱95%的酒精D.冷卻95%的酒精
7 .DNA遇二苯胺(沸水浴)時(shí),會(huì)染成
A.磚紅色B.紅色C.紫色D,藍(lán)色
8 .可以鑒定DNA的物質(zhì)是
A.斐林試劑B.95%的酒精C.甲基綠溶液D.二苯胺溶液
9 .破譯生物基因組DNA的遺傳信息或進(jìn)行基因操作,首先要提取細(xì)胞核DNA。下列不
適宜彳乍為DNA提取的實(shí)驗(yàn)材料是
A.雞血細(xì)胞B.蛙的紅細(xì)胞C.人的成熟紅細(xì)胞D.菜花
10 .(多選)下表是關(guān)于DNA粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)中所使用的材料、操作及其作用的表
述.正確的是
試齊
操作
作用
A
檸檬酸
11、鈉溶液
與雞血混合
防止血液凝固
B
蒸儲(chǔ)水
與雞血細(xì)胞混合
保持細(xì)胞形狀
C
蒸儲(chǔ)水
加入到溶解有DNA的NaCl中
析出DNA絲狀物
D
冷卻的酒精
加入到過濾后DNA的NaCl中
產(chǎn)生特定的顏色反應(yīng)
11 .(多選)下列關(guān)于DNA粗提取與鑒定的說法不正確的是
A.洗滌劑能瓦解細(xì)胞膜,同時(shí)也能控制DNA在NaCl溶液中的溶解度
B.在探究洗滌劑對植物細(xì)胞DNA提取的影響實(shí)驗(yàn)中,需要控制的變量是洗滌劑和
植物細(xì)胞
C.常溫下,DNA遇二苯胺被染成藍(lán)色
D.將濾液放在60?75c的恒溫水浴箱中保溫10?15分鐘能去除濾液中的雜質(zhì),其原理是利用了DNA和蛋白質(zhì)對高溫耐受性的不同
12 .如圖所示是關(guān)于“DNA的粗提取和物理性狀觀察”實(shí)驗(yàn):
(1)實(shí)驗(yàn)材料選用雞血球液,而不用雞全血,主要原因是雞血球液中含有較高含量的。
(2)在圖A所示的實(shí)驗(yàn)步驟中加蒸儲(chǔ)水的目的是,通過圖B所示的步驟取得濾液,再在溶液;圖中
燕
中加入2mol/LNaCl溶液的目的是
C所示實(shí)驗(yàn)步驟中加蒸儲(chǔ)水的目的是
DNA ,可滴加
成
O
(3)為鑒定實(shí)驗(yàn)所得絲狀物主要成分是果絲狀物被染
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