高中生物《血紅蛋白的提取和分離》學(xué)案2新人教版選修

《高中生物《血紅蛋白的提取和分離》學(xué)案2新人教版選修》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《高中生物《血紅蛋白的提取和分離》學(xué)案2新人教版選修（8頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、 血紅蛋白的提取和分離 【課題目標(biāo)】 本課題通過(guò)嘗試對(duì)血液中血紅蛋白的提取和分離，使學(xué)生能夠體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取 生物大分子的基本過(guò)程和方法， 并了解色譜法、 電泳法等分離生物大分子的基本原理， 為今 后學(xué)習(xí)運(yùn)用這些技術(shù)打下基礎(chǔ)。 【課題重點(diǎn)與難點(diǎn)】 課題重點(diǎn)：凝膠色譜法的原理和方法。 課題難點(diǎn)：樣品的預(yù)處理；色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。 【導(dǎo)學(xué)誘思】 1．凝膠色譜法 凝膠色譜法也稱做 ，是根據(jù) 分離蛋白質(zhì)的有效方法。 凝膠實(shí)際上是一些由 構(gòu)成的多

2、孔球體， 在小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道， 相 對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子通過(guò)凝膠時(shí)速度不同，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì) 進(jìn) 入凝膠內(nèi)部的通道，路程 ，移動(dòng)速度 ；而相對(duì)分子質(zhì)量 的蛋白質(zhì) 無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在 移動(dòng)，路程 ，移動(dòng)速度 。 相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。 2．緩沖溶液 緩沖溶液的作用是 。 緩沖溶液通常由 溶解于水中配制而成的。 生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué) 反應(yīng)都是在一定的 pH 下進(jìn)行的，例如：血漿的 pH 是 ，要在實(shí)驗(yàn)條件下準(zhǔn)確 模擬生物體內(nèi)的過(guò)程，必須保持體外的 pH 與體內(nèi)的基本一致。 3．

3、電泳 電泳是指 。許多重要的生物大分子， 如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的 pH 下，這些基團(tuán)會(huì)帶上 。在 電場(chǎng)的作用下， 這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷 的電極移動(dòng)。 電泳利用了待分離 樣品中各分子 以及分子本身的 、 的不同， 使帶電分子產(chǎn)生 不同的 ，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。 兩種常用的電泳方法是 和 ，在測(cè)定蛋白質(zhì)分子 量時(shí)通常使用 。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移 率取決于 以及 等因素。 4．蛋白質(zhì)的提取和分離 蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步： 、 、 和 。 5．樣品處理 血液由 和 組成，其

4、中紅細(xì)胞最多。紅細(xì)胞具有 的特點(diǎn)。紅細(xì)胞中有一種非常重要的蛋白質(zhì) ，其作用是 ，血紅蛋白有 個(gè)肽鏈組成， 包括 ，其中每條肽 用心 愛心 專心 1 鏈環(huán)繞一個(gè) ，磁基團(tuán)可攜帶 。血紅蛋白因含有 呈現(xiàn)紅 色。 紅細(xì)胞的洗滌 洗滌紅細(xì)胞的目的是 ，采 集的血樣要及時(shí)采用 分離紅細(xì)胞，然后用膠頭吸管吸出上層透明的 ， 將下層暗紅色的 倒入燒杯， 再加入 ，緩慢攪拌 ，低速短時(shí) 間離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至 ，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。 血紅蛋白的釋放 在

5、 和 作用下，紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。 分離血紅蛋白溶液 將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為 4 層。第一層 為無(wú)色透明的 ，第 2 層為白色薄層固體， 是 ，第 3 層是紅色透明液體， 這是 ，第 4 層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過(guò)濾，除 去之溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。 透析 取 1mL 的血紅蛋白溶液裝入 中，將透析袋放入盛有 300mL 的物質(zhì)的量 的濃度為 20mmol/L 的 中，透析 12h 。透析可以去除樣品中 的雜質(zhì)， 或用于更換樣品的 。

6、 6．凝膠色譜操作 第一步要制作 ，第二步要 ，因?yàn)? ，所以裝 柱前需要根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計(jì)算所需要的凝膠量。 在裝填凝膠柱時(shí)， 不得有 存在。 因?yàn)闅馀輹?huì) ，降低分離效果。第三步是 。 【疑難點(diǎn)撥】 1． 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理 凝膠色譜法也稱為分配色譜法， 它是根據(jù)分子量的大小分離蛋白質(zhì)的方法之一。 所用的 凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體， 這些小球體大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成， 小球體內(nèi)部 有許多貫穿的通道， 當(dāng)一個(gè)含有各種分子的樣品

7、溶液緩慢流經(jīng)時(shí)， 各分子在色譜柱內(nèi)進(jìn)行兩 種不同的運(yùn)動(dòng)， 即垂直向下的運(yùn)動(dòng)和無(wú)規(guī)則的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)， 相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不 能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間， 通過(guò)的路程較短，移動(dòng)速度較快；相對(duì)分子質(zhì) 量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道，通過(guò)的路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢。因此， 樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出， 相對(duì)分子質(zhì)量中等的分子后流出， 相對(duì)分子質(zhì)量 最小的分子最后流出，這種現(xiàn)象又叫分子篩現(xiàn)象。 此外， 凝膠本身具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)， 相對(duì) 分子質(zhì)量大的分子通過(guò)這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的空襲時(shí)阻力大， 而相對(duì)分子質(zhì)量小的分子通過(guò)時(shí)阻 力小，因此不同

8、分子量的蛋白質(zhì)分子可以獲得分離。 2．與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞的特點(diǎn)及這一特點(diǎn)對(duì)進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離的意義 哺乳動(dòng)物及人的成熟的紅細(xì)胞是雙面凹圓餅狀， 沒(méi)有細(xì)胞核和細(xì)胞器。 其含有的血紅蛋 白是有色蛋白， 因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過(guò)觀察顏色來(lái)判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集脫液。 這 使血紅蛋白的分離過(guò)程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。 3．電泳的作用及其原理 電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。 許多重要的生物大分子， 如氨基酸、 多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可解離基團(tuán)，它們?cè)谀硞€(gè)特定的

9、pH 下會(huì)帶上正電或 負(fù)電； 在電場(chǎng)的作用下， 這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)。 電泳技術(shù) 就是在電場(chǎng)的作用下， 利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、 形狀等性質(zhì) 的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的目的。 【典例解析】 用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí)，分子量大的蛋白質(zhì)（ D ） 用心 愛心 專心 2 A 路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢 B 路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較快 C 路程較短，移動(dòng)速度較慢 D 路程較短，移動(dòng)速度較快 解析： 在小球體內(nèi)部有許多貫穿

10、的通道， 當(dāng)相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)， 相對(duì)分 子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道， 路程較長(zhǎng)， 移動(dòng)速度較慢； 而相對(duì)分子質(zhì)量 較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快。 【課本問(wèn)題答案和提示】 （一）旁欄思考題 你能從凝膠色譜的分離原理分析為什么凝膠的裝填要緊密、均勻嗎？ 答：凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體，小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道。相對(duì)分子質(zhì) 量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部， 只能分布在顆粒之間， 通過(guò)的路程較短， 移動(dòng)速度較快；相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白

11、質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道，通過(guò)的路程較長(zhǎng)， 移動(dòng)速度較慢。 因此，樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出， 相對(duì)分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對(duì)分子質(zhì)量最小的分子最后流出， 從而使各種相對(duì)分子質(zhì)量不同的分子得以分離。如果凝膠裝填得不夠緊密、 均勻，就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無(wú)效的空隙， 使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過(guò)，攪亂洗脫液的流動(dòng)次序，影響分離的效果。 （二）練習(xí) 1．答：凝膠色譜法也稱為分配色譜法， 它是根據(jù)分子量的大小分離蛋白質(zhì)的方法之一。 所用的凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體， 這些小球體大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成， 小球 體內(nèi)部有許

12、多貫穿的通道， 當(dāng)一個(gè)含有各種分子的樣品溶液緩慢流經(jīng)時(shí)， 各分子在色譜柱內(nèi) 進(jìn)行兩種不同的運(yùn)動(dòng)， 即垂直向下的運(yùn)動(dòng)和無(wú)規(guī)則的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。 相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì) 分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過(guò)的路程較短， 移動(dòng)速度較快； 相對(duì) 分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道，通過(guò)的路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢。 因此， 樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出， 相對(duì)分子質(zhì)量中等的分子后流出， 相對(duì)分 子質(zhì)量最小的分子最后流出， 這種現(xiàn)象又叫分子篩現(xiàn)象。 此外，凝膠本身具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)， 相對(duì)分子質(zhì)量大的分子通過(guò)這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的空隙時(shí)阻力大，

13、 而相對(duì)分子質(zhì)量小的分子通過(guò) 時(shí)阻力小，因此不同分子量的蛋白質(zhì)分子可以獲得分離。 2．答：在一定范圍內(nèi)，能對(duì)抗外來(lái)少量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或稍加稀釋不引起溶液 pH 發(fā)生明 顯變化的作用叫做緩沖作用， 具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。 緩沖溶液通常是由一或兩 種化合物（緩沖劑）溶解于水中制得，調(diào)節(jié)緩沖劑的配比就可制得不同 pH 范圍的緩沖液。 緩沖溶液的作用是維持反應(yīng)體系的 pH 不變。在生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)過(guò)程都是 在精確的 pH 下進(jìn)行的，受到氫離子濃度的嚴(yán)格調(diào)控。為了在實(shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確地模擬生物 體內(nèi)的天然環(huán)境，就必須保持體外生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)

14、程有與體內(nèi)過(guò)程完全相同的 pH。 3．答：電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。許多重要的生物大分子， 如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可解離基團(tuán)，它們?cè)谀硞€(gè)特定的 pH 下會(huì) 用心 愛心 專心 3 帶上正電或負(fù)電； 在電場(chǎng)的作用下， 這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)。 電泳技術(shù)就是在電場(chǎng)的作用下， 利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、 形狀等性質(zhì)的差異， 使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度， 從而達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行分離、 鑒定或提純的目的。 4．答：血紅蛋白提

15、取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和 純度鑒定。 首先通過(guò)洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液， 即樣 品的處理； 再經(jīng)過(guò)透析去除分子量較小的雜質(zhì)， 即樣品的粗分離； 然后通過(guò)凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。 5．答：血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過(guò)觀察顏色來(lái)判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過(guò)程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。 參考資料 聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白純度 1．試劑的配制 （

16、1）丙烯酰胺和 N, N- 甲叉雙丙烯酰胺 用去離子水配制 29%（29 g/100 mL ，下同） 的丙烯酰胺和 1%的 N, N- 甲叉雙丙烯酰胺的貯存液。 由于丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在貯存過(guò)程中會(huì)分別緩慢轉(zhuǎn)變?yōu)楸┧岷碗p丙烯酸，這一反應(yīng)是由光或堿催化的。因此在每次使用前，應(yīng)核實(shí)溶液的 pH 不超過(guò) 7.0 ；并且應(yīng)將配制好的溶液置于棕色瓶中，室溫貯存，每隔幾個(gè)月須重新配制。 （2）十二烷基硫酸鈉（ SDS） 用去離子水配成 10%的貯存液，于室溫保存。 （3）用于制備分離膠和濃縮膠的 Tris 緩沖液 1.5 mol/L 、pH8.8 的 Tris 緩沖液（分離膠

17、緩沖液）； 1 mol/L 、 pH6.8 的 Tris 緩沖液（濃縮膠緩沖液）。 （ 4）TEMED(N,N,N′,N′ - 四甲基乙二胺 ) TEMED通過(guò)催化過(guò)硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合。 （ 5）過(guò)硫酸銨 用去離子水配制 10%的過(guò)硫酸銨溶液。 過(guò)硫酸銨提供驅(qū)動(dòng)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液須配制新鮮液。 （ 6）Tris —甘氨酸電泳緩沖液 25 mmol/L Tris ， 250 mmol/L 甘氨酸 (pH 8.3) ， 0.1%的 SDS。 （ 7）樣品處理液50 mmol/L Tri

18、s — HCl(pH 6.8) ， 100 mmol/L DTT( 巰基蘇糖醇 ) 或 用 5%的巰基乙醇， 2%的 SDS，0.1%的溴酚藍(lán)， 10%的甘油。 （ 8）染色液0.1% 的考馬斯亮藍(lán) R250， 40%的甲醇， 10%的冰醋酸。 用心 愛心 專心 4 （9）脫色液 10%的甲醇和 10%的冰醋酸。 由于制備凝膠的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，并且容易被皮膚吸收， 因此操作必須在通風(fēng)櫥內(nèi)或通風(fēng)處進(jìn)行。 TEMED和過(guò)硫酸胺對(duì)黏膜和上呼吸道組織、眼睛、皮膚等有很大的破壞

19、作用，吞服可致命。因此在進(jìn)行電泳操作時(shí)一定按照實(shí)驗(yàn)要求和步驟， 在老師的指導(dǎo)下完成。操作時(shí)要戴好一次性手套。 2．電泳 （1）根據(jù)廠家說(shuō)明書安裝電泳用的玻璃板。 （2）配制 SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠溶液。用去離子水 4.6 mL ， 30%的丙烯酰 胺 2.7 mL， 1.5mol 、 pH 8.8 的 Tris 緩沖液 2.5 mL，10%的 SDS 0.1 mL， 10%的過(guò)硫酸胺 0.1 mL， TEMED 0.006mL，混合均勻，迅速灌注在兩玻璃板的間隙中間，要留出灌注濃縮膠所需 空間 ( 梳子的齒長(zhǎng)再加 0.5 cm

20、)，再在膠液面上小心注入一層水（約高 2～3 mm），以阻止氧 氣進(jìn)入凝膠溶液。 （3）分離膠聚合完全后（約 30 min ），傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。 （4）配制 SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠溶液。用去離子水 2.7 mL ， 30%的丙烯酰 胺 0.67 mL ， 1.0 mol 、 pH 6.8 的 Tris 緩沖液 0.5 mL ， 10%的 SDS0.041 mL，10%的過(guò)硫酸胺 0.04 mL ， TEMED 0.004 mL，混合均勻，直接灌注在聚合的分離膠上，并立即在濃縮膠溶液 中插入干凈的梳子。 整個(gè)操作過(guò)程

21、應(yīng)注意避免氣泡的產(chǎn)生。 然后再補(bǔ)加濃縮膠溶液， 使其充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下聚合。 （5）在等待濃縮膠聚合時(shí)，可對(duì)樣品進(jìn)行處理。在電泳樣品中按 1∶1 體積比加入樣 品處理液，在 100 ℃溫度下加熱 3 min ，以使蛋白質(zhì)變性。 （ 6）濃縮膠聚合完全后（ 30 min），小心移出梳子。把凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入 Tris —甘氨酸電泳緩沖液。必須設(shè)法排出凝膠底部?jī)刹ＡО逯g的氣泡。 （ 7）按順序加樣，加樣量通常為 10～ 25 μ L。樣品可以多加幾個(gè)，例如，血漿樣品紅細(xì)胞破碎后 ( 即進(jìn)行凝膠色譜分離之前 ) 的樣品

22、和凝膠色譜分離之后的樣品。 （8）將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為 8 V/cm 。當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后， 把電壓提高到 15 V/cm ，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部上方約 1 cm 處，關(guān)閉電源。 （ 9）從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮刀撬開玻璃板。將緊靠最左邊一孔（第一槽）凝膠下部切去一角，以標(biāo)注凝膠的方位。 （ 10）將電泳凝膠片放在考馬斯亮藍(lán)染色液中染色 1～ 2 h。換脫色液脫色 3～10 h，其 間需多次更換脫色液至背景清楚。 脫色后， 可將凝膠浸于水中， 長(zhǎng)期封裝在塑料袋內(nèi)使其不 會(huì)降低染色強(qiáng)度。為保存永久性記錄，可

23、對(duì)凝膠進(jìn)行拍照，或?qū)⒛z干燥成膠片。 通過(guò)本實(shí) 驗(yàn)的電泳圖譜，可以看見提取的血紅蛋白的純度并不是很高。 用心 愛心 專心 5 【教學(xué)反思】 用心 愛心 專心 6