紫外分光光度法的原理.ppt

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第七章紫外分光光度法的原理和應用,一.比色分析的原理：光是一種電磁波，它的波長用nm或?為單位，人的眼睛所能感覺到的光波長約400～760nm，這之間的光波稱為可見光。短于400nm的叫紫外線，短于200nm的叫遠紫外線，再短的就是X射線和γ射線了。長于760nm的叫紅外線，紅外線可長達5mm，再長的就是無線電波了。普通的日光、白熾燈光稱為發(fā)射光，將這種日光或白熾光通過棱鏡可以分解為紅、橙、黃、,,綠、藍、青、紫等組成的光譜，稱為發(fā)射光譜。如果在白熾燈光與棱鏡之間放一個有色溶液的玻璃皿，則通過棱鏡后的光譜上會出現(xiàn)一處或幾處暗帶，這種帶有暗帶的光譜稱為該有色溶液的吸收光譜，吸收光譜顯示該溶液對光的選擇性吸收的特性。溶液所呈現(xiàn)的顏色是它的吸收光譜中透過最多、吸收最少的那部分波長光線的顏色，而暗帶部分則是它透過最少、吸收最多的那部分波長光線的顏色。不同分子的原子團和原子，它的發(fā)射光譜和吸收光譜不同。因此可以根據(jù)其光譜的特征和,,強度研究化合物的結構和測定其含量，稱為光譜分析法，這也是比色分析的原理。根據(jù)發(fā)射光譜分析的如火焰發(fā)射光譜法（又稱火焰光度法，分析鈉、鉀、鈣），熒光光度和熒光分光光度法（根據(jù)熒光的發(fā)射強度進行分析）。根據(jù)吸收光譜分析的方法又稱吸光光度法，如應用可見光的吸收光譜進行分析的普通的分光光度計和分光光度法；用紫外光的吸收光譜進行分析的叫紫外分光光度計和紫外分光光度法；用原子的吸收光譜進行分析的方法叫原子吸收分光光度計和原子吸收分光光度法。,硒-鄰苯二胺絡合物的吸收光譜特征吸收峰332.5nm,氧化鈥的吸收光譜,,二.郎伯-比爾定律：當一束單色入射光[I0]通過厚度為L、濃度為C的有色溶液后，所透過光的強度[I1]與溶液厚度L及濃度C成負指數(shù)乘積的關系：I1=I010－KLC如果物質在溶液中的濃度和顯色強度成正比，則可以應用郎伯-比爾定律通過比色方法從顯色強度求濃度，這是比色分析的原理。,入射光強度I0透過光強度I1溶液厚度L（比色杯直徑）,,,,,I1=I010－KLC移項成：I1/I0=10－KLC式中K為常數(shù)，可因物質的吸光特性和采用單色光的波長不同而有所不同，與溶液的厚度和濃度無關。上式寫成以10為底的對數(shù)，Iog(I1/I0)=－KLC，再以透光度T=I1/I0時，則上式成為IogT=－KLC或者－IogT=KLC。I1/I0稱為透光度或透光率，表示透過光強度是入射光強度的百分之幾，其數(shù)值只能＜1，從0~100%。為了方便起見，經常用透光度的負對數(shù)－IogT來表示溶液吸收光線的情況，并稱為吸光度(ABS)、消光度(E)、或光密度(OD或D)，這樣，ABS=KLC,,該式說明溶液的吸光度和濃度C、厚度L之間皆成正比關系。當厚度一定時，溶液的濃度增加，則吸光度成正比地增加，這就是比色分析的依據(jù)。實際使用中，溶液的厚度就是比色杯的厚度，它是相對固定的，有0.5、1、2、4cm的比色杯，使用最多的是1cm的比色杯。比色分析中有時也用透光度做單位，根據(jù)透光度的負對數(shù)－IogT=吸光度，透光率為100%時，吸光度=－Iog1=0，而透光率為1%時，吸光度=－Iog0.01=2，二者間呈對數(shù)指數(shù)關系。當然，只有溶液的濃度和吸光度之間成直線,,正比關系時才能進行比色分析，如果溶液的吸光度與濃度不成正比（不符合郎伯-比爾定律），則不能使用比色分析。有時，溶液的濃度只在一定范圍內和顯色成直線正比關系，而濃度超過一定限度時，失去正比關系，則不能一概地用比色結果換算，通常都要研究測定方法中什么濃度范圍內二者成直線正比關系；或者繪制一系列濃度和吸光度之間的標準曲線，發(fā)現(xiàn)濃度增加到一定限度，標準曲線發(fā)生彎曲、變折，說明超過該濃度時，要對溶液進行稀釋才能用來比色分析。,,可見光、紫外、熒光分析都要求溶液必須透明，否則引起對光的吸收，影響分析的準確度。對特殊的均勻的渾濁液也可以進行比色分析,稱為比濁法，比如應用于紅細胞計數(shù)、細菌計數(shù)的比濁測定。光線通過透明的溶液時，還有少量的光線在玻璃、溶液的表面被反射或散射，影響到吸光度，所以要用一個空白管進行校正，除去反射、光、散射光、試劑中雜質、非反應物的影響，即用空白試劑溶液進行調零的原因。普通玻璃對紫外線也有吸收，所以在普通分光光度計上,,使用普通玻璃比色杯，而在紫外分光光度計上必須用對紫外線無吸收的石英玻璃比色杯。三.可見—紫外分光光度計的應用（一）光譜分析：有時候需要研究某物質在某溶劑中的光譜特性，如Vc的乙酸溶液在252.0nm和237.5nm處有吸收波峰。大多數(shù)情況下，比色分析都提供了使用光的波長（一般是最大吸收峰波長）。如果沒有提供使用波長的話，可以用紫外分光光度計從200～1000nm范圍內掃描吸收光譜，搜索到吸收峰，再用吸收峰波長來比色分析。,咖啡因樣品用紫外光譜定性和定量，上：標準品；下：樣品,,（二）吸光系數(shù)：郎伯-比爾定律中的K稱為吸光系數(shù)。因比色杯的直徑用cm為單位，因此K的單位決定于濃度c用什么單位，如c以mol/L為單位時K稱為摩爾吸光系數(shù)，用Emol或εmol表示；如果物質的分子量未知，濃度可用%為單位，K稱為百分吸光系數(shù)，用E%表示。E的定義是：某波長光通過1cm杯、1mol/L或1%濃度的某溶液時，該溶液對該波長光的吸光度。E在特定波長、1mol/L或1%濃度、特定溶劑條件下是該物質的一個特征常數(shù)，反映該物質的吸光能力，資料和測定時都要標明其特征,,波長或最大吸收波長，表示為Emol~nm,max,1cm或E%~nm，max，1cm。許多物質的吸光系數(shù)在書或資料中可以查到，如藥典規(guī)定VB12應該有2781nm、3611nm、5502nm3個吸收峰，其E1%361nm，1cm=207。實際工作中，1mol/L的濃度太高，可以配成1mmol/L或1μmol/L的濃度，相應地寫成Emmol（μmol）~nm，max，1cm。根據(jù)吸光系數(shù)的特性，它有3項用途：1.可作為物質定性的參考：被測物質的光譜特性和標準物如果一致，可粗略定性。如檢查VB12注射液是否變質，測定其光譜，結果為279,,0、361.50、550.70.3nm3個吸收峰，完全一致，可以判定該物質為VB12（未變質）。一些苯衍生物的紫外光譜特征如下：化合物溶劑吸收峰吸收峰吸收峰Emolmax，1cm苯碳氫化合物254nm2502048800甲苯碳氫化合物2622602087900六甲基苯碳氫化合物27123022110000氯苯碳氫化合物2672002107400苯酚碳氫化合物27112602136200.,,2.檢查純度：紫外光譜法檢查純度是一種簡便有效的方法，用于許多化合物檢測。如阿司匹林在空氣中容易吸收水分產生水楊酸，阿司匹林在280nm處有強吸收峰，而水楊酸的吸收峰遷移到312nm，只要檢測在312nm處是否有吸收峰，即可判斷有無水楊酸。再如無水乙醇精制過程中要用苯，測定無水乙醇中是否殘留苯，測定其吸收光譜，乙醇在210~600nm之間無吸收峰，而苯在250、254nm有吸收峰，以純無水乙醇為參比，對樣品進行光譜分析，如果在250、254nm處出現(xiàn)吸收峰，則說明有苯殘留。,,3.檢查含量（純度）:如藥典規(guī)定VB12的E1%max，361nm，1cm=207，上述VB12注射液原標示濃度為0.05%，求實際濃度，方法：藥液用重蒸水精確稀釋20倍，水做參比，用361nm測定的吸光度為0.512，其含量為：1%∶207=x%∶0.512，x%=0.00247%，濃度=0.00247%20=0.049%4.應用摩爾吸光系數(shù)測定濃度:一般的比色分析中都有標準品，未知樣品都是通過和標準溶液對比分析含量。某些情況下，沒有標準品，可以用摩爾吸光系數(shù)或百分吸光系數(shù)進行測定，直接測定溶液的吸光度，通過和該純物質的吸,,光系數(shù)比較，可以計算出濃度。這樣的分析需要經過精確校正了波長的分光光度計，紫外分光光度計的波長一般精確到2nm，可以承擔這樣的分析。如果知道分子量的話，百分吸光系數(shù)和摩爾吸光系數(shù)之間可以互相換算，換算公式是：百分吸光系數(shù)=10摩爾吸光系數(shù)物質的分子量。比如血紅蛋白是4個亞基組成的蛋白質，單個亞基的平均分子量是16114.5。每個亞基都在高鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]和氰化鉀[KCN]溶液中形成單體氰化高鐵血紅蛋白（HiCN），它的特征,,（最大）吸收峰在540nm處，摩爾吸光系數(shù)是11000，表示為Emolmax,540nm,HiCN=11000。測定樣品在同樣條件下的吸光度，就可以計算出含量。如：將血液0.02ml加入到5.0ml氰化高鐵試劑中，用540nm測定的吸光度為0.35，求血液中Hb的含量(g/L)。第一步，計算血液稀釋倍數(shù)：5.020.02=251（倍）；第二步，計算：1mol∶11000=xmol∶0.35，x=0.3511000mol/L，乘以分子量和稀釋倍數(shù)變?yōu)間，x=0.351100016114.5251=128.7（g/L）。如果有些物質不知分子量，用它的1%溶液在同,,樣條件下測定，用百分吸光系數(shù)同樣可以換算。5.紫外吸收光譜在某種程度上反映了化合物的性質和結構，所以可以用于有機化合物的定性和結構分析。利用標準樣品或標準圖譜可以對未知化合物進行鑒定，即控制相同的測量條件，將未知化合物的吸收光譜與標準品或標準圖譜進行對照，如果兩者吸收光譜的形狀、吸收峰的數(shù)目、位置、最大吸收波長及吸光強度完全一致，則可說明它們分子結構中存在相同的生色基團，初步確定它們是同一種物質，如咖啡因的定性。,,由于大多數(shù)有機化合物的紫外光譜比較簡單，缺乏精細的結構特征，而且很多生色團的吸收峰幾乎不受分子中其它非吸收基團的影響，因此，僅根據(jù)紫外光譜鑒定有機化合物有很大局限，一般必須與紅外光譜、質譜、核磁共振波譜等相配合，才能進行精確的鑒定。6.溶劑對紫外光譜的影響：在測定有機物的紫外可見吸收光譜時，在溶解度容許范圍內，應盡量選擇非極性溶劑或極性較小的溶劑（烷、烯烴，如正己烷、正庚烷），以獲得吸收光譜的精細結構。與標準樣品或標準圖譜進行對比,,時，必須用相同的溶劑。所選擇的溶劑在所研究的光譜區(qū)域內應該沒有明顯的吸收；并且不含有其它干擾物質；與溶質沒有相互作用。否則會使光譜線產生移動，低于此波長時，溶劑的吸收不可忽略。,,常用溶劑的波長范圍如下：.溶劑使用波長范圍溶劑使用波長范圍甲醇>210二氯甲烷>235.乙醇>215氯仿>245.水>210乙酸乙酯>260.96%硫酸>210苯>280.乙醚>215甲苯>285.,,（三）作為光度計使用：有色的反應液可以用普通的分光光度計（721、722、濃度計），也可以用紫外分光光度計比色。某些溶液、反應液無色，在200～400nm之間有特征性光吸收,就只能用紫外分光光度計。1.單一物質測定：先測定溶質的吸收光譜，一般用最大吸收波長進行比色。常用方法有2種。（1）標準曲線法：用標準液制作一系列標準管的標準曲線，樣品測定結果查標準曲線求知。（2）對照管法：制作標準測定管和樣品測定管，在特征吸收峰（或最大吸收峰）處測定吸,,吸光度進行比較，可直接求出樣品含量。如VB12含量測定：精確吸VB12注射液Vml，加重蒸水稀釋n倍，使每含的標示量為30μg/ml，另外配VB12標準液濃度為30μg/ml，蒸餾水調零，用361nm測定吸光度A，計算：測定液中VB12含量（μg/ml）=（A樣品/A標準品）30；注射液中VB12含量（μg/ml）=（A樣品/A標準品）30n（稀釋倍數(shù)）V（取樣量,ml）2.混合物中兩物質同時測定（兩物質的最大吸收峰有部分重合）例四環(huán)素和金霉素混合物的測定：四環(huán)素在0.25,,NNaOH中最大吸收峰為380nm，E1%1cm，λmax=372.0；在0.1NHCl中最大吸收峰為355nm，E1%1cm，λmax=303.2；兩吸收峰都可以做為四環(huán)素的測定波長。但與金霉素共存時，因為金霉素在355nm處有吸收（金霉素在0.1NHCl中E1%1cm，λmax=182.6），只能用380nm測定四環(huán)素。混合樣品在355nm處測定二者的總吸光度,在380nm處測得四環(huán)素的吸光度，則兩者的濃度都可以求出。測定方法：(1)測定1%混合物在0.1NHCl溶液的吸光度A335(2)測定1%混合物在0.25NNaOH溶液的吸光度,,A380，計算：四環(huán)素濃度C1（g%）=[AC1380/E1%（C1）1cm，380]=AC1380/372.0金霉素濃度C2（g%）=[AC1+C2335－（E1%（C1）1cm，355C1）]E1%（C2）1cm，355=[AC1+C2335－（303.2AC1380372.0）]182.6,,四.紫外分光光度法的應用：紫外光度法廣泛應用在化學、生物化學、醫(yī)學、環(huán)境檢測、食品衛(wèi)生檢驗分析方面。凡在200-1000nm范圍內有特征性吸收，或與試劑反應后形成特征性吸收,符合郎伯—比爾定律的，都可以分析，如：1.測定蛋白質：蛋白質中含有酪氨酸和色氨酸對280nm的紫外線有最大吸收，吸收值與其濃度成正比，樣品不必反應，稀釋后直接測定。2.肌紅蛋白：在576nm附近有吸收峰，不需要標準品，通過摩爾吸光系數(shù)法，可直接測定。3.還原性谷胱甘肽：與四氧嘧啶反應，生成物,,在305nm處有最大吸收峰。4.過氧化氫酶：有可見光測定法，也有紫外法。5.抗生素：大部分可用紫外法測定，如青霉素、鏈霉素、氯霉素、四環(huán)素、金霉素、新生霉素。6.VA用乙醚提取，溶在異丙醇中用328nm測定。VB1用246nm分析。VB2用267和444nm分析。VB6用291nm分析。VB11用254nm分析。VB12用278、361、550nm分析。VD用乙醚提取，純化后溶在乙醇中用265nm測定。Vc在乙酸介質中與I2反應：C6H8O6+I2乙酸溶液C6H6O6（脫氫Vc）+2HI；樣品中加入Vc后與I2反應，,,,減少了I2，也減少了I3－生成，在一定范圍內Vc與I3－成反比，用350nm測定I3－的顯色減弱，間接測定Vc濃度。7.許多藥物要用紫外光譜測定，如咖啡因用272.6nm；巴比妥類（安眠藥）用220～240nm測定；5種氯丙嗪類藥（鎮(zhèn)定藥）全用249～307nm測定；安眠酮用235和503nm分析；安定（鎮(zhèn)靜藥）用240和285nm分析。8.食品中硒與鄰苯二胺反應，將絡合物提取到甲苯中，反應物在335nm左右有吸收峰，用紫外比色測定。,,第八章原子吸收分光光度法的原理由原子結構理論可知，一個原子可具有多種能態(tài)，其中最低的能態(tài)稱為基態(tài)，其它較高的能態(tài)稱為激發(fā)態(tài)。處于基態(tài)的原子稱為基態(tài)原子。原子吸收分光光度法的原理是：使樣品中化合態(tài)的元素吸收熱能，化合物解離后讓元素變?yōu)榛鶓B(tài)原子?；鶓B(tài)原子的能量最低，最穩(wěn)定，如果基態(tài)原子受外界能量激發(fā)，其最外層電子可能躍遷到不同的能級，達到不同的激發(fā)態(tài)。電子從基態(tài)躍遷到能量最低的激發(fā)態(tài)（第一激發(fā)態(tài)）時要吸收一定波長的譜線，這一譜線稱為“共振吸收線”。,,E6.E5.E4.E3.E2.E1.最低激發(fā)態(tài)能級（第一激發(fā)態(tài)）EE0.基態(tài)原子能量的吸收和發(fā)射,較高激發(fā)態(tài)能級,,,,而當電子從激發(fā)態(tài)再躍遷回基態(tài)時，則輻射出相同波長的譜線，這一譜線稱為“共振發(fā)射線”，兩線均稱為共振線，波長是相同的。由于各種元素原子結構和核外電子排列不同，因此從基態(tài)躍遷到第一激發(fā)態(tài)（或由第一激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)）時吸收或輻射的能量不同，因而各元素有不同波長的共振線，所以元素的共振線又稱為元素的特征譜線。因為從基態(tài)到第一激發(fā)態(tài)的躍遷最容易發(fā)生，所以對大多數(shù)元素來講，共振吸收線是元素所有譜線中最靈敏的譜線，原子吸收分光光度法就是利用基態(tài)原,,子躍遷到第一激發(fā)態(tài)時吸收從光源燈（元素燈）發(fā)出的同一元素的共振吸收譜線（又叫分析線，相當于吸收峰）。但原子的吸收譜線并不是幾何學上的線條，而是有一定寬度的波長范圍，通常稱為譜線輪廓。KoIvKo/2半寬度———Vo——————Vo———透射光強度Iv與波長Vo的關系吸收線輪廓與半寬度,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,若將吸收系數(shù)Kv隨入射光波長變化的關系做圖，則稱吸收線輪廓，吸收線輪廓的特征值是吸收線中心波長（或頻率）為Vo，在Vo處，吸收系數(shù)Ko最大，在Vo兩側一定距離后Kv減為零。吸收譜線在Vo兩側有一定寬度，通常以吸收系數(shù)等于極大值的一半（Ko/2）處吸收線兩點間的輪廓（頻率范圍）表示吸收線的寬度，稱為吸收線的半寬度，以△V表示，其范圍為0.001～0.01nm。同樣發(fā)射譜線也有寬度，不過實際使用中都是用吸收譜線中心的最大吸收值Ko來測定元素含量，稱為峰值吸收。,,入射光強度Iov透過光強度Iv研究證明，原子蒸氣對共振發(fā)射譜線的吸收程度和蒸氣中基態(tài)原子數(shù)成正比，也即同原子濃度成正比。當一束強度為Iov、頻率為v的入射光（譜線）通過原子蒸氣后，有一部分被吸收，其透過光的強度Iv與原子蒸氣厚度（即火焰的寬度）L、原子蒸氣濃度C的關系同有色溶液吸收光的情況完全類似，服從郎伯-比爾定律，即Iv=Iove－KvCL，式中e是自然對數(shù)的底，Kv是原子蒸氣對頻率為V的入射光的吸收系數(shù)。,火焰寬度L,,,,當原子蒸氣厚度L一定時，設－KvL=－K，Iv=Iove－KC，Iov/Iv=e－KC，將透光度Iv/Iov的的倒數(shù)取對數(shù)稱為吸光度A，則上式簡化為A=－Ig（Iv/Iov）=KC，即吸光度A與濃度成線性正比關系。在確定的實驗條件下，原子蒸氣中的原子濃度與樣品中的元素實際濃度成正比，這就是原子吸收分光光度法測定元素的原理。實際測定中還有許多注意事項：1.元素測定都要先制備工作曲線，每個工作曲線至少要6～7個點，而且最好從低濃度—高濃度，范圍盡可能大，而且要符合線性關系。,,2.處理樣品同時要制備它的空白對照管，測定管吸光度減去空白管吸光度，再通過工作曲線計算元素濃度。3.原子吸收分析的優(yōu)點是靈敏度高，絕對檢出線可達10－9～10－10g，相對誤差一般0.1～0.5%,測定范圍廣，從10－6～10－9g。選擇性好，分析速度快，溶液中多種離子不需要分離直接測定。但也有缺點，主要是元素在火焰中燃燒過程中有許多干擾因素。4.原子吸收分析，樣品溶液的最適濃度在靈敏度的15～100倍范圍內。,,一些元素的分析譜線鎂：285.2nm；鈣：422.7nm；鐵：248.3nm；銅：324.8nm；錳：279.5nm；鋅：213.9nm；鉻：357.9nm；鎳：232.0nm；鈷：240.7nm鉬：313.3nm鉛：283.3nm；鎘：228.8nm；錫：224.6nm銻：217.6nm；鋁：309.3nm；砷：139.8nm；汞：253.7nm；,,第九章火焰光度法某些原子或分子的電子受到熱能或電能的激發(fā)后躍遷到激發(fā)態(tài)，當這些電子再由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時，以光的形式釋放出所吸收的能量，形成發(fā)射光譜。每個原子或分子的的能量狀態(tài)是一定的，所以它們的發(fā)射光譜線也是特異的；激發(fā)的能量越大，被激發(fā)的電子的能量也越高，呈現(xiàn)的譜線也越多。用火焰作為激發(fā)能量，使某些金屬元素（離子）產生發(fā)射光譜進行分析的方法稱為火焰光度分析法。一般火焰屬于熱能，能量不及電弧,,火花高，因此產生的光譜比較簡單，有時僅二、三條譜線。普通煤氣-空氣火焰的溫度不太高，所以能激發(fā)的元素也僅限于堿金屬和堿土金屬，目前用該法測定的元素為鈉、鉀、鈣。一.火焰光度計的測定原理：金屬元素（離子）經過燃燒的火焰激發(fā)出特異的發(fā)射光譜，如鈉的發(fā)射光譜為黃色，鉀的發(fā)射光譜為淡紅色。發(fā)射光譜的強度與物質的濃度在一定范圍內成線性關系，據(jù)此可以測定含量。將樣品制成溶液，借壓縮空氣吸入到火焰光度計的霧化器，并在火焰中噴為很細的微粒。,,溶液中含有各種不同的離子，激發(fā)出各自不同的光譜，但通過特異的濾光鏡可選擇需要的元素的譜線，譜線投射到光電池（管）上，產生電流，電流經放大后用電流計檢測。二.測定方法：（一）直接測定法：1.標準曲線法：用一系列稀釋的標準液在火焰光度計上測定，讀數(shù)繪制標準曲線，同法稀釋樣品后測定，查標準曲線求含量。2.比較法：用2個標準液，一個高濃度，一個低濃度，使樣品液的濃度介于兩者之間。通常,,,,,,,,第十章熒光分光光度法分析的原理一.熒光的發(fā)生：有些物質吸收紫外光照射后會發(fā)射出波長比照射光波長還長的光，稱為熒光和磷光。熒光和磷光有區(qū)別，分子的能量從激發(fā)態(tài)直接降落到基態(tài)發(fā)出的波長較長的光稱為熒光。分子的能量從激發(fā)態(tài)并不直接降落到基態(tài)，而是通過一個中間的亞穩(wěn)定狀態(tài)，稍停留后，再放出能量，下降到基態(tài)，發(fā)出的光稱為磷光。,熒光和磷光,第二電子激發(fā)態(tài)吸光無輻射躍遷第一電子激發(fā)態(tài)吸光熒光亞穩(wěn)態(tài)磷光基態(tài),,,,,,,,,,,,磷光的能量比熒光小，波長較熒光長。從激發(fā)到發(fā)光，熒光所需的時間較短，在激發(fā)光照射后10－8～10－14秒之間，磷光所需的時間較長，在激發(fā)光照射后10－4～10秒以上。本章主要介紹熒光光度分析法。照射物質的紫外光稱為激發(fā)光，物質產生的熒光稱為發(fā)射光。同一分子結構物質，用同一波長的激發(fā)光照射，可以產生相同的熒光；同一物質濃度高時，產生的熒光強度也強，利用這個性質可以進行定量測定，稱為熒光光度分析法。熒光分析不是測定激發(fā)光的強弱，而是,,測定發(fā)射光的強弱，所以屬于發(fā)射光譜分析法。二.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜（熒光光譜）：如果將激發(fā)光源用單色器分光，讓它發(fā)出一系列波長連續(xù)變化的光譜（像在紫外光譜分析中，從200～400nm連續(xù)掃描），測定物質吸收每一波長的激發(fā)光后所發(fā)出的熒光強度，得到的光譜圖稱為激發(fā)光譜（excitationspectrum，簡寫Ex），激發(fā)光譜實際是熒光物質的吸收光譜。激發(fā)光譜中吸收最高的波長能使熒光物質發(fā)出最強的熒光，故稱為最大激發(fā)波長，用λex表示，一般要用它激發(fā)熒光。,,再使激發(fā)光的波長和強度不變，一直照射在熒光物質上，把產生的熒光通過單色器色散，變成連續(xù)變化波長的熒光，照射在光電接受管上，在一定范圍內記錄其熒光強度的變化，以波長變化和相應的熒光強度作圖，稱為熒光發(fā)射光譜或簡稱發(fā)射光譜（fluorescencespectrum簡寫：Em）。再以最大激發(fā)波長照射，測定熒光發(fā)射光譜，產生最大熒光強度的波長又稱為最大發(fā)射波長，用λem表示。一般分子熒光的發(fā)射波長總是大于激發(fā)波長。下圖是硫酸奎寧在硫酸中的激發(fā)光譜和熒光光譜。,硫酸奎寧的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜,,三.熒光定量分析的原理：熒光強度（If）和激發(fā)光的強度（I0）、物質的熒光效率（φf）成正比：If=I0φf---------------------①對待測溶液，設I0為入射光（激發(fā)光）強度，It為透射光強度，Ia為吸光強度，If為熒光強度，C為熒光物質濃度，L為溶液厚度(比色杯直徑）E為吸光系數(shù)。溶液被入射光激發(fā)以后，可以向各個方I0It向發(fā)出熒光強度而且激發(fā)光的一部分能量可以透過溶液If，因此從透射光的方向,,,,,,記錄熒光強度是錯誤的，一般是從激發(fā)光源垂直的方向記錄熒光強度。根據(jù)比爾定律，Ia=I0－It=I0(1－10－ECL)=I0(1－e－2.3ECL)--------②溶液的熒光強度If與吸收的光能Ia成正比，則If=φfIa=φfI0(1－e－2.3ECL)，φf為常數(shù)，而e－2.3ECL=1－2.3ECL+(－2.3ECL)2/2！若濃度C很小，L為1cm，ECL的值也很小，當ECL≤0.05時，③式中第二項以后可忽略，所以If=φfI0(1－e-2.3ECL)=φfI0[1－(1－2.3ECL)]=φfI02.3ECL，當I0和L一定時，φf和E也是常數(shù)，以K表示，則If=KC,,上式說明熒光強度與熒光物質濃度成線性關系,而且增大入射光強度，可以增大熒光強度。對于較濃的溶液，由于熒光熄滅等原因，熒光強度與熒光物質濃度不成線性關系。四.熒光分析的方法：1.根據(jù)上述特點，熒光分析必須在很小濃度下進行，其靈敏度可達0.1～1ng/ml。2.發(fā)射光譜圖形狀和激發(fā)波長無關，但熒光強度與激發(fā)波長有關，所以在熒光分析中一般都是固定一個熒光的發(fā)射波長，然后在一定波長范圍內掃描物質的激發(fā)光譜，再選擇λex做激,,發(fā)波長，測定溶液的熒光強度，進行定量分析。3.熒光分析一般采用標準曲線法，制作標準曲線和測定樣品時都要將空白液的熒光強度調到零，再測定各標準管和樣品的熒光強度。4.有些熒光物質的稀溶液在激發(fā)光照射下很容易分解而使熒光強度不斷降低，所以不能用激發(fā)光長時間照射溶液。熒光強度還受溫度、pH值、溶劑的很大影響，熒光光譜受水、乙醇、環(huán)己烷的干擾較大，而氯仿的干擾較小。5.熒光物質的濃度大于1mg/ml時，常常發(fā)生熒光自滅現(xiàn)象。,,產生熒光的有機物絕大多數(shù)是環(huán)狀化合物，如芳香環(huán)、苯類、菲類，還有不飽和雜環(huán)如喹啉、吲哚、長鏈共軛多烯烴，如VA、VB2等。許多有機物不產生熒光或熒光效率不高，可以把它們轉化為能產生熒光的物質或設法增強它們的熒光，如甾族化合物不發(fā)生熒光，用硫酸處理后可以轉化為熒光物質；有些無機物不產生熒光，可以和有機試劑結合生成產生熒光的絡合物進行分析。許多藥物中的胺類、甾體類、抗生素類、維生素類、氨基酸、蛋白質、酶都可以用熒光法分析。,