兔肝DNA的提取、二苯胺顯色法測

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1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,生物基因組序列比對分析，分子進(jìn)化,兔肝,DNA,的提取與二苯胺顯色法測定,DNA,含量,目的基因,SNP,位點(diǎn)的鑒定及其意義,綜合性設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)-5,此實(shí)驗(yàn)共包括如下三個部分,第一部分：生物基因組序列比對分析，分子進(jìn)化,第二部分：兔肝,DNA,的提取和測定,第三部分：目的基因,SNP,位點(diǎn)的鑒定及其意義,第一部分：生物基因組序列比對分析、分子進(jìn)化,全基因組序列數(shù)據(jù)的積累,使得不同生物之間的進(jìn)化關(guān)系可以從分子水平上進(jìn)行研究。不同于以往單純依賴于生物形態(tài)學(xué)特征,這種分析更加深刻更加本質(zhì)。利用分子序列使得我們可以研

2、究,從單細(xì)胞生物到植物、動物甚至人的進(jìn)化關(guān)系。,比較基因組學(xué),(Comparative Genomics),是基于基因組圖譜和測序基礎(chǔ)上，對已知的基因和基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，來了解基因的功能、表達(dá)機(jī)理和物種進(jìn)化的學(xué)科。利用模式生物基因組與人類基因組之間編碼順序上和結(jié)構(gòu)上的同源性，克隆人類疾病基因，揭示基因功能和疾病分子機(jī)制，闡明物種進(jìn)化關(guān)系，及基因組的內(nèi)在結(jié)構(gòu)。目前從模式生物基因組研究中得出一些規(guī)律：模式生物基因組一般比較小，但編碼基因的比例較高，重復(fù)順序和非編碼順序較少；其,GC%,比較高；內(nèi)含子和外顯子的結(jié)構(gòu)組織比較保守，剪切位點(diǎn)在多種生物中一致。,比較作圖就是利用共同的遺傳標(biāo)記（主要是分子

3、標(biāo)記、基因的,cDNA,克隆以及基因組克隆）對相關(guān)物種進(jìn)行物理或遺傳作圖，比較這些標(biāo)記在不同物種基因組中的分布情況，提示染色體或染色體片段上的同線性（,synteny,）,或共線性（,collinearity,），,從而對不同物種的基因組結(jié)構(gòu)及基因組進(jìn)化歷程進(jìn)行精確分析?；蚪M比較作圖的研究，不僅提示了同屬甚至同科物種基因組間的同源性和差異性，對不同物種在起源、演化過程中的變化的研究具有巨大的啟示作用。,比較作圖的研究意義在于：一、根據(jù)不同種的基因組基因及其排列順序的高度保守特點(diǎn)繪制而成的比較圖，可以研究和探明它們的進(jìn)化線索。廣泛的比較作圖可為多個種所用，建立它們之間的聯(lián)系框架或系統(tǒng)。,基因組

4、比對軟件,Mauve,http:/genome.lbl.gov/vista/index.shtml,VISTA,一個最基本的假設(shè)是地球上所有物種都有一個共同的祖先，從這個祖先開始以數(shù)狀形式發(fā)展，通常稱為生命之樹（,tree of life,）。,分子進(jìn)化研究的目的：通過序列同源性的比較，分析序列間的變化進(jìn)而了解基因的進(jìn)化以及生物系統(tǒng)發(fā)生的內(nèi)在規(guī)律。,分子進(jìn)化有兩個主要研究對象，以全基因組序列為研究對象分析物種進(jìn)化；以某基因在多個物種的同源序列為研究對象分析基因的進(jìn)化,分子進(jìn)化,末端,物種,中間枝條,根,末端分支,節(jié)點(diǎn),理論上，一個,DNA,序列在物種形成或基因復(fù)制時，分裂成兩個子序列，因此系統(tǒng)

5、發(fā)育樹一般是二歧的；,如果是一棵有根樹，則樹根代表在進(jìn)化歷史上是最早的、并且與其它所有分類單元都有聯(lián)系的分類單元，反映時間順序；,如果找不到可以作為樹根的單元，則系統(tǒng)發(fā)生樹是無根樹，反映距離；,從根節(jié)點(diǎn)出發(fā)到任何一個節(jié)點(diǎn)的路徑指明進(jìn)化時間或者進(jìn)化距離。,系統(tǒng)發(fā)生樹性質(zhì)：,基因分子進(jìn)化分析步驟,（1）以目的基因?yàn)榉N子序列，搜索其在其它物種中的同源序列,（2）將上述同源基因的核酸或蛋白序列作序列比對，,Clustal X,（3）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹：MEGA，PHYLIP，PAUP,（4）評價所建立的樹，分析其生物學(xué)意義,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)從動物組織中提取,DNA,及其含量、純度測定的原理和方法,掌握離心機(jī)

6、及島津,UV-120,的使用方法,第二部分：兔肝脫氧核糖核酸（DNA）的提取和測定,利用脫氧核糖核酸蛋白和核糖核酸在電解質(zhì)中不同的溶解度使二者分離，在0.15M的氯化鈉溶液中脫氧核糖核酸蛋白的溶解度最低。相反，核糖核蛋白能在0.15M氯化鈉中溶解，因此可利用不同濃度的氯化鈉溶液將核酸核蛋白、脫氧核糖核酸蛋白解離出來，而蛋白質(zhì)變性沉淀，再用氯仿異丙醇抽提，將蛋白質(zhì)沉淀除去，而DNA則溶解。,實(shí)驗(yàn)原理,實(shí)驗(yàn)操作,1.棄上清留沉淀,兔肝,稱取4 g 加,8ml 1X SSC,1X SSC洗,兩次,取8ml勻漿液,離 心,勻漿、過濾,2.棄上清留,沉淀,加至8ml,1X SSC,離 心,加至 8ml

7、0.15M,NaCl-0.1M,Na,2,EDTA,離 心,3.棄上清留沉淀,（脫氧核糖核蛋白）,加約2倍,體積,95%乙醇,沉淀,加 0.15M,NaCl-0.1M,Na,2,EDTA至4ml,攪拌10min,逐滴加入0.5ml,15%SDS,加1ml,5M NaCl,去塞！離心,加塞反復(fù),倒置抽提,10min,吸取上清液,勿吸到中間層！,等體積氯仿-異丙醇混合液,DNA析出,用玻棒挑出,挑取DNA至一離,心管(小燒杯)用10ml,0.01N NaOH溶解,重復(fù),一次,輕攪,10min,注意事項(xiàng),盡可能避免,DNA,的斷裂,1.,勻漿時應(yīng)保持低溫，且勻漿時間應(yīng)短；,2.,實(shí)驗(yàn)中使用的吸取,D

8、NA,水溶液的滴管口應(yīng)粗短并成鈍口。,保持,DNA,活性，避免酸堿或其他變性因素使,DNA,變性。,攪動不要太大，以免使,DNA,斷裂。,整個實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)在低溫條件下進(jìn)行。,攪拌時動作要輕，反復(fù)倒置抽提，不可激烈振蕩。,加入,15%SDS,時要慢，邊攪邊滴加（兩人配合）。,SDS,的溫度不能太低，易凝固。吸過,SDS,的吸管要及時清洗。,加入,CHCl,3,/IAA,液離心后，分為三層，由上到下為：無機(jī)相,-,蛋白相,-,有機(jī)相。,DNA,溶解在無機(jī)相中，吸取無機(jī)相時動作要輕，不要吸到蛋白相。,CHCl,3,/IAA,會溶解有機(jī)玻璃，用完后不能豎直放置在試管架上，必須沖洗干凈。,離心機(jī)的使用,打

9、開電源開關(guān)；,平衡放置離心管；蓋上蓋子。,調(diào)節(jié)時間旋鈕至,10min,；,緩慢調(diào)節(jié)速度旋鈕至,9,檔，每,5-10s,上升,1,檔；,離心完畢后機(jī)器自動停止，待完全停止后，打開蓋子取出離心管。,離心管必須平衡后，才能啟動離心機(jī)；,離心機(jī)的蓋子必須蓋緊；,離心過程中不要用重物撞擊離心機(jī)；,要等離心機(jī)完全停止轉(zhuǎn)動后再打開蓋子。,二苯胺顯色法測定DNA含量,DNA,的,-,脫氧核糖在酸性條件下轉(zhuǎn)變成,-,羥基,-r,酮基戊醛，與二苯胺共熱后形成藍(lán)色化合物，該化合物在595,nm,處最大吸收。,每,ml,含,20,400,g,范圍內(nèi)光密度與,DNA,的濃度成正比。反應(yīng)液中加入少量乙醛，可提高反應(yīng)的靈敏

10、度。,實(shí)驗(yàn)原理,取,8,支試管，按實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)的表格加入試劑。,加畢置沸水浴,10,分鐘，取出冷卻；以,0,號管（空白管）調(diào)零點(diǎn)，于,595nm,波長比色。,以光密度為縱坐標(biāo),，,DNA,含量（,g/ml,）,為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,.,將實(shí)驗(yàn)中所得到的兔肝,DNA,溶液作為待測樣品，取兩只試管，分別標(biāo)“,U”,和“,B”,，,按表加入試劑。,混勻，置沸水中,10min,取出冷卻。,在,595nm,處，以,B,管調(diào)零，測得待測液的光密度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相當(dāng)于該光密度值,DNA,的含量。,實(shí)驗(yàn)操作,核酸在220-320nm處呈特征性吸收，在260nm處有最大吸收，測A260/A280可得知核酸的

11、大致純度。,A260/A280,1.8 表示DNA純,1.8 RNA含量高,1.8 蛋白含量高,核酸紫外吸收光譜的測定,以0.01N NaOH 為空白管，在260nm和280nm波長處測定樣品液的吸光度，求出樣品液的A,260,/A,280,比值和DNA濃度。,實(shí)驗(yàn)操作,第三部分：目的基因SNP位點(diǎn)的鑒定及其意義,SNP(single nucleotide,polymophism,),即單核苷酸多態(tài)，是指群體中變異頻率大于,1%,的單個核苷酸改變而導(dǎo)致的核酸序列多態(tài)，包括置換、顛換、缺失和插入。,一般來說，一個,SNP,位點(diǎn)只有兩種等位基因，因此又叫雙等位基因。,SNP,在人基因組中的發(fā)生頻率

12、比較高，大約平均每,1000,個堿基中就有一個多態(tài)位點(diǎn)。,C C,A,T T G A C.,G G,T,A A C T G.,C C,G,T T G A C.,G G,C,A A C T G.,SNP對基因功能影響,根據(jù)在基因中的位置，,SNP,可分為基因編碼區(qū),SNP(coding SNP,cSNP,),、,基因內(nèi)含子區(qū),SNP,和基因調(diào)控區(qū),SNP(regulatory SNP,rSNP,),。,其中,cSNP,根據(jù)是否改變編碼的氨基酸又可分為同義,cSNP,(synonymous,cSNP,),和非同義,cSNP,(non-synonymous,cSNP,),。,非同義,cSNP,：，,

13、蛋白激酶,PRKCH,基因內(nèi)的一個非同義,cSNP(1425G/A),，,等位位點(diǎn)從,G,到,A,的改變可導(dǎo)致激酶的活力增強(qiáng)，進(jìn)而激活其信號通路，使患腦梗塞的風(fēng)險增加。,同義,cSNP,：,多向性耐藥基因,1(,MDR1,),第,3435,位的一個同義,SNP(3435C/T),可改變,MDR1,基因產(chǎn)物的功能。這種機(jī)制不是通過改變,mRNA,及蛋白的產(chǎn)量水平，而是通過改變,mRNA,的構(gòu)象、蛋白的折疊及細(xì)胞定位，進(jìn)而影響基因功能的發(fā)揮。,內(nèi)含子區(qū),SNP,：,葡萄糖激酶調(diào)節(jié)蛋白,(,GCKR,),基因第,16,號內(nèi)含子中的一個,SNP(rs780094,T/C),，,相比,C,等位位點(diǎn)，含,

14、T,等位位點(diǎn)時，個體表現(xiàn)為葡萄糖水平較低、胰島素耐受較少，患,2,型糖尿病的風(fēng)險較低。,調(diào)控區(qū),rSNP,：,IFN-,基因啟動子區(qū)含一個,rSNP(-764G/C),，,相比,C,等位位點(diǎn)，含,G,等位位點(diǎn)時，,IFN-g,基因啟動子與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合增強(qiáng)，啟動子活力提高到,23,倍。,目的基因SNP的查詢,輸入基因名稱與物種名稱，,如 NGAL,homo,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),請介紹除了,NCBI,以外的,SNP,數(shù)據(jù)庫及其使用；,查詢?nèi)?Fascin,，,Ezrin,，,NGAL receptor,等基因的,SNP,位點(diǎn)，列出它們編碼區(qū)的,SNP,，,討論這些,SNP,對蛋白結(jié)構(gòu)與功能的影響；,請列舉檢測,SNP,的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，并評價其優(yōu)缺點(diǎn)；,請?jiān)O(shè)計(jì)一個實(shí)驗(yàn)檢測一個基因的,SNP,，,并分析這些,SNP,與某種疾病的關(guān)系；,若要判斷,SNP,與疾病有明顯關(guān)系，需要什么條件。,