氧化亞鐵硫桿菌的分離及生物學(xué)特性研究分析生物技術(shù)專業(yè)

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1、氧化亞鐵硫桿菌的分離及生物學(xué)特性研究 摘要 氧化亞鐵硫桿菌(Thiobacillus ferrooxidans,簡稱T. f)屬革蘭氏陰性無機化能自養(yǎng)菌、嗜酸、專性好氧,靠氧化基質(zhì)中的Fe2 +為Fe3+和低價態(tài)硫為硫酸根而獲取能量。它廣泛存在于土壤海水、淡水、垃圾、硫磺泉和沉積硫內(nèi),尤以金屬硫化礦和煤礦等酸性礦坑水中最為常見。因此，本論文從T.f菌的分離純化出發(fā)，進(jìn)行了T. f菌的生理生化及其生物活性的研究。 本文從浸礦溶液中分離得到的氧化亞鐵硫桿菌進(jìn)行研究，結(jié)果表明硫酸亞鐵相對于硫來說是一種速效能源，單質(zhì)硫是長效能源，并且能提供比亞鐵更高的能量。 關(guān)鍵詞：氧化亞鐵硫桿菌，微生物冶金

2、，生物浸礦，分離純化 Isolation of Thiobacillus and biological characteristics Abstract Ferrooxidans (Thiobacillus ferrooxidans, called T. f) ,an inorganic chemoautotroph Gram negative bacteria, acidophilus, specific aerobic, relying on substrate oxidation in Fe3+ and Fe2+ for the low state of sulfur to

3、sulfuric acid roots and obtain energy，which is widely found in soil water, fresh water, waste, and deposition of sulfur in sulfur springs, especially in sulfide minerals such as acid mine water and coal the most common . Therefore, this paper from the T.f purification and identification of bacteria

4、 in conducting the physiological strain Af its biological activity. This separation from the leaching solution obtained ferrooxidans study results show that compared with ferrous sulfate sulfur is a kind of quick energy, sulfur is a long-lasting energy, and can provide more energy than the ferrous

5、 . Key words: Thiobacillus ferrooxidans , microbioleaehin ,Biological leaching ,isolation 目 錄 摘要 I Abstract II 一、 前 言 1 1.1生物冶金的概念 1 1.2碲礦的生物冶金 2 1.3氧化亞鐵硫桿菌的作用 3 1.4 本實驗研究內(nèi)容 3 二、實驗部分 5 2.1實驗材料與設(shè)備 5 2.1.1菌種采集 5 2.1.2實驗試劑 5 2.1.3實驗儀器 5 2.1.4培養(yǎng)基 6 2.2研究方法 7 2.2.1菌種富集培養(yǎng) 7 2.2.2分離純

6、化 7 2.2.3單層平板的制作 8 2.2.4雙層平板的制作 9 2.2.5革蘭氏染色 9 2.2.6 pH測定 9 2.2.7細(xì)菌計數(shù)方法 9 2.4生物特性研究 11 2.4.1生長曲線 11 2.4.2氧化亞鐵硫桿菌菌株對能源的利用情況 11 2.4.3最適生長溫度的測定 11 2.4.4最適初始pH值的測定 11 結(jié)果與討論 12 結(jié)論 15 致謝 16 參考文獻(xiàn) 17 一、 前 言 礦物質(zhì)是在工業(yè)生產(chǎn)中不可缺少的物質(zhì)，是經(jīng)濟建設(shè)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。我國含有的礦產(chǎn)資源種類豐富，礦產(chǎn)已探明儲量豐富。我國是一個地大物博的強大國家，但由于人口基數(shù)大，

7、導(dǎo)至各種資源人均占有量低于世界平均水平。所以我國礦產(chǎn)資源相對緊缺，富礦多數(shù)已開發(fā)利用，還有很多貧瘠礦，礦含量相對低于其它富礦，開采難度大?，F(xiàn)有開采技術(shù)的開采方式對環(huán)境的破壞程度大，提取礦物質(zhì)也不完全正確，很多礦仍不能開采。針對目前的情況，微生物浸礦是一種新的開采方式，具有溶礦率高，不污染環(huán)境等獨特優(yōu)勢。 1.1生物冶金的概念 生物冶金是利用礦物為營養(yǎng)基質(zhì)的微生物的作用，將礦物中金屬溶解，進(jìn)分離、富集、純化而提取金屬的濕法冶金技術(shù)。該技術(shù)具有流程短、成本低、環(huán)境友好和低污染等特點，特別適于處理貧礦、廢礦、表外礦及難采、難選、難冶礦的堆浸和就地浸出。從文獻(xiàn)記載來看，中國是世界上最早采用

8、生物冶金技術(shù)的國家，早在公元前六、七世紀(jì)，就在采銅、鐵過程中不自覺地利用了自發(fā)生長的某些自養(yǎng)細(xì)菌。而在歐洲，這種技術(shù)的應(yīng)用至少始于公元二世紀(jì)，從1687年開始，瑞典中部Falun礦山的銅礦至少已經(jīng)浸出了2百萬噸銅[1]。 在國外，銅，鈾的生物提取以及含砷金礦的預(yù)氧化已實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。在銅的生物提取方面，目前用生物法提取的銅約占世界總銅產(chǎn)量的25%，在美國、加拿大、澳大利亞、智利等20多個國家實現(xiàn)了生物提銅產(chǎn)業(yè)化。在我國，也有2座銅的生物氧化提取廠投入生產(chǎn)。在含砷金礦的生物預(yù)氧化方面，隨著自然金開采的日益枯竭，含砷難處理金礦己成為開采對象，含砷金礦的主要礦物是黃鐵礦、毒砂，金以微粒成亞顯微形態(tài)包裹

9、在硫化物中或浸染在黃鐵礦、毒砂的晶格中，細(xì)磨和直接氰化法很難提取。而使用氧化亞鐵硫桿菌等細(xì)菌分解外部的包裹層，可使金裸露出來，有利于化學(xué)浸出，從而提高金的回收率[2]。目前國外至少有10個生物氧化提金廠己經(jīng)籌建投產(chǎn)，國內(nèi)也建成了2個生物預(yù)氧化黃金生產(chǎn)廠。在鈾的生物提取方面，加拿大利用細(xì)菌浸鈾的規(guī)模最大、歷史最久，法國、美國、葡萄牙等國家也實現(xiàn)了細(xì)菌浸鈾的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。 目前世界范圍內(nèi)，生物冶金成功應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的主要是銅、鈾和金銀等,使用范圍從堆浸法逐步擴展到了地浸法和原地破碎浸礦法，正在向銅、鈾、錳、鉛、鎳、鉻、鉆、鐵、砷、鋅、鋁等幾乎所有硫化礦的浸出擴大。產(chǎn)業(yè)化相對領(lǐng)先的國家有智利、澳大

10、利亞、美國、南非、日本等，中國、歐盟也從近幾年先后投入大量資金開展生物冶金領(lǐng)域的研究。縱觀全球，生物冶金業(yè)化主要在三個方面，并形成兩大技術(shù)[3]。 1.2碲礦的生物冶金 碲是一種稀有，但有很大利用價值的非金屬資源。在地殼中的含量很少, 僅有2×10-7％，其應(yīng)用相當(dāng)廣泛，主要是用作鋼鐵有色金屬的添加劑, 其次是石油, 化工生產(chǎn)的催化劑,橡膠的硫化劑、促凝劑, 且在玻璃電子工業(yè)中有獨特用途。目前，碲已經(jīng)成為世界戰(zhàn)略需求資源，從軍事到民用，碲都發(fā)揮著不可替代的作用。碲礦物有碲金礦（AuTe2）、輝碲鉍礦(Bi2TeS2)和碲銅礦等，都很稀少。輝碲鉍礦（tetradymite）是一種鉍和碲的硫化

11、物礦物，它具有的淺灰色帶有金屬光澤，并且還會褪色變暗。有葉、粒、塊狀等。輝碲鉍礦是一種較難獨立成礦的碲硫化物。在我國四川石棉縣大水溝發(fā)現(xiàn)的世界罕見的碲原生礦，有很大開發(fā)前景。此礦石含碲一般在1%到12%，個別高達(dá)36.6%；含鉍一般在3%到20%，個別達(dá)40%以上[4]。由于碲礦分布相對分散，是一種低品位、難開采礦，同時統(tǒng)開采方式易造成資源浪費、環(huán)境污染、能源消耗過大等問題。而生物冶金正是能夠解決上述困難的新發(fā)展方向[12]。本文所用的礦樣為原礦經(jīng)浮選獲得的低品位碲精礦，是以輝碲鉍礦為主的混合硫化礦，用單因子實驗法進(jìn)行不同pH條件下?lián)u瓶浸出試驗，探究生物浸出時的一系列適宜條件，以期提高碲礦的生

12、物浸出率。 圖 11 輝碲鉍礦（tetradymite） 1.3氧化亞鐵硫桿菌的作用 氧化亞鐵硫桿菌是嗜酸性化能自養(yǎng)型細(xì)菌, 專性好氧, 最佳生長pH值為2.0～2.5, 最佳生長溫度28～35℃, 能以氧化Fe2 + 、元素S及金屬硫化物等來獲得生命過程中所需能量, 并以O(shè)2 作為氧化過程中的最終電子受體。這類細(xì)菌很早就被應(yīng)用于貴金屬的浸出和回收, 適合于從低品位的礦石中浸出稀有貴金屬。細(xì)菌浸出的方法由于具有成本低、能耗小、無污染等特點而獲得廣泛應(yīng)用, 據(jù)報道美國有25%左右的銅是通過這種方法開采的[5]。此外在含硫廢水處理和煤的脫硫、以及脫去硫化氫和二氧化硫等方面也有重

13、要的應(yīng)用前景。然而由于氧化亞鐵硫桿菌的野生菌氧化Fe2 + 、元素S以及金屬硫化物的速度慢, 生長條件要求苛刻, 以及對某些金屬離子缺乏耐受能力等, 從而限制了其應(yīng)用范圍。所以人們試圖通過各種馴化與誘變育種的方法來提高氧化亞鐵硫桿菌的適應(yīng)范圍和應(yīng)用價值。 在生物浸礦中，最常用的菌種是氧化亞鐵硫桿菌。由于各地的氧化亞鐵硫桿菌不一樣，生長狀況不一樣，在各種環(huán)境中的含量也不同。所以在將其運用到工業(yè)生產(chǎn)中，首先要分離得到純的氧化亞鐵硫桿菌菌株。 1.4 本實驗研究內(nèi)容 通過對氧化亞鐵硫桿菌的一些文獻(xiàn)資料的分析，總結(jié)前人已有的成果，從實驗室的浸礦溶液中分離出氧化亞鐵硫桿菌，前對其的一些基本生物活性

14、進(jìn)行分析。調(diào)整培養(yǎng)基的各種理化條件，使其最適合氧化亞鐵硫桿菌的生長，從而將此生產(chǎn)條件調(diào)節(jié)到此環(huán)境，以使氧化亞鐵硫桿菌最大程度的進(jìn)行生物浸礦。 (1) 分離到氧化亞鐵硫桿菌菌株。 (2) 分析氧化亞鐵硫桿菌的生物學(xué)活性。 (2) 本文研究內(nèi)容： 技術(shù)路線： 二、實驗部分 2.1實驗材料與設(shè)備 2.1.1菌種采集 本實驗所用菌液為本實驗室以前浸礦培養(yǎng)液。 2.1.2實驗試劑 蒸餾水，（NH4）2SO4(分析純)，KCI(分析純)，K2HPO4(分析純)，MgSO4·7H2O(分析純)，Ca(N03)2(分析純)，F(xiàn)eSO4·7H2

15、O (分析純)，K 2Cr2O7(化學(xué)純)，AgNO3(化學(xué)純)，二苯胺磺酸鈉(分析純)，KSCN(分析純)。 2.1.3實驗儀器 本章實驗所用到的主要儀器及其型號和生產(chǎn)廠家如表2一1所示: 表2一1 實驗設(shè)備 儀器名稱 型號 產(chǎn)地 電子天平 YJ2502 上海精密科學(xué)儀器有限公司 精密pH計 PHS-3 C 上海雷磁儀器廠 臺式高速離心機 5804R 德國漢堡EppendorfCor. 空氣浴振蕩器 HZQ-C 哈爾濱市東明醫(yī)療器械廠 數(shù)控恒溫浴鍋 DK-98-1 天津市泰斯特儀器有限公司 電子分析天平 FA1104N 上海精密科學(xué)儀器

16、有限公司 立式壓力蒸汽滅菌鍋 YXQ-S-301 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠 電熱恒溫培養(yǎng)箱 DHP一9052 上海一恒科技有限公司 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 DHG9070A 上海一恒科技有限公司 圖2-1 部分儀器 2.1.4培養(yǎng)基 氧化亞鐵硫桿菌的代表培養(yǎng)基是9K培養(yǎng)基和利森(Leathen)培養(yǎng)基，其組成見圖2-2。 圖2-2 利森(Leathen)和9K培養(yǎng)基的組成[6] 9K富集培養(yǎng)基配置方法: 9K鹽溶液: （NH4）2SO4,3.00g;KCl,0.10g; K2HPO4,0.50g;MgSO4·7H2O 0.50g; Ca

17、(N03)2 0.01g;按此配方加蒸餾水配溶液1000mL。 9K培養(yǎng)基:為9K鹽溶液加入FeSO4·7H2O 44.6g/L。 改進(jìn)的9K固體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由A液、B液和C液三部分組成: A液: （NH4）2SO4 1.5g;KCI 0.1g，K2HPO40.5g; MgSO4·7H2O 0.5g，Ca(N03)2 0.01g，KSCN15.4g，蒸餾水200mL，121oC滅菌30min; B液: FeSO4·7H2O 22g蒸餾水300mL，pH2.0，用微孔濾膜(Φ0.22um)過濾滅菌; C液:瓊脂糖10g，蒸餾水500mL，1210C滅菌20min。 2.

18、2研究方法 2.2.1菌種富集培養(yǎng) 實驗中選用液體9K培養(yǎng)基對菌液進(jìn)行富集篩選。在250mL錐形瓶加入200mL滅菌后的9K鹽溶液和4.46g FeSO4·7H2O，用50%的H2SO4調(diào)到pH2.0左右，接種處于對數(shù)期生長的菌種5mL，于30℃、160r/min搖床中恒溫震蕩培養(yǎng)。經(jīng)過三到四次傳代培養(yǎng)，使得嗜酸氧化亞鐵硫桿菌成為絕對優(yōu)勢菌[7]。 培養(yǎng)基由淺綠色逐漸加深，最后變?yōu)樽丶t色，溶液混濁，且有沉淀出現(xiàn)。這表明液體培養(yǎng)基中Fe2+被氧化成了Fe3+，即有細(xì)菌生長。對該菌液進(jìn)行計數(shù)，發(fā)現(xiàn)菌濃度己達(dá)到107~108個/ml。 2.2.2分離純化 目前分離菌種主要采用以瓊脂(或瓊脂

19、糖)作凝固劑的固體培養(yǎng)基進(jìn)行[8]。本實驗采用稀釋涂布平板法，步驟如下:取菌液1mL，用pH=2.5的稀硫酸按每次稀釋10倍，依次稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6濃度的稀釋液。吸取稀釋度為10-4、10-5、10-6稀釋樣各0.2mL，分別接種到三個預(yù)先準(zhǔn)備好的9K瓊脂固體培養(yǎng)基，涂布均勻，正置于30℃恒溫生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，次日把培養(yǎng)皿倒置繼續(xù)培養(yǎng)，直至固體培養(yǎng)基表面出現(xiàn)圓形凸起狀小菌落(直徑大約1mm)，一般需要兩周[9]。將單獨小菌落挑起，每個小菌落分別接種到裝有5mL9K液體培養(yǎng)基的小錐形瓶(或試管)中，以棉球封口，放在30℃搖床中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。這樣培

20、養(yǎng)出的即為單一菌的純培養(yǎng)[10]。如此反復(fù)，直到純化為止。操作均在無菌工作臺上進(jìn)行，所有器皿均經(jīng)高壓濕熱滅菌，接種環(huán)用酒精燈灼燒消毒。 圖2-3 分離過程圖 2.2.3單層平板的制作 培養(yǎng)基分為三部分制作： (1)9K固體培養(yǎng)基([Fe2+]=9g/L) A液:9K無鐵液體培養(yǎng)基42mL，pH3.0 B液:1.5%瓊脂溶液40mL C液:14.78%FeS04·7H20溶液18mL (2)9K固體培養(yǎng)基([Fe2+]=4.5g/L) A液:9K無鐵液體培養(yǎng)基42mL，pH.30 B液:1.5%瓊脂溶液40mL C液:7.39%FeS04·7H20溶液18mL 2

21、.2.4雙層平板的制作 在無菌平皿中倒入已溶化并冷卻至60℃的瓊脂作底層，待平板凝固后，用無菌吸管取0.1mL處于對數(shù)期的酵母菌菌液于底層平板并放置1-2h。再分別將用于分離T.f菌的固體培養(yǎng)基A、B、C液3者混合，迅速倒入混勻，作上層平板，凝固后備用[11]。 2.2.5革蘭氏染色 （1）用接種針挑取單個菌落，涂布于干凈載玻片上的一滴無菌水中，風(fēng)干 （2）滴加結(jié)晶紫染色液染1-2 min，水洗，吸干； （3）用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋處理1 min，水洗，吸干； （4）用95%乙醇脫色，流滴至洗脫液無色，一般20～30 s； （5）用番紅染液復(fù)染2～3 min，水洗； （6

22、）風(fēng)干后用顯微鏡油鏡觀察。 2.2.6 pH測定 1、溶液pH值用奧立龍818型酸度計測定。 2、使用pH試紙進(jìn)行測定。 2.2.7細(xì)菌計數(shù)方法 在測定細(xì)菌濃度時，細(xì)菌的計數(shù)方法較多，有顯微鏡直接測定法、平板計數(shù)法、光電比濁法、生物量測定法及DNA含量測定法等[12]?？紤]到直觀、起見，本實驗在菌種性質(zhì)的研究中，細(xì)菌計數(shù)采用顯微鏡直接計數(shù)法，這包括計數(shù)板法、涂片染色法、比例計數(shù)法等，以計數(shù)板法最為常用，但該較費時。該法是根據(jù)測定對象選用特制的載玻片(即計數(shù)板)，其上刻有己知面積的大小方格(即計數(shù)格)，當(dāng)蓋上蓋玻片后，蓋玻片與計數(shù)格間的高度為已知，因此計數(shù)格的容積為一定。根據(jù)在顯微鏡

23、下測得的該計數(shù)格中的微生物個數(shù)，可算出單位體積待測液中所含微生物數(shù)[13]。 該方法操作和步驟如下： (1)備片:取清潔干燥的計數(shù)板與蓋玻片(必要時，可微微烘干，以除去其上附著的水分)，蓋上蓋玻片。注意蓋玻片要蓋在計數(shù)室兩側(cè)[14]。 (2)鏡檢計數(shù)室:在加樣前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗后才能進(jìn)行計數(shù)。 (3)加樣:用無菌吸管吸取充分搖勻并打散開的待測菌液，小心滴一小滴于蓋玻片邊緣，菌液自行滲入并布滿計數(shù)室，注意避免產(chǎn)生氣泡。 (4)顯微計數(shù):加樣后靜置3~5分鐘，鏡檢。根據(jù)受檢微生物個體大小選用適宜的物鏡頭，先用低倍物鏡找好計數(shù)室位置，然后換用高倍物鏡進(jìn)行計數(shù)

24、。計數(shù)前如發(fā)現(xiàn)菌液過濃，可做一定倍數(shù)稀釋后再制片鏡檢計數(shù)，一般每個小方格內(nèi)有5~10個菌體為宜。一個計數(shù)室選5個中格(可選4個角和中央的中格)中的菌體進(jìn)行計數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。計數(shù)時注意轉(zhuǎn)動細(xì)調(diào)節(jié)器，使液層上下菌數(shù)都可測到。每份菌液樣品至少計數(shù)兩次取其均值[8]。 (5)清洗血球計數(shù)板:使用完畢后，將血球計數(shù)板在水龍頭上用水柱沖洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。 (6)結(jié)果計算:一個計數(shù)室就是一個大方格，分為25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格，所以每個計數(shù)室

25、中的小方格數(shù)都是16X25=400個。每一個大方格邊長為1mm，則每一個計數(shù)室的面積為1mm2，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為0.1mm，所以計數(shù)室的容積為0.1mm3。在計數(shù)時，通常數(shù)五個中方格的總菌數(shù)，然后求得每個中方格的平均值，再乘上25，就得出一個計數(shù)室中的總菌數(shù)，然后再換算成1mL菌液中的總菌數(shù)。 設(shè)五個中方格中總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，那么，一個計數(shù)室的總菌數(shù)（即0.1mm3中的總菌數(shù)）為（A/5）*25*B；因此1mL=1000mm3，故1mL菌液中的總菌數(shù)=（A/5）*25*B*10*1000=50000A*B個。 2.4生物特性研究 2.4.1生長曲線

26、將預(yù)先培養(yǎng)好的細(xì)菌分別接種于亞鐵和元素硫的培養(yǎng)基中(接種終濃度為1·0×106個/mL),在25~60℃或30℃及pH 1·0~5·0的條件下?lián)u床培養(yǎng),2天后每隔4~8 h取樣,用血小板計數(shù)法測定細(xì)菌的數(shù)量[15]。 2.4.2氧化亞鐵硫桿菌菌株對能源的利用情況 在100 mL基本鹽培養(yǎng)基中分別加入1 g除菌的單質(zhì)硫或4·31 g FeSO4·7H2O和1 g單質(zhì)硫的混合物、硫代硫酸鈉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、黃鐵礦和鐵閃鋅礦,分別配成含硫或亞鐵和硫、硫代硫酸鈉、不同碳源、不同礦樣的特別基質(zhì).然后,按2.4.1方法接種,在30℃條件下分別培養(yǎng)5天后,觀察細(xì)菌的生長情況. 2.4.3最適生

27、長溫度的測定 將相同數(shù)量的氧化亞鐵硫桿菌株接種到多份9 K葡萄糖液體培養(yǎng)基中，分別置于不同溫度條件下，經(jīng)170 r/min振蕩培養(yǎng)，第72 h時，在顯微鏡下直接計數(shù)，確定不同溫度下菌株的生長情況[16]。 2.4.4最適初始pH值的測定 將相同數(shù)量的氧化亞鐵硫桿菌株接種到不同初始pH值的9K葡萄糖液體培養(yǎng)基中，經(jīng)30℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)，第72 h時于顯微鏡下直接計數(shù)，確定不同pH條件下細(xì)菌的生長情況。 結(jié)果與討論 通過本次實驗，綜合各項數(shù)據(jù)，進(jìn)行分析： 1、菌種來源：本實驗采用實驗室原有的浸礦溶液 對研究者與使用者來說，工業(yè)微生物即浸礦菌種的獲得一般有兩種方法

28、： （1）從微生物保存單位直接購買。這樣可以節(jié)省時間，并減少工作量，但這樣獲得的菌種常常沒有從自然界采集的野生菌適應(yīng)性強[12]。 （2）直接從自然界中采集野生菌。這種細(xì)菌適應(yīng)性強，故人們常常從自然界中采集。 2、細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu) 革蘭氏染色，觀察細(xì)菌形態(tài)。菌體形態(tài)特征：該菌在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時,培養(yǎng)基的顏色由最初的淺綠色變?yōu)辄S綠色,約10天左右在培養(yǎng)皿上長出小菌落,該菌落為黃褐色、圓形,直徑約0. 5—0. 8mm,中部突起,被水合高鐵包裹,質(zhì)地堅硬,較難挑起[17]。在顯微鏡下該菌為短桿狀,兩端鈍圓,以單個、雙個或幾個呈短鏈狀存在,能運動,革蘭氏染色陰性。 圖2-4 細(xì)菌顯微結(jié)構(gòu)

29、 3、9K固體培養(yǎng)基制作 固體培養(yǎng)基本可由液體培養(yǎng)基中加入一定比例的瓊脂直接制成，但因瓊脂在酸性環(huán)境中易于水解，在本實驗中只有將培養(yǎng)基與瓊脂分開滅菌后混合制平板。A、B液121℃濕熱滅菌15min，C經(jīng)0.22um微孔濾膜過濾除菌，待A、B液冷卻到60℃與C液混合后倒平板，待平板冷卻凝固后即可進(jìn)行菌液的涂布。 4、營養(yǎng)類型：化能自養(yǎng)菌 在富集培養(yǎng)的實驗中,隨著菌體的生長, 9K液體培養(yǎng)基的顏色由淺綠色依次變?yōu)橥咙S色和紅棕色,這是由于溶液中Fe2+被氧化成Fe3+,最終有淡黃色黃鉀鐵礬沉淀生成;實驗還表明該菌能利用亞鐵和單質(zhì)硫生長,但在蛋白胨培養(yǎng)基中不能生長,所以該菌屬專性化能自養(yǎng)菌

30、。這些實驗結(jié)果表明該菌具有氧化亞鐵硫桿菌的特性。 5、生長曲線 生物氧化過程中Fe2+濃度以及細(xì)胞數(shù)目隨時間變化如圖，T.f生長進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)菌濃度達(dá)到最大值1.3x107個/mL。穩(wěn)定期可以持續(xù)到第7d，然后進(jìn)入衰亡期[18]。與對照相比，接種處理的培養(yǎng)液中Fe2+氧化主要發(fā)生在延滯期間，兩天后Fe2+基本耗盡。 圖 2-4 氧化亞鐵菌菌株的生長曲線 6．能源利用情況 圖2-5為氧化亞鐵菌菌株亞鐵培養(yǎng)基和硫培養(yǎng)基中的典型生長曲線.由圖2可知,培養(yǎng)早期細(xì)菌在亞鐵培養(yǎng)基中的增長速度明顯比在硫培養(yǎng)基中的快,但100 h后,在硫培養(yǎng)基中的細(xì)菌濃度明顯高于在亞鐵培養(yǎng)基中的細(xì)菌濃

31、度,細(xì)菌濃度達(dá)到108個/mL.細(xì)菌在利用元素硫時,需要經(jīng)過一段時間誘導(dǎo)自身表達(dá)或合成分泌性疏水胞外物質(zhì),以利于與元素硫接觸,因而在開始階段細(xì)菌的濃度較低.但一旦接觸好后,硫氧化比亞鐵氧化可提供更多的能量,所以培養(yǎng)后期細(xì)菌的濃度較高。 圖 2-5 氧化亞鐵菌菌株在亞鐵和硫培養(yǎng)基中的生長曲線 結(jié)論 本次實驗，通過將氧化亞鐵硫桿菌菌液進(jìn)行倒平板，采用劃線分離法，得到氧化亞鐵菌株，再進(jìn)行生物特性的研究，得出以下結(jié)論： （1）從實驗室樣品中分離純化得到細(xì)菌菌株，觀察：固體培養(yǎng)10天后出現(xiàn)菌落，均為黃褐色，圓形，直徑1mm，中部突出，質(zhì)地堅硬?？梢岳脕嗚F和單質(zhì)硫作為能源。

32、（2）T.ferrooxidans菌在亞鐵培養(yǎng)基中遲緩時間短，比生長速率高，倍增時間短，說明硫酸亞鐵相對于單質(zhì)硫是一種速效能源。 (3)在硫培養(yǎng)基中T.ferrooxidans菌出現(xiàn)二次，甚至更多次的對數(shù)生長，最終細(xì)菌濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于亞鐵培養(yǎng)基中的細(xì)菌濃度，說明單質(zhì)硫是一種長效能源，能提供比亞鐵更高的能量。 (4)對最佳生長條件的研究表明,在初始pH 值為2～2. 5 ,溫度在30～35 ℃范圍內(nèi),初始Fe2+度為9 g/ L ,接種量為10 %時,菌株既能維持良好的生長,又能對Fe2+的氧化速率保持較高水平。下一步將通過傳統(tǒng)誘變技術(shù)和現(xiàn)代基因工程手段改良該菌株,使其滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。

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