雙光子激光掃描熒光顯微鏡及其應用

《雙光子激光掃描熒光顯微鏡及其應用》由會員分享，可在線閱讀，更多相關《雙光子激光掃描熒光顯微鏡及其應用（7頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

1、陳德強夏安軟王克逸"黃文浩“ （中國科學技術大學精密機械與精密儀器系 臺肥230026） 文章對雙光子激光掃描熒光顯微錯的原理及其應用進倉了綜述?雙光子激光掃描熒光顯微橋的本征的空 間三維成像特性廣泛應用干生命科學、半導體和三維髙密度數(shù)據(jù)存諸及其微細加工的研究. 雙光子激光掃描熒光顯微錯（TPLSM）洪焦.三維 TVVO 一 PHOTON LASER SCANNING FLUORESCENCE MICROSCOPY AND ITS APPLICATIONS CHEN De-Qiang XIA ArrDong WAN G Kr Yi HUANG Weir Hao f Departm

2、ent of Precision Machinery and hist rument at ion. University of Science and Technology of China. Hefei 230026） Abstract The principle of two ? plioton laser scanning fluorescence microscopy and its applications arc reviewed ? Its intrinsic three dimensional spatial resolution has been widely explo

3、ited in the life sciences .semiconducr tor technology .optical data storage and lithographic microfabrication. Key words two-plx）ton laser scanning fluorescence microscopy ?confocal Jhreedimension 6 1994-2006 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved? 6

4、 1994-2006 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved? 1引言 近年來，光學顯微鏡技術中的一個最引人注目 的成就是雙光子激發(fā)現(xiàn)象(two-photon excitation ,fgf 稱TPE)在共焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy .簡稱CLSM)中的廣泛應用⑴.隨著 飛秒激光技術和光學顯微鏡技術的發(fā)展?現(xiàn)在人們 已經(jīng)能夠比較容易地制造并使用雙光子共焦激光掃 描顯微 (twerp ho ton laser scanni

5、ng microscopy.筒 稱TPLSM)，對樣品在雙光子激發(fā)后發(fā)出的熒光進 行觀察和三維成像. 目前?雙光子共焦激光掃描顯微鏡已成為半導 體制造和檢測、生物學、醫(yī)學研究和三維髙密度存儲 及其微細加工的重要工具?為開拓新學科和促進科 學研究領域向更高層次發(fā)展起到了非常重要的作 用?利用雙光子共焦激光掃描顯微鏡的特點揭示了 許多新現(xiàn)象和新規(guī)律?本文擬對這一技術的原理、特 點和應用進行綜述. ? 232 ? 2雙光子激發(fā)原理簡介 在激光照射下，基態(tài)熒光分子或原子吸收一個 光子后成為激發(fā)態(tài)?隨后又弛豫到某一基態(tài)?同時以 光子形式釋放能量而發(fā)出熒光?這一過程就是通常 的單光子激發(fā)情況.19

6、31年.Maria Gdppert?Mayer 預言一個分子或原子可以在同一個量子過程中，同 時吸收兩個光子而成激發(fā)態(tài)?這種情況就是雙光子 激發(fā)過程|21. 1961 年.Kaiser 等在 CaF? :Eu2國家自然科學菱金和國家穀委田學回國人員科研啟動莖金停肋 1999 - 06- 04收到初稿」999 - 08- 27修回 1＞中國科學技術大學超化中心遶犍化學實鯊室容座人員 物理 ffi體 中首次觀察到了這種雙光子激發(fā)現(xiàn)象⑶.圖1簡單 地描述了這種雙光子激發(fā)的過程.比如在單光子激 發(fā)情形,NADH酶在350nm的光激發(fā)下產(chǎn)生450nm 的熒光，而在雙光子激發(fā)情形.NADH酶則需同

7、時 吸收兩個700nm的光子才能產(chǎn)生450nm的熒光.這 就是說，雙光子技術可以使我們無需使用紫外光源 就能達到檢測紫外熒光探針的目的.由于雙光子激 發(fā)所產(chǎn)生的熒光強度與激發(fā)光的光強平方成正比, 因而與單光子激發(fā)的線性過程相比.雙光子激發(fā)就 需要很強的激發(fā)光強?這就使雙光子激發(fā)具有很高 的空間局域特點?圖2是單、雙光子激發(fā)所產(chǎn)生的熒 光形貌?從圖2可以看出?由于單光子激發(fā)的線性過 程?在整個激發(fā)光路里的樣品都由于激發(fā)而發(fā)出熒 光.而對于雙光子激發(fā)而言，只有在焦點處的微小區(qū) 域內(nèi)樣品才能吸收足夠的雙光子而發(fā)出熒光將雙 光子激發(fā)的這一特點應用到CLSM而產(chǎn)生的 TPLSM，可以獲得比單光子CLSM

8、更清晰的三維熒 光圖像.另外，在此基礎上發(fā)展起來的三光子激發(fā) （熒光分子同時吸收3個光子）的LSM也越來越顯 示出其重要的持點，它具有比TPLSM更高的空間 局域性⑶?因而具有更髙的空間分辨率. 單光子激發(fā) 雙光子激發(fā) 圖|單、雙光于滋歿過程示意田 02單、雙光于激找所形成的熒光形貌 （樣品為轡丹明B的水溶液 上為單光于滋發(fā)?下為取光于滋歿） 3材料的吸收截面 吸收截面 是雙光子激發(fā)現(xiàn)象的重要參數(shù).它 的大小反映了分子吸收雙光子的本領.對單光子激 發(fā)中的吸收截面 已有較為準確的文獻記載?而對 雙光子乃至多光子吸收截面?目前尚缺乏全面、準 確的記載.因此.對常用的熒光

9、分子多光子吸收截面 和光譜的進一步研究?將有助于多光子激發(fā)共焦 激光掃描熒光顯微鏡的進一步廣泛應用. 29卷（2000年）4期 采用適當階數(shù)的混沌理論可以對多光子吸收截 面做一簡單估算⑶.顯然，多光子激發(fā)要求兩個 或多個光子被分子同時吸收，因而多光子的吸收截 面主要取決于激發(fā)光的空間和時間的相干特性.一 個分子的‘橫截面積”4可由它的偶極躍遷矩來估 算對偶極躍遷矩為10-8-10-9cm的分子?典型的 4值為|0 ,6-10-,7cnr.光子符合的時間尺度由 虛擬中間態(tài)的持續(xù)時間厶決定?由測不準原理可 估計△ 10 ,6s.因此.由4込 得雙光子激發(fā)吸 收截面 大約為10-49cm4 光子

10、?相應地?由 4 ）2得三光子激發(fā)吸收截面 大約為10* 82cm6 ? s/光子?由于在多光子激發(fā)過程中?僅有一小部分 光子被吸收?所以直接測量多光子吸收截面 往往 很困難.為了便于應用.表1列出了幾種常見熒光分 子的吸收截面的值卩對于一個”光子的激發(fā)過 程.熒光分子的熒光強度正比于”/二?因而由表1 可見?在相同的激發(fā)光強（心丿下，雙光子激發(fā)吸收 截面2和三光子激發(fā)吸收截面3比單光子激發(fā)吸 收截面［要小得多.因此?多光子激發(fā)要求的入射 光強比單光子激發(fā)大得多. 表1幾種常見熒光分干的單光于、雙光于 和三光子的吸收截面 熒光分于 i( /nm) /10- l6cm2 2(700nm)

11、 /10 50cn? s /光子 "00nm) /l0 83cm6 E/光于$ DA PI free L 3(345nm) 0. 16 0. 25 Dansyl 0. 17(336nm> 1 0.3 Fura? 2+Ca2* 1.2f335nm) 12 30 Fiirn ? 2 frtv 1 ? Of 362nm) 11 20 Indo ? 1 1.3f340nm) 1.5 6 Indo ? I free 1.3f345nm) 3.5 2 ?表中數(shù)據(jù)是在IO-4ni>l/L的溶液中測得的，建熒光分于的熒光 衛(wèi)子效率 4共焦激光掃描熒光

12、顯微鏡原理 共焦激光掃描熒光顯微鏡技術的發(fā)展是光學顯 微鏡技術的一次革命".它是以光學系統(tǒng)的共焦 成像為基礎?利用光掃描技術和樣品掃描技術對樣 品進行三維動態(tài)測量的裝置.它利用激光作為光源? 在光學設計時?采用共扼焦點（共焦）技術?使光源、 被照物點和探測器處在彼此對應的共覘位置光源 經(jīng)物鏡在樣品內(nèi)聚焦成衍射極限的光點?其熒光（或 反射光）再次通過物鏡或聚光鏡到達空間濾波器的 共焦針孔內(nèi).由靠近針孔后面的探測接收器接受倍 號?通過掃描聚光點在樣品內(nèi)的位置對樣品進行三 ? 233 ? 6 1994-2006 China Academic Journal Electronic Publ

13、ishing House. All rights reserved? 維成像?圖3為共焦激光掃描熒光顯微鏡的原理圖. 它的關鍵技術是共焦小孔(pinhole)的引入.由于共 焦小孔的存在.探測器只接收來自物鏡焦點處的信 光掃描顯微億要比常規(guī)光學顯微鏡的分辨率要高 些.且圖像清晰度也有所增強?而且正是由于共焦小 孔的存在使之具有三維成像的特點?這是常規(guī)光學 1994-2006 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved? 1994-2006 China Acade

14、mic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved? 息?焦點以外的光將全被共焦小孔屏蔽因而共焦激 顯微鏡所不能比擬的. PMT S3共像熒光顯微弋原理圖 1994-2006 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved? 自共焦激光掃描顯微鏡誕生以來?其應用大今 集中在生物醫(yī)學領域.其特點主艮広現(xiàn)包咋品的反 射熒光的觀察

15、由這遙因為：(1)反射熒光與常規(guī)顯 微鏡相比更容易得列鬲清晰度和髙分辨率的三維圖 像；(2)便于保持理想的共焦光學系統(tǒng)?移動試樣和 進行三維掃描?但是在多光子激發(fā)應用到共焦激光 掃描顯微前，由于光損害、光降解、光漂白等原因，以 及顯微鏡本身復雜的紫外光學元件的限制，共焦激 光掃描顯微鏡不能得到更廣泛的應用，其特點和潛 力沒有完全發(fā)揮出來. 1990年.美國康奈爾大學Denk等人提出將雙 光子激發(fā)現(xiàn)象應用到共焦激光掃描熒光顯微鏡 中⑴?從而為共焦激光掃描顯微鏡的更廣泛應用開 辟了道路雙光子激發(fā)共焦激光掃描熒光顯微鏡較 好地克服了單光子激發(fā)共焦激光掃描熒光顯微鏡的 缺點,而且有著較高的空間分辨率

16、.由同時吸收2個 以上的光子組成的多光子激發(fā)激光掃描熒光顯微鏡 超過了常規(guī)的單光子共焦熒光顯微億的分辨極限. 目前?多光子激發(fā)共焦激光掃描熒光顯微鏡已引起 了各國學者的廣泛注意和興趣. 同常規(guī)的單光子激發(fā)共焦激光掃描熒光顯微鏡 相比.雙光子共焦激光掃描熒光顯微鏡光源多采用 鎖模的飛秒鈦寶石激光器以得到足夠強的激光，保 證對樣品進行雙光子激發(fā)?考慮到顯微鏡內(nèi)復雜的 光學元件對飛秒脈沖的影響?可以在光路中插入腔 外脈沖壓縮器.對超快激光在物鏡焦點處的脈沖展 寬和脈沖畸變進行優(yōu)化和壓縮從卩另外，由于材料 ?234? 的戲光子吸收強烈地與激發(fā)光強的平方相關.因而 在緊聚焦的條件下?雙光子吸收僅局域

17、于物鏡焦點 處的空間體積?的小范圍內(nèi)?使人們可以或甚至 不使用共焦小孔?就能得到髙清晰的三維圖像?使共 焦顯微鏡的設計大為簡化.易于操作?這是多光子激 發(fā)的一大優(yōu)勢?圖4是雙光子激發(fā)共焦激光掃描熒 光顯微鏡的配置圖. XY掃描 04常?見的雙光于滋發(fā)共焦滋光掃描熒光顯微飩的配暨圖 5雙光子激發(fā)共焦激光掃描熒光顯微鏡的 特點 正如前述?在單光子激發(fā)情況下?熒光波長比激 發(fā)浪長大?而且熒光量子效率與入射光強度成正比, 物理 同時?在透過樣品的整個激發(fā)光路上都產(chǎn)生了單光 子激發(fā)現(xiàn)象?另外?在生物醫(yī)學研究中，為了獲得足 夠精度的數(shù)據(jù)?以進行定量分析?用作標記的熒光劑 或試樣本身的激發(fā)

18、和熒光波長往往在紫外和近紫外 波段?比如NADH酶的熒光峰為450nm .且必須用 350nm的激光激發(fā)?然而.這種波長的紫外光對生 物組織常常是有害的.同時?在研究生物體組織的熒 光成像時?人們有時必須使用25OTOOnm的激發(fā) 光?這就要求使用復雜的紫外波段的物鏡和紫外光 學元件?這給實驗帶來很大的麻煩. 而對于雙光子激發(fā)過程.因為每個雙光子事件 都必須有兩個光子同時被吸收，所以可以用溫和的 紅外或近紅外激光來激發(fā)通常吸收紫外或遠紫外波 段的熒光分子?例如對NADH酚.可用700nm的激 光來激發(fā)得到450nm的熒光?這樣用較長波長的光 來激發(fā)樣品，可以避免紫外光對樣品的傷害和使用 復雜

19、的紫外光學元件的許多限制?同時可以延長對 活體生物樣甜的觀察時間?這為研究氨莖空、蛋白質(zhì) 和神經(jīng)遞f$（ncurotran＜：P!t*ei? t供了孫恃而重棗 的方法. 另外.紅外激光具有相對較深的傳播距離?使得 雙光子激發(fā)共焦激光掃描熒光顯微鏡可對渾濁的樣 品表面以下校深（＞20Qi m）處進行成像觀察I1?而 且由于熒光波長比入射的激光波長短得多，所以由 瑞利和拉曼散射導致的背景干擾可以忽略，這樣就 可以進行極其靈敏的測量?如單個分子的檢測（山和 少量熒光標記的神經(jīng)遞體的檢測⑷. 同時?使用功率幾十毫瓦.脈寬為飛秒量級的鎖 模鈦寶石激光器作為激發(fā)光源，可以比較容易產(chǎn)生 強度足夠強的激光

20、?且在物鏡焦點處的激光強度與 束腰距離的平方成正比?雙光子激發(fā)過程被緊緊局 域在焦點附近的很小區(qū)域（體積數(shù)量級為）?如此 小的有效作用體積不僅使雙光子熒光顯微鏡具有極 其優(yōu)越的空間分辨率?而且為在亞微米尺度上進行 三維定位的光化學反應?。┖腿S高密度數(shù)據(jù)存儲 及其微細加工山T8I提供了前所未有的強大工具. 6雙光子共焦激光掃描熒光顯微鏡的應用 TPLSM自1990年誕生以來已被廣泛地應用 于生命科學、半導體、化學、醫(yī)學領域和三維高密度 存儲及微細加工的研究?由于篇幅所限?這里只作簡 單介紹?讀者可以從近年來已發(fā)表的大量文獻中獲 得有關TPLSM應用的信息. 29卷（2000年）4期 6

21、. 1 鈣離子作為第二信使具有重要作用?它能通過 依賴于鈣的蛋白激酶使蛋白質(zhì)磷酸化?并可以調(diào)節(jié) 其他離子的細胞通透性.目前尚不清楚Ca*離子進 入細胞內(nèi)儲存與作用的部位.對神經(jīng)元中鈣離子的 研究已成為神經(jīng)生物學中越來越重要的課題在電 流脈沖的刺激下?鈣離子的濃度發(fā)生變化，打開鈣離 子通道，細胞膜或其內(nèi)部結構釋放出鈣離子?對鈣離 子作標記后?鈣離子濃度的變化表現(xiàn)為熒光的強弱. 康奈爾大學的Webb及其合作者I研究了不同細 胞鈣離子釋放的動力學情況?獲得了毫秒量級下鈣 離子濃度的變化的圖像?貝爾實驗室的Svoboda等 人研究了活體大腦皮層神經(jīng)元細胞內(nèi)的鈣離子 動力學情形?對活老鼠大腦作標記后?

22、撥弄老鼠的胡 須以產(chǎn)生刺激?觀察到發(fā)生在大腦細胞神經(jīng)元間突 觸的活動?成像深度可深達大腦表面下24Q1 m.他 們發(fā)現(xiàn)在特定區(qū)域的鈣離子數(shù)與鈉離子作用電勢成 正比.而且鈣離子數(shù)在最近的枝狀體頂端處最大，隨 著髙開觸發(fā)肌體的距離而急劇下降?從而證明了鈣 離子的増加依賴于由肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢. 6.2 現(xiàn)代社會是信息社會?飛速發(fā)展的信息技術產(chǎn) 生了大量的倍息?也帶來了如何存儲它的問題?從某 種意義上說?存儲技術是佰息技術發(fā)展的瓶頸?現(xiàn)有 的密度最高的存儲技術是以光盤為代表的光存儲方 法?傳統(tǒng)的二維光存儲方法使用可見光或紅外光，在 衍射極限內(nèi)可以實現(xiàn)大約108bits/cnr的數(shù)據(jù)密度 存儲

23、.1989年.美國科學家Rentzepis教授提出了一 種三維bit數(shù)據(jù)存儲的方法I*",存儲密度高達 10,2bits/cm3.這種方法主要是在現(xiàn)有二維光盤的基 礎上將數(shù)據(jù)存儲擴展到三維空間.由于這種方法保 持了現(xiàn)有光盤系統(tǒng)的基本特點?易于操作?隨著半導 體激光的快速發(fā)展?三維高密度存儲是目前科學界 和工業(yè)界最為看好的一個發(fā)展方向.由于前述雙光 子激發(fā)具有有效作用體積小的特點?避免了層與層 間的相互干擾?極大地提高了數(shù)據(jù)存儲密度.目前, 在共焦激光掃描顯微鏡基礎上發(fā)展起來的利用雙光 子激發(fā)現(xiàn)象實現(xiàn)三維髙密度數(shù)據(jù)存儲的方法有多 種這些方法都是利用超快激光與材料的相 互作用后形成的折射率變化（或

24、者熒光的變化）來實 現(xiàn)光學數(shù)據(jù)的存儲.由于它容易與現(xiàn)有的淀轉(zhuǎn)圓盤 （如光盤）式存儲技術兼容，從而為利用現(xiàn)有技術大 規(guī)模開發(fā)和生產(chǎn)這種三維高密度存儲設備提供了技 術上的可行性?具有開闊的研究和應用前景. ? 235 ? 另外?利用雙光子激發(fā)具有高度局域的特點還 可用來實現(xiàn)三維任意方向的微細加工?由于在緊聚 焦的條件下?雙光子吸收僅局域于焦點處的空間體 積?3的小范圍內(nèi)?化學和物理過程就發(fā)生在這一 局域的體積內(nèi)，這一局域的體積內(nèi)的材料吸收雙光 子后?材料就會變成液體或氣體，或收縮或膨脹，以 及發(fā)生其他可能的變化?而焦點外的其他區(qū)域則不 發(fā)生任何變化?正是由于這一重要作用?人們可以利 用通過移

25、動焦點在樣品內(nèi)的位置來進行三維任意方 向的微細加工(niicrofabrication)和海量光學數(shù)據(jù)存 儲的工作.Cumpston及其合作者⑼利用雙光子激發(fā) 的方式成功地制造出具有獨特光學特性的光子帶隙 (photonic bandgap ,PBG)材料.重復周期為 m.同 時還加丄出徳型i皮導管.其誠面積從IO(P m X 10Q1 m變化至工m XlQi m.其制造原理是利用材料 在雙光子激發(fā)下發(fā)生雙光子誘導聚合(wo? photon -initiated polymerization , TP1P)現(xiàn)象、導致材料溶 解度的變化?事先根據(jù)需要的三維形狀?利用經(jīng)物鏡 聚焦的激光點對材料進行

26、三維掃描?激光點掃到船 位置?其材料的溶解度提高?將其溶解掉就得到了所 需形狀的物體?這種方法與常規(guī)的2.5維的微細加 工不同I⑼?它是真正的三維任意方向上的微細加工 新方法?它開辟了三維微細加工的新途徑?圖5為他 們利用雙光子激光掃描熒光顯微鏡得到的一些三維 微結構圖. 圖5利用雙光于徽細加工方法導到的三維微細結構圖 (■)PBG結構;(b)為(a)圖放大的頂視(S：(c)tt形波導管: W)懸彎結構陣列  7結束語 雙光子共焦激光掃描顯微鏡已延伸到各個研究 和應用領域?它能對處在自然狀態(tài)下的樣品進行三 維無損觀察.并能提高系統(tǒng)的分辨率和佰噪比?利用 雙光子激發(fā)后材料性

27、質(zhì)的變化，還可以實現(xiàn)三維高 度數(shù)據(jù)存儲和三維任意方向的微細加工?具有很高 的應用價值?可以相信?隨著與雙光子共焦顯微鏡相 關的機械、材料、激光技術等的進一步發(fā)展?雙光子 共焦激光掃描顯微鏡將得到更大的發(fā)展和更廣泛的 應用. I 1 ] Denk W .Webb W W .Strickler J H. Science .1990.248 :73 — 76 [2 ] Geppert ? Mnyer M. Ann. Phys. .1931 .9:273 —295 (3 ) Kaiser W .Garret C GB. Phys. Rev. Lett. .1961 J :229 —231 I

28、4 1 Maiti S. Sliear J B . Webb W W “ al. Science . 1997.275 : 530 T32 I 5 1 XuC .Zpfel W .Shear J B et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA ? 1996 .93:10763—10768 [6 ) Anderson S G. Laser Rx?us World .1994 30:83—86 (7 ] Cannon J ?Armas M. Laser Rkus World .1993 .29:99 —104 I 8 J Soller C ?Cannell MB.E

29、ur.J. Physics .1996 .432 :555 T61 I 9 ] Curiey P F? Rrgusnn A I. Opt. Quant? Electr?? 1992.24 : 851 -859 (10| Swboda. K.Denk W . Kleinfeld D et al. Nature ? 1997.385 : 161 T65 (111 Nie S.Chiu D T.Zare R N. Science」994.266:1018 T021 |12| Denk W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA」994 .91 :6629 -6633 [13]

30、 Parthenopi)lou^ D A .Rentzq>isi P M. Science .1989 .245 :848 — 850 114 ] Strickler J H. Webb W W. Optics Letters .1991.16: 1780 — 1783 [15| Kiiwata Y.Ueki H .Hasliinioto Y <7 al. Appl? Opt. .1995 .34 : 4105-4111 (16| Xia A D ? Wada S ? Tashiro H. Appl. Phys. Lett.? 1998.73 : 1323 T 325 117| Xi

31、a A D. Wada S. Tashiro H」甲“n Patent J998.H10? 81598 (18| Cunipstom B H .Arunlhavd S P .Barlow S ct al. Nature .1999 . 398:51 -54 (19| Dixon GJ.Laser Rkus World .1997 33 :77 -82 [20] BustilloJ M .Hi)wc R T.Muller R S. Pnx. IEEE J998.86: 1552—1574 1994-2006 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved? 1994-2006 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved? 物理 ? 236 ? 1994-2006 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved?