雙光子激光掃描熒光顯微鏡及其應(yīng)用

陳德強(qiáng)夏安軟王克逸"黃文浩“（中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)精密機(jī)械與精密儀器系 臺肥230026）文章對雙光子激光掃描熒光顯微錯的原理及其應(yīng)用進(jìn)倉了綜述雙光子激光掃描熒光顯微橋的本征的空 間三維成像特性廣泛應(yīng)用干生命科學(xué)、半導(dǎo)體和三維髙密度數(shù)據(jù)存諸及其微細(xì)加工的研究.雙光子激光掃描熒光顯微錯（TPLSM）洪焦.三維TVVO 一 PHOTON LASER SCANNING FLUORESCENCE MICROSCOPYAND ITS APPLICATIONSCHEN De-Qiang XIA ArrDong WAN G Kr Yi HUANG Weir Haof Department of Precision Machinery and hist rument at ion. University of Science and Technology of China. Hefei 230026）Abstract The principle of two plioton laser scanning fluorescence microscopy and its applications arc reviewed Its intrinsic three dimensional spatial resolution has been widely exploited in the life sciences .semiconducr tor technology .optical data storage and lithographic microfabrication.Key words two-plx）ton laser scanning fluorescence microscopy confocal Jhreedimension6 1994-2006 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved 6 1994-2006 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved 1引言近年來，光學(xué)顯微鏡技術(shù)中的一個最引人注目 的成就是雙光子激發(fā)現(xiàn)象(two-photon excitation ,fgf 稱TPE)在共焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy .簡稱CLSM)中的廣泛應(yīng)用.隨著 飛秒激光技術(shù)和光學(xué)顯微鏡技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)在人們 已經(jīng)能夠比較容易地制造并使用雙光子共焦激光掃 描顯微 (twerp ho ton laser scanning microscopy.筒 稱TPLSM)，對樣品在雙光子激發(fā)后發(fā)出的熒光進(jìn) 行觀察和三維成像.目前雙光子共焦激光掃描顯微鏡已成為半導(dǎo) 體制造和檢測、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究和三維髙密度存儲 及其微細(xì)加工的重要工具為開拓新學(xué)科和促進(jìn)科 學(xué)研究領(lǐng)域向更高層次發(fā)展起到了非常重要的作 用利用雙光子共焦激光掃描顯微鏡的特點揭示了 許多新現(xiàn)象和新規(guī)律本文擬對這一技術(shù)的原理、特 點和應(yīng)用進(jìn)行綜述. 232 2雙光子激發(fā)原理簡介在激光照射下，基態(tài)熒光分子或原子吸收一個 光子后成為激發(fā)態(tài)隨后又弛豫到某一基態(tài)同時以 光子形式釋放能量而發(fā)出熒光這一過程就是通常 的單光子激發(fā)情況.1931年.Maria GdppertMayer 預(yù)言一個分子或原子可以在同一個量子過程中，同 時吸收兩個光子而成激發(fā)態(tài)這種情況就是雙光子 激發(fā)過程|21. 1961 年.Kaiser 等在 CaF? :Eu2國家自然科學(xué)菱金和國家穀委田學(xué)回國人員科研啟動莖金停肋1999 - 06- 04收到初稿999 - 08- 27修回1中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)超化中心遶犍化學(xué)實鯊室容座人員物理ffi體 中首次觀察到了這種雙光子激發(fā)現(xiàn)象.圖1簡單 地描述了這種雙光子激發(fā)的過程.比如在單光子激 發(fā)情形,NADH酶在350nm的光激發(fā)下產(chǎn)生450nm 的熒光，而在雙光子激發(fā)情形.NADH酶則需同時 吸收兩個700nm的光子才能產(chǎn)生450nm的熒光.這 就是說，雙光子技術(shù)可以使我們無需使用紫外光源 就能達(dá)到檢測紫外熒光探針的目的.由于雙光子激 發(fā)所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與激發(fā)光的光強(qiáng)平方成正比, 因而與單光子激發(fā)的線性過程相比.雙光子激發(fā)就 需要很強(qiáng)的激發(fā)光強(qiáng)這就使雙光子激發(fā)具有很高 的空間局域特點圖2是單、雙光子激發(fā)所產(chǎn)生的熒 光形貌從圖2可以看出由于單光子激發(fā)的線性過 程在整個激發(fā)光路里的樣品都由于激發(fā)而發(fā)出熒 光.而對于雙光子激發(fā)而言，只有在焦點處的微小區(qū) 域內(nèi)樣品才能吸收足夠的雙光子而發(fā)出熒光將雙 光子激發(fā)的這一特點應(yīng)用到CLSM而產(chǎn)生的 TPLSM，可以獲得比單光子CLSM更清晰的三維熒 光圖像.另外，在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的三光子激發(fā) （熒光分子同時吸收3個光子）的LSM也越來越顯 示出其重要的持點，它具有比TPLSM更高的空間 局域性因而具有更髙的空間分辨率.單光子激發(fā)雙光子激發(fā)圖|單、雙光于滋歿過程示意田02單、雙光于激找所形成的熒光形貌（樣品為轡丹明B的水溶液 上為單光于滋發(fā)下為取光于滋歿）3材料的吸收截面吸收截面 是雙光子激發(fā)現(xiàn)象的重要參數(shù).它 的大小反映了分子吸收雙光子的本領(lǐng).對單光子激 發(fā)中的吸收截面 已有較為準(zhǔn)確的文獻(xiàn)記載而對 雙光子乃至多光子吸收截面目前尚缺乏全面、準(zhǔn) 確的記載.因此.對常用的熒光分子多光子吸收截面 和光譜的進(jìn)一步研究將有助于多光子激發(fā)共焦 激光掃描熒光顯微鏡的進(jìn)一步廣泛應(yīng)用.29卷（2000年）4期采用適當(dāng)階數(shù)的混沌理論可以對多光子吸收截 面做一簡單估算.顯然，多光子激發(fā)要求兩個 或多個光子被分子同時吸收，因而多光子的吸收截 面主要取決于激發(fā)光的空間和時間的相干特性.一 個分子的橫截面積”4可由它的偶極躍遷矩來估 算對偶極躍遷矩為10-8-10-9cm的分子典型的 4值為|0 ,6-10-,7cnr.光子符合的時間尺度由 虛擬中間態(tài)的持續(xù)時間厶決定由測不準(zhǔn)原理可 估計 10 ,6s.因此.由4込 得雙光子激發(fā)吸 收截面 大約為10-49cm4 光子相應(yīng)地由 4 ）2得三光子激發(fā)吸收截面 大約為10* 82cm6 s/光子由于在多光子激發(fā)過程中僅有一小部分 光子被吸收所以直接測量多光子吸收截面 往往 很困難.為了便于應(yīng)用.表1列出了幾種常見熒光分 子的吸收截面的值卩對于一個”光子的激發(fā)過 程.熒光分子的熒光強(qiáng)度正比于”/二因而由表1 可見在相同的激發(fā)光強(qiáng)（心丿下，雙光子激發(fā)吸收 截面2和三光子激發(fā)吸收截面3比單光子激發(fā)吸 收截面要小得多.因此多光子激發(fā)要求的入射 光強(qiáng)比單光子激發(fā)大得多.表1幾種常見熒光分干的單光于、雙光于 和三光子的吸收截面熒光分于i( /nm) /10- l6cm22(700nm) /10 50cn? s /光子"00nm)/l0 83cm6 E/光于$DA PI freeL 3(345nm)0. 160. 25Dansyl0. 17(336nm>10.3Fura 2+Ca2*1.2f335nm)1230Fiirn 2 frtv1 Of 362nm)1120Indo 11.3f340nm)1.56Indo I free1.3f345nm)3.52表中數(shù)據(jù)是在IO-4ni>l/L的溶液中測得的，建熒光分于的熒光 衛(wèi)子效率4共焦激光掃描熒光顯微鏡原理共焦激光掃描熒光顯微鏡技術(shù)的發(fā)展是光學(xué)顯 微鏡技術(shù)的一次革命".它是以光學(xué)系統(tǒng)的共焦 成像為基礎(chǔ)利用光掃描技術(shù)和樣品掃描技術(shù)對樣 品進(jìn)行三維動態(tài)測量的裝置.它利用激光作為光源 在光學(xué)設(shè)計時采用共扼焦點（共焦）技術(shù)使光源、 被照物點和探測器處在彼此對應(yīng)的共覘位置光源 經(jīng)物鏡在樣品內(nèi)聚焦成衍射極限的光點其熒光（或 反射光）再次通過物鏡或聚光鏡到達(dá)空間濾波器的 共焦針孔內(nèi).由靠近針孔后面的探測接收器接受倍 號通過掃描聚光點在樣品內(nèi)的位置對樣品進(jìn)行三 233 6 1994-2006 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved 維成像圖3為共焦激光掃描熒光顯微鏡的原理圖. 它的關(guān)鍵技術(shù)是共焦小孔(pinhole)的引入.由于共 焦小孔的存在.探測器只接收來自物鏡焦點處的信 光掃描顯微億要比常規(guī)光學(xué)顯微鏡的分辨率要高 些.且圖像清晰度也有所增強(qiáng)而且正是由于共焦小 孔的存在使之具有三維成像的特點這是常規(guī)光學(xué) 1994-2006 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved 1994-2006 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved 息焦點以外的光將全被共焦小孔屏蔽因而共焦激顯微鏡所不能比擬的.PMTS3共像熒光顯微弋原理圖 1994-2006 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved 自共焦激光掃描顯微鏡誕生以來其應(yīng)用大今 集中在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域.其特點主艮広現(xiàn)包咋品的反 射熒光的觀察由這遙因為：(1)反射熒光與常規(guī)顯 微鏡相比更容易得列鬲清晰度和髙分辨率的三維圖 像；(2)便于保持理想的共焦光學(xué)系統(tǒng)移動試樣和 進(jìn)行三維掃描但是在多光子激發(fā)應(yīng)用到共焦激光 掃描顯微前，由于光損害、光降解、光漂白等原因，以 及顯微鏡本身復(fù)雜的紫外光學(xué)元件的限制，共焦激 光掃描顯微鏡不能得到更廣泛的應(yīng)用，其特點和潛 力沒有完全發(fā)揮出來.1990年.美國康奈爾大學(xué)Denk等人提出將雙 光子激發(fā)現(xiàn)象應(yīng)用到共焦激光掃描熒光顯微鏡 中從而為共焦激光掃描顯微鏡的更廣泛應(yīng)用開 辟了道路雙光子激發(fā)共焦激光掃描熒光顯微鏡較 好地克服了單光子激發(fā)共焦激光掃描熒光顯微鏡的 缺點,而且有著較高的空間分辨率.由同時吸收2個 以上的光子組成的多光子激發(fā)激光掃描熒光顯微鏡 超過了常規(guī)的單光子共焦熒光顯微億的分辨極限. 目前多光子激發(fā)共焦激光掃描熒光顯微鏡已引起 了各國學(xué)者的廣泛注意和興趣.同常規(guī)的單光子激發(fā)共焦激光掃描熒光顯微鏡 相比.雙光子共焦激光掃描熒光顯微鏡光源多采用 鎖模的飛秒鈦寶石激光器以得到足夠強(qiáng)的激光，保 證對樣品進(jìn)行雙光子激發(fā)考慮到顯微鏡內(nèi)復(fù)雜的 光學(xué)元件對飛秒脈沖的影響可以在光路中插入腔 外脈沖壓縮器.對超快激光在物鏡焦點處的脈沖展 寬和脈沖畸變進(jìn)行優(yōu)化和壓縮從卩另外，由于材料 234的戲光子吸收強(qiáng)烈地與激發(fā)光強(qiáng)的平方相關(guān).因而 在緊聚焦的條件下雙光子吸收僅局域于物鏡焦點 處的空間體積的小范圍內(nèi)使人們可以或甚至 不使用共焦小孔就能得到髙清晰的三維圖像使共 焦顯微鏡的設(shè)計大為簡化.易于操作這是多光子激 發(fā)的一大優(yōu)勢圖4是雙光子激發(fā)共焦激光掃描熒 光顯微鏡的配置圖.XY掃描04常見的雙光于滋發(fā)共焦滋光掃描熒光顯微飩的配暨圖5雙光子激發(fā)共焦激光掃描熒光顯微鏡的 特點正如前述在單光子激發(fā)情況下熒光波長比激 發(fā)浪長大而且熒光量子效率與入射光強(qiáng)度成正比,物理 同時在透過樣品的整個激發(fā)光路上都產(chǎn)生了單光 子激發(fā)現(xiàn)象另外在生物醫(yī)學(xué)研究中，為了獲得足 夠精度的數(shù)據(jù)以進(jìn)行定量分析用作標(biāo)記的熒光劑 或試樣本身的激發(fā)和熒光波長往往在紫外和近紫外 波段比如NADH酶的熒光峰為450nm .且必須用 350nm的激光激發(fā)然而.這種波長的紫外光對生 物組織常常是有害的.同時在研究生物體組織的熒 光成像時人們有時必須使用25OTOOnm的激發(fā) 光這就要求使用復(fù)雜的紫外波段的物鏡和紫外光 學(xué)元件這給實驗帶來很大的麻煩.而對于雙光子激發(fā)過程.因為每個雙光子事件 都必須有兩個光子同時被吸收，所以可以用溫和的 紅外或近紅外激光來激發(fā)通常吸收紫外或遠(yuǎn)紫外波 段的熒光分子例如對NADH酚.可用700nm的激 光來激發(fā)得到450nm的熒光這樣用較長波長的光 來激發(fā)樣品，可以避免紫外光對樣品的傷害和使用 復(fù)雜的紫外光學(xué)元件的許多限制同時可以延長對 活體生物樣甜的觀察時間這為研究氨莖空、蛋白質(zhì) 和神經(jīng)遞f$（ncurotran：P!t*ei? t供了孫恃而重棗 的方法.另外.紅外激光具有相對較深的傳播距離使得 雙光子激發(fā)共焦激光掃描熒光顯微鏡可對渾濁的樣 品表面以下校深（20Qi m）處進(jìn)行成像觀察I1而 且由于熒光波長比入射的激光波長短得多，所以由 瑞利和拉曼散射導(dǎo)致的背景干擾可以忽略，這樣就 可以進(jìn)行極其靈敏的測量如單個分子的檢測（山和 少量熒光標(biāo)記的神經(jīng)遞體的檢測.同時使用功率幾十毫瓦.脈寬為飛秒量級的鎖 模鈦寶石激光器作為激發(fā)光源，可以比較容易產(chǎn)生 強(qiáng)度足夠強(qiáng)的激光且在物鏡焦點處的激光強(qiáng)度與 束腰距離的平方成正比雙光子激發(fā)過程被緊緊局 域在焦點附近的很小區(qū)域（體積數(shù)量級為）如此 小的有效作用體積不僅使雙光子熒光顯微鏡具有極 其優(yōu)越的空間分辨率而且為在亞微米尺度上進(jìn)行 三維定位的光化學(xué)反應(yīng)?。┖腿S高密度數(shù)據(jù)存儲 及其微細(xì)加工山T8I提供了前所未有的強(qiáng)大工具.6雙光子共焦激光掃描熒光顯微鏡的應(yīng)用TPLSM自1990年誕生以來已被廣泛地應(yīng)用 于生命科學(xué)、半導(dǎo)體、化學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和三維高密度 存儲及微細(xì)加工的研究由于篇幅所限這里只作簡 單介紹讀者可以從近年來已發(fā)表的大量文獻(xiàn)中獲 得有關(guān)TPLSM應(yīng)用的信息.29卷（2000年）4期6. 1鈣離子作為第二信使具有重要作用它能通過 依賴于鈣的蛋白激酶使蛋白質(zhì)磷酸化并可以調(diào)節(jié) 其他離子的細(xì)胞通透性.目前尚不清楚Ca*離子進(jìn) 入細(xì)胞內(nèi)儲存與作用的部位.對神經(jīng)元中鈣離子的 研究已成為神經(jīng)生物學(xué)中越來越重要的課題在電 流脈沖的刺激下鈣離子的濃度發(fā)生變化，打開鈣離 子通道，細(xì)胞膜或其內(nèi)部結(jié)構(gòu)釋放出鈣離子對鈣離 子作標(biāo)記后鈣離子濃度的變化表現(xiàn)為熒光的強(qiáng)弱. 康奈爾大學(xué)的Webb及其合作者I研究了不同細(xì) 胞鈣離子釋放的動力學(xué)情況獲得了毫秒量級下鈣 離子濃度的變化的圖像貝爾實驗室的Svoboda等 人研究了活體大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的鈣離子 動力學(xué)情形對活老鼠大腦作標(biāo)記后撥弄老鼠的胡 須以產(chǎn)生刺激觀察到發(fā)生在大腦細(xì)胞神經(jīng)元間突 觸的活動成像深度可深達(dá)大腦表面下24Q1 m.他 們發(fā)現(xiàn)在特定區(qū)域的鈣離子數(shù)與鈉離子作用電勢成 正比.而且鈣離子數(shù)在最近的枝狀體頂端處最大，隨 著髙開觸發(fā)肌體的距離而急劇下降從而證明了鈣 離子的増加依賴于由肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢. 6.2現(xiàn)代社會是信息社會飛速發(fā)展的信息技術(shù)產(chǎn) 生了大量的倍息也帶來了如何存儲它的問題從某 種意義上說存儲技術(shù)是佰息技術(shù)發(fā)展的瓶頸現(xiàn)有 的密度最高的存儲技術(shù)是以光盤為代表的光存儲方 法傳統(tǒng)的二維光存儲方法使用可見光或紅外光，在 衍射極限內(nèi)可以實現(xiàn)大約108bits/cnr的數(shù)據(jù)密度 存儲.1989年.美國科學(xué)家Rentzepis教授提出了一 種三維bit數(shù)據(jù)存儲的方法I*",存儲密度高達(dá) 10,2bits/cm3.這種方法主要是在現(xiàn)有二維光盤的基 礎(chǔ)上將數(shù)據(jù)存儲擴(kuò)展到三維空間.由于這種方法保 持了現(xiàn)有光盤系統(tǒng)的基本特點易于操作隨著半導(dǎo) 體激光的快速發(fā)展三維高密度存儲是目前科學(xué)界 和工業(yè)界最為看好的一個發(fā)展方向.由于前述雙光 子激發(fā)具有有效作用體積小的特點避免了層與層 間的相互干擾極大地提高了數(shù)據(jù)存儲密度.目前, 在共焦激光掃描顯微鏡基礎(chǔ)上發(fā)展起來的利用雙光 子激發(fā)現(xiàn)象實現(xiàn)三維髙密度數(shù)據(jù)存儲的方法有多 種這些方法都是利用超快激光與材料的相 互作用后形成的折射率變化（或者熒光的變化）來實 現(xiàn)光學(xué)數(shù)據(jù)的存儲.由于它容易與現(xiàn)有的淀轉(zhuǎn)圓盤 （如光盤）式存儲技術(shù)兼容，從而為利用現(xiàn)有技術(shù)大 規(guī)模開發(fā)和生產(chǎn)這種三維高密度存儲設(shè)備提供了技 術(shù)上的可行性具有開闊的研究和應(yīng)用前景. 235 另外利用雙光子激發(fā)具有高度局域的特點還 可用來實現(xiàn)三維任意方向的微細(xì)加工由于在緊聚 焦的條件下雙光子吸收僅局域于焦點處的空間體 積3的小范圍內(nèi)化學(xué)和物理過程就發(fā)生在這一 局域的體積內(nèi)，這一局域的體積內(nèi)的材料吸收雙光 子后材料就會變成液體或氣體，或收縮或膨脹，以 及發(fā)生其他可能的變化而焦點外的其他區(qū)域則不 發(fā)生任何變化正是由于這一重要作用人們可以利 用通過移動焦點在樣品內(nèi)的位置來進(jìn)行三維任意方 向的微細(xì)加工(niicrofabrication)和海量光學(xué)數(shù)據(jù)存 儲的工作.Cumpston及其合作者利用雙光子激發(fā) 的方式成功地制造出具有獨特光學(xué)特性的光子帶隙 (photonic bandgap ,PBG)材料.重復(fù)周期為 m.同 時還加丄出徳型i皮導(dǎo)管.其誠面積從IO(P m X 10Q1 m變化至工m XlQi m.其制造原理是利用材料 在雙光子激發(fā)下發(fā)生雙光子誘導(dǎo)聚合(wo photon -initiated polymerization , TP1P)現(xiàn)象、導(dǎo)致材料溶 解度的變化事先根據(jù)需要的三維形狀利用經(jīng)物鏡 聚焦的激光點對材料進(jìn)行三維掃描激光點掃到船 位置其材料的溶解度提高將其溶解掉就得到了所 需形狀的物體這種方法與常規(guī)的2.5維的微細(xì)加 工不同I它是真正的三維任意方向上的微細(xì)加工 新方法它開辟了三維微細(xì)加工的新途徑圖5為他 們利用雙光子激光掃描熒光顯微鏡得到的一些三維 微結(jié)構(gòu)圖.圖5利用雙光于徽細(xì)加工方法導(dǎo)到的三維微細(xì)結(jié)構(gòu)圖()PBG結(jié)構(gòu);(b)為(a)圖放大的頂視(S：(c)tt形波導(dǎo)管:W)懸彎結(jié)構(gòu)陣列7結(jié)束語雙光子共焦激光掃描顯微鏡已延伸到各個研究 和應(yīng)用領(lǐng)域它能對處在自然狀態(tài)下的樣品進(jìn)行三 維無損觀察.并能提高系統(tǒng)的分辨率和佰噪比利用 雙光子激發(fā)后材料性質(zhì)的變化，還可以實現(xiàn)三維高 度數(shù)據(jù)存儲和三維任意方向的微細(xì)加工具有很高 的應(yīng)用價值可以相信隨著與雙光子共焦顯微鏡相 關(guān)的機(jī)械、材料、激光技術(shù)等的進(jìn)一步發(fā)展雙光子 共焦激光掃描顯微鏡將得到更大的發(fā)展和更廣泛的 應(yīng)用.I 1 Denk W .Webb W W .Strickler J H. 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