臨床醫(yī)學專業(yè) 芍藥苷通過調節(jié)心臟微血管內皮細胞VE-Cadherin保護膿毒癥心肌的作用及機制研究

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1、一. 材料與方法 10.基因測序 為了分析LPS感染過程中，芍藥苷對心臟微血管內皮細胞（RCMECs）基因表達的影響，我們將處理后的細胞進行了基因測序（RNA-seq）。將細胞分為實驗組（40uM芍藥苷預處理4h+LPS組）和對照組（LPS處理組），每組3個生物學重復。對兩組數(shù)據依次進行了數(shù)據質量評估、樣本相關性分析、對比參考基因組、表達定量、差異基因表達、差異基因功能分析、差異基因信號通路分析等。 在數(shù)據品質的評價方面，本試驗從測序質量分數(shù)、單堿基序列質量、序列GC含量及序列長度分布情況等方面對試驗數(shù)據進行質控。相關性分析是考察變量與其他變量相關性的一種方法，通過多元統(tǒng)計分析相關變量

2、是否以某種特定的方式聚集到一起。本試驗中通過計算樣本之間的皮爾森相關系數(shù)（Pearson Correlation Coefficient）來分析樣本間的相關程度，利用樣本相關性圖可視化相關性系數(shù)矩陣來展示樣本相關性。 按照美國Illumina生物技術公司RNA-seq樣本制備試劑盒（mRNA-Seq sample preparation kit）說明構建cDNA文庫。對照大鼠的基因組信息和完整的轉錄組的信息，將測序出的序列（reads）比對到參考基因組上，進而對基因或轉錄本進行注釋和定量。利用DESeq2對兩組進行比較，得到顯著性P值，padjust值（P值校正后的數(shù)值）和基因間的差異倍數(shù)（

3、Fold-change）；將兩個處理組進行比較，選取p-value（P值）<0.05且表達量差異倍數(shù)在1.2倍以上及0.83333倍數(shù)以下的定義為差異表達基因。其中差異倍數(shù)大于1.2且p-value<0.05的為上調基因，差異倍數(shù)小于0.83333并且p-value<0.05的為下調基因。利用Ballgown對兩組進行比較，得到顯著性P值，Q值（多重假設檢驗校正后的P值）和轉錄本間的差異倍數(shù)。本分析中將兩組進行比較，進行差異轉錄本篩選，選取p-value<0.05和差異倍數(shù)大于1.2倍及小于0.83333倍定義為差異轉錄本。其中差異倍數(shù)大于1.2并且p-value<0.05的為上調轉錄本，差異

4、倍數(shù)小于0.83333并且p-value<0.05的為下調轉錄本。 Gene Ontology數(shù)據庫（GO數(shù)據庫）是基因本體學數(shù)據庫的簡稱，該庫采用分層的方式對基因及其編碼的蛋白功能進行系統(tǒng)闡述。Go分析是建議在該數(shù)據庫的分析，并將基因功能分為：分子功能（molecular function）、生物學過程（biological process）和細胞成分（cellular component）三個類別。KEGG（kyoto encyclopedia genes and genomes）數(shù)據庫是系統(tǒng)分析基因功能、基因產物功能及相互關系等的數(shù)據庫，Pathway分析基于KEGG數(shù)據庫，針對差異基

5、因使用Fisher精確檢驗及卡方檢驗，將目的基因涉及的Pathway進行分析，依據P<0.05選出顯著性的Pathway。 二.結 果 （八）基因測序結果 1.兩組樣本基因相關性分析結果 我們對基因的表達量進行樣本相關性分析發(fā)現(xiàn)，兩組之間的基因相關值在0.99和1附近，證明兩組基因相關性極高（詳見復圖7）。 注：L-LPS，S-芍藥苷+LPS；顏色表示相關程度，顏色越藍，說明樣本的相關度越大。 附圖7 兩組樣本基因相關性分析圖 2.RNA-seq測序聚類分析結果 我們采取RNA-seq高通量測序技術對不同處理組（40uM芍藥苷預處理+LPS組LPS處理組）的RCMECs進

6、行分析。測序結果聚類圖中顯示不同處理組能夠完整分開，兩者對應的轉錄本表達差異較大（詳見附圖8）。 注：L-LPS組，S-芍藥苷+LPS組；橫坐標-不同處理組的樣本，縱坐標-差異轉基因；紅色-差異基因表達值高，綠色-差異基因表達值低。 附圖8 RNA -Seq測序的聚類分析圖。 3.兩組樣本差異性基因的篩選結果 比較得到836個差異基因，其中上調基因共有137個，下調基因共有699個。由于差異基因大部分為下調基因，所以后續(xù)我們主要分析下調表達的基因（詳見附圖9）。 注：綠點—下調基因，紅點—上調基因，灰點—非顯著性差異的基因。 附圖9 兩組差異基因火山圖 4.差異基因顯著富

7、集的GO 分析 按照功能將細胞內基因分為分子功能（molecular function）、細胞成分（cellular component）和生物學過程（biological process）三個類別。因基因較多，故表中僅羅列了部分差異基因（按照-LgP排序最大的各類前20項）。通過分析發(fā)現(xiàn)顯著性差異基因功能主要分布情況為：①分子功能模塊：腫瘤壞死因子受體及其超家族結合，以及泛素化過程中的酶活性蛋白質等，如tumor necrosis factor receptor superfamily binding。②細胞組分模塊：染色體區(qū)域的改變，細胞器膜的改變等，如chromosome, centr

8、omeric region。③生物學過程模塊：主要涉及一些炎癥相關信號通路的調節(jié)、信號的轉導及細胞因子的調節(jié)等，如regulation of MAP kinase activity（詳見表1-表3）。 表1 兩組RCMECs差異基因的分子功能（Molecular Function） goDescription geneRatio pvalue nucleic acid binding 203/615 3.668E-11 RNA binding 108/615 1.188E-09 carbohydrate derivative binding 122/615 6.267

9、E-08 ubiquitin-protein transferase activity 36/615 4.031E-06 ubiquitin-like protein transferase activity 37/615 4.077E-06 anion binding 134/615 4.55E-05 single-stranded RNA binding 9/615 0.002972 single-stranded DNA binding 10/615 0.0058649 tumor necrosis factor receptor superfamily

10、binding 6/615 0.0059601 enzyme binding 102/615 0.0088383 CXCR3 chemokine receptor binding 2/615 0.0126755 transcription regulator activity 66/615 0.0144157 rRNA binding 7/615 0.0157383 transcription factor binding 31/615 0.0243678 repressing transcription factor binding 6/615 0.0

11、248193 tumor necrosis factor receptor binding 4/615 0.0324218 open form four-way junction DNA binding 1/615 0.0369814 crossed form four-way junction DNA binding 1/615 0.0369814 interleukin-33 binding 1/615 0.0369814 interleukin-13 receptor activity 1/615 0.0369814 表2 兩組RCMECs差異基因細胞

12、組分（Cellular Component） goDescription geneRatio pvalue intracellular organelle lumen 205/672 4.359E-10 membrane-enclosed lumen 205/672 4.907E-10 non-membrane-bounded organelle 195/672 3.077E-07 intracellular non-membrane-bounded organelle 195/672 3.077E-07 chromosome 61/672 2.066E-0

13、5 nuclear body 46/672 3.613E-05 sex chromosome 8/672 5.906E-05 nucleoplasm part 62/672 7.502E-05 chromosomal part 55/672 7.513E-05 transferase complex 50/672 8.196E-05 chromosome, centromeric region 17/672 0.0001268 condensed nuclear chromosome, centromeric region 6/672 0.000235

14、6 chromosome, telomeric region 15/672 0.0002759 cytosol 154/672 0.0002942 host intracellular organelle 3/672 0.0004687 host intracellular membrane-bounded organelle 3/672 0.0004687 condensed chromosome 17/672 0.0004944 endomembrane system 151/672 0.0122119 tumor necrosis factor re

15、ceptor superfamily complex 1/672 0.0367816 protein phosphatase type 1 complex 2/672 0.0499800 表3 兩組RCMECs差異基因的生物學過程（biological process） goDescription geneRatio pvalue regulation of interferon-beta production 5/658 0.0057735 regulation of monocyte chemotaxis 4/658 0.0060998 regulati

16、on of intracellular signal transduction 80/658 0.0073309 regulation of leukocyte chemotaxis 9/658 0.0080840 regulation of interleukin-12 production 5/658 0.0086150 regulation of MAP kinase activity 17/658 0.0086854 regulation of intracellular signal transduction 50/658 0.0088540 regul

17、ation of tumor necrosis factor production 8/658 0.0092821 regulation of tumor necrosis factor superfamily cytokine production 8/658 0.0099956 regulation of response to external stimulus 19/658 0.0105641 regulation of stress-activated MAPK cascade 12/658 0.0107008 regulation of interleuki

18、n-6 production 8/658 0.0107490 regulation of inflammatory response 9/658 0.0238767 regulation of dendritic cell cytokine production 2/658 0.0265304 regulation of interleukin-12 biosynthetic process 2/658 0.0265304 I-kappaB kinase/NF-kappaB signaling 16/658 0.0281508 cellular response

19、to cytokine stimulus 40/658 0.0307542 response to cytokine 45/658 0.0422526 interleukin-12 biosynthetic process 2/658 0.0432579 cytokine-mediated signaling pathway 21/658 0.0488657 5.差異表達基因的信號通路顯著性富集分析： 差異表達基因的通路富集分析基于KEGG數(shù)據庫，把基因及表達信息作為一個整體網絡進行研究。我們對差異基因利用Fisher精確檢驗和卡方檢驗，把目標基因參與的Pathw

20、ay進行顯著性分析，依照p value<0.05標準篩選，羅列出-LgP排序最大前10項，結果顯示下調基因明顯富集于炎癥相關的信號通路，如toll樣受體信號通路、自然殺傷細胞細胞毒活性調節(jié)通路等，及與多種惡性腫瘤的調節(jié)有關（詳見表4）。 表4 兩組RCMECs細胞有差異的信號通路（passway） pathDescription geneRatio pvalue Herpes simplex virus 1 infection 25/292 0.002565481 Hepatitis B 12/292 0.00670556 Proteoglycans in cancer

21、 14/292 0.008350082 Chagas disease (American trypanosomiasis) 8/292 0.027690321 Gastric cancer 10/292 0.027974197 Human immunodeficiency virus 1 infection 14/292 0.030720746 Pathways in cancer 26/292 0.033211429 Toll-like receptor signaling pathway 7/292 0.037505078 Natural killer c

22、ell mediated cytotoxicity 7/292 0.045285874 Chronic myeloid leukemia 6/292 0.046161062 通過分析下調倍數(shù)、差異顯著性，以及查詢各基因的功能，我們發(fā)現(xiàn)明顯下調的基因中有一些與炎癥反應顯著相關的基因，如Tlr4、Il1rl1、Hmgb1、Akt3、Ppp4r3b等（詳見表5）。其中，Tlr4、Hmgb1與膿毒癥的發(fā)生進展密切相關，是近年來膿毒癥證領域研究的重點基因。其中TLR4、HMGB1和Il1rl1基因編碼的蛋白在膿毒癥中的重要作用已經受到了廣泛的關注。 表5 與炎癥反應及膿毒癥顯著相關的下

23、調的基因 Gene_ID Gene_Symbol log2FoldChange pvalue padj style ENSRNOG00000003712 Ppp4r3b -1.00506 0.049443 0.999686 down ENSRNOG00000007283 Erlec1 -0.59217 0.041586 0.981412 down ENSRNOG00000010522 Tlr4 -0.63731 0.00084 0.257265 down ENSRNOG00000014835 Il1rl1 -0.36946 0.00768

24、1 0.613764 down ENSRNOG00000021497 Akt3 -0.31728 0.041938 0.981415 down ENSRNOG00000058202 Ppp2r2c -2.13028 0.046109 0.992841 down ENSRNOG00000058908 Hmgb1 -0.88728 0.012234 0.703824 down ENSRNOG00000059016 Tspan12 -0.69446 0.005311 0.555121 down 三.分析與討論部分 2.基因測序結果提示多個基

25、因及信號通路發(fā)生變化 2.1芍藥苷保護膿毒癥心肌作用涉及多個基因和通路 通過分析我們發(fā)現(xiàn)在顯著下調的基因中有一些基因與炎癥反應及膿毒癥密切相關，分別是TLR4、HMGB1和Il1rl1。 TLR4編碼的蛋白可識別革蘭氏陰性菌的脂多糖（LPS），形成受體-配體復合物后，誘導 TLRs的TIR 二聚化或者原有二聚結構改變，通過接頭蛋白 TIRAP 招募活化MyD88。MyD88被激活后，招募信號分子白介素-1受體相關激酶-4（IRAK-4），進而激活IRAK-1，之后活化腫瘤壞死因子受體相關因子-6（TRAF-6），活化的TRAF-6 促進 IκB 激酶（IKK）的泛素化降解并激活TGF-β

26、激酶（TAK-1）。激活的TAK-1促進轉錄因子IKK-α、IKK-β、NF-κB 的表達。TAK-1 同時還可激活絲裂原蛋白激酶（MAPK）途徑，進而活化轉錄因子AP-1。NF-κB和AP-1可誘導多種促炎癥因子mRNA轉錄，如 IL-1、TNF-α、IL-6等，TLR4的過度激活會引發(fā)炎癥因子的大量、失控性釋放，是導致膿毒癥發(fā)生的關鍵因素。 HMGB1編碼的蛋白被認為是晚期炎癥因子和炎癥伴侶分子，當細胞受到損傷，特別是發(fā)生壞死時，能夠被大量的釋放，胞外的HMGB1蛋白一方面能夠作為趨化因子招募免疫細胞，促進炎癥反應。另一方面HMGB1作為伴侶分子能夠與其他的 PAMPs以及細胞因子形成

27、復合體增加炎癥因子的產生。它能夠通過脂質A區(qū)域與LPS 結合，催化LPS從細胞膜上解離，將其轉運至游離的或者與膜結合的 CD14分子。實驗證明，分別用 LPS、LPS+HMGB1復合體刺激單核細胞，LPS+HMGB1復合體刺激組的單核細胞會分泌更多的炎性因子TNF-α。 IL1RL1基因編碼的蛋白質稱為白介素-1受體樣1，也稱為ST2。ST2蛋白具有兩個種型，分別為可溶性ST2和膜結合受體形式的ST2，參與心肌病發(fā)生和進展。ST2的配體是細胞因子白細胞介素-33（IL-33），IL-33與膜結合受體形式的ST2受體結合后才可以發(fā)揮生物學效應，主要通過激活MAPK信號通路誘導Th2類細胞因子如

28、 IL-4、IL-5 和 IL-13 的釋放，參與 Th2 型免疫反應[]，具有直接保護心肌的作用。然而可溶性ST2也可與IL-33結合，但無生物學效應，對膜結合受體形式的ST2受體起到了拮抗作用。當心肌病心肌被拉伸時，IL1RL1基因表達上調，增加了循環(huán)可溶性ST2的濃度，結果，在高水平的可溶性ST2狀況下，膜結合受體形式的ST2受體的心肌保護作用被抵消，使得心肌承受更大的壓力，故而IL-33/ ST2通路對心肌的作用具有多重性。 基因測序的結果提示芍藥苷可能通過抑制以下幾種炎癥因子及炎癥通路改善LPS誘導的心臟微血管內皮細胞的損傷，發(fā)揮心肌保護的作用：1.芍藥苷可以直接抑制內毒素誘導的細

29、胞因子TNF-α、IL-1β以及IL-10的產生分泌，減輕心臟炎癥損傷；2.芍藥苷可通過抑制MAPK/NF-κB通路，減少IL-6和TNF-α等促炎因子的產生； 3.芍藥苷通過抑制LPS/NF-κB通路減少巨噬細胞的M1極化，同時提高IL-4水平促進巨噬細胞M2極化，從而在減輕M1細胞的促炎作用的同時增強了M2細胞的抗炎作用。這表明芍藥苷對膿毒血癥心肌損傷的保護涉及多條通路，這些與炎癥相關的信號通路通過激活或者抑制，共同發(fā)揮了抑制炎癥作用，下調心臟微血管內皮細胞通透性，從而發(fā)揮心肌保護作用。 2.2 芍藥苷保護膿毒癥心肌作用未通過Rho家族基因的變化 細胞骨架是細胞內的纖維狀蛋白絲，維持細

30、胞形態(tài)、完成細胞運動、信息傳遞等。細胞骨架是由蛋白纖維交織而構成的網狀結構，與外側胞膜和內側核膜存在聯(lián)系，從而保持細胞形狀，參與細胞運動。內皮細胞骨架是由肌動蛋白微絲、微管和中間絲組成的復雜網絡，這些微絲結合在一起共同調節(jié)內皮細胞內部和細胞之間的形狀變化和信號傳遞[53]。內皮又主要包括單層內皮細胞和基膜，是具有屏障功能的半通透膜，內毒素可通過直接或間接形式激活或損傷內皮細胞，造成其功能變化。 Rac1是Rho GTP家族中一員，是真核細胞內關鍵的信號轉導蛋白分子，參加基因轉錄、細胞周期的調控以及細胞骨架的構建等多種生物功能，在調節(jié)內皮屏障功能方面發(fā)揮著重要作用。許多細胞因子可激活Rac1，

31、表明Rac1蛋白在多器官功能衰竭所引起的血管內皮屏障功能障礙中起著關鍵作用。注射活化的Rac1蛋白分子到成纖維細胞中造成細胞出現(xiàn)膜突起、片狀偽足和應力纖維形成，但在注射前注射抑制型Rac1即可使上述反應消失[54]，說明Rac1蛋白活性對于細胞形態(tài)和骨架的改變十分重要。 在RNA-seq測序分析中發(fā)現(xiàn)，無論從基因水平還是從轉錄本水平，亦或是芍藥苷組和LPS組的差異基因或轉錄本表達水平Rac1基因都不存在顯著性差異，本次細胞實驗部分也未發(fā)現(xiàn)芍藥苷對Rac1的表達有明顯調節(jié)作用，所以我們推測芍藥苷改善LPS誘導的心臟微血管內皮細胞損傷的作用并不直接通過Rac1基因即Rho基因家族起作用。本人所在

32、研究團隊前期研究中曾發(fā)現(xiàn)Rac1參與LPS誘導的心肌損傷過程，改變細胞骨架，增加細胞通透性，但對于芍藥苷對心肌的保護作用是否涉及Rho基因家族的改變，我們還需要進一步完善的體外試驗進行驗證。 IL-33與心肌損傷 白介素-33（Interleukin-33，IL-33)屬于IL-1大家族，所以基因與其它家族成員，如IL-18和IL-1β有很多相同之處。在正常情況下IL-33存在于細胞核內，是一種染色質相關核因子[9, 10]；組織細胞受損時可分泌至胞外[11]。與IL-1β和 IL-18的成熟依賴于caspase1 不同，IL-33被 caspase1 切割后會失活；而全長的 IL-

33、33具有生物學活性[12]。因此，IL-33 與 IL-1β 會在不同的情況下發(fā)揮作用，它們的生物學功能也有很大差別。IL-33 與存在于細胞膜上的受體 ST2 結合，導致 MAPK和 NF-κB 信號通路的激活，主要誘導 Th2 類細胞因子如 IL-4、IL-5 和 IL-13 的釋放，參與 Th2 型免疫反應[13,14]，具有直接保護心肌的作用。IL-33能夠顯著改善由血清苯腎上腺素和血管緊張素Ⅱ增高引發(fā)的心肌肥大[15]，也可以保護心肌缺血再灌注損傷[16]。在膿毒癥發(fā)生時，血清 IL-33 濃度會上升[17]。IL-33 可以調節(jié)全身性的炎癥反應，降低血清中的 IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ，減輕器官的損傷[18]；IL-33使炎癥反應轉向 Th2，誘導巨噬細胞 M2極化[19]，并通過增強中性粒細胞的趨化作用，增強對病原微生物的清除能力[20]。IL-33對膿毒癥炎癥反應的調節(jié)，提示其可能通過對炎癥反應的調節(jié)參與了膿毒癥心肌保護。