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1、淺談流式細胞儀技術淺談流式細胞儀技術Flow Cytometer 目錄目錄流式細胞儀的歷史流式細胞儀的歷史1流式細胞儀的結構及工作原理流式細胞儀的結構及工作原理2流式細胞儀在細胞凋亡上的應用流式細胞儀在細胞凋亡上的應用3 例證例證4流式細胞儀的歷史流式細胞儀的歷史 History of FCM1934年年,Moldaven是世界上最早設想使細胞檢測自動化是世界上最早設想使細胞檢測自動化的人；的人；1936年年,Caspersson等引入顯微光度術；等引入顯微光度術；1940年年,Coons提出用結合熒光素的抗體去標記細胞內(nèi)的特定蛋提出用結合熒光素的抗體去標記細胞內(nèi)的特定蛋白；白；1947年年,
2、Guclcer運用層流和湍流原理研制煙霧微粒運用層流和湍流原理研制煙霧微粒計數(shù)器；計數(shù)器；1949年年,Coulter提出在懸液中計數(shù)粒子的方法提出在懸液中計數(shù)粒子的方法并獲得專利。并獲得專利。流式細胞分析流式細胞分析(flow cytometry FCM)即流式細胞即流式細胞術術,是用流式細胞儀是用流式細胞儀(flow cytometer FCM)測量液測量液相中懸浮細胞或微粒的一種現(xiàn)代分析技術。相中懸浮細胞或微粒的一種現(xiàn)代分析技術。1950年年,Caspersson用顯微分光光度計在紫外用顯微分光光度計在紫外(UV)和可見光光譜區(qū)檢測細和可見光光譜區(qū)檢測細胞；胞；1953年年，2Taylo
3、r應用分層鞘流原理應用分層鞘流原理,成功地設計紅細胞光學自成功地設計紅細胞光學自動計數(shù)器動計數(shù)器；1953年年,Parker和和Hutcheon描述一種描述一種全血細胞計數(shù)器裝置全血細胞計數(shù)器裝置,成為流式細胞儀的雛形；成為流式細胞儀的雛形；1954年年,Beirne和和Hutchcon發(fā)明光電粒子計數(shù)器發(fā)明光電粒子計數(shù)器。1930-1950年年1950-19601960-19701965年年,Kamemtsky等提出設想等提出設想:用分光光度計定量細胞成分；結合測量值對細胞進用分光光度計定量細胞成分；結合測量值對細胞進行分類行分類;1967年年,Kamemtsky和和Melamed在在.前人
4、基礎上提出細胞分選的方法前人基礎上提出細胞分選的方法;1969年年,Van Dilla Fulwyler及其同事們發(fā)明第一臺熒光檢測及其同事們發(fā)明第一臺熒光檢測細胞計。細胞計。1970-1972年年,Herzenberg研制出一個細胞分研制出一個細胞分選器的改進型選器的改進型,能夠檢測出經(jīng)熒光標記抗體能夠檢測出經(jīng)熒光標記抗體染色的細胞的較弱的熒光信號染色的細胞的較弱的熒光信號;1975年年,Kochler和和Milstein提出單克隆抗體技術提出單克隆抗體技術,為細胞研究中大量的特異性免疫試劑的應為細胞研究中大量的特異性免疫試劑的應用奠定基礎。用奠定基礎。流式細胞儀的結構及工作原理流式細胞儀的
5、結構及工作原理 Components and Principle of FCM流動室及液流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)流驅(qū)動系統(tǒng)激光光源及激光光源及光束成形系統(tǒng)光束成形系統(tǒng)光學系統(tǒng)光學系統(tǒng)信號檢測、存貯、顯信號檢測、存貯、顯示、分析系統(tǒng)示、分析系統(tǒng)細胞分細胞分選系統(tǒng)選系統(tǒng)Components and Principle of FCM流式細胞儀的結構及工作原理流式細胞儀的結構及工作原理 Components and Principle of FCM u(一一)流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng)流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng) 流動室流動室(flow chamber或或flow cell)是儀器核是儀器核心部件，被測樣品在此與激光相
6、交。流動室由石英心部件，被測樣品在此與激光相交。流動室由石英玻璃鋼制成，并在石英玻璃中央開一個孔徑為玻璃鋼制成，并在石英玻璃中央開一個孔徑為430 m180m的長方形孔，供細胞單個流過，檢的長方形孔，供細胞單個流過，檢測區(qū)在該孔的中心，這種流動室的光學特性良好，測區(qū)在該孔的中心，這種流動室的光學特性良好，流速較慢，因而細胞受照時間長，可收集的細胞信流速較慢，因而細胞受照時間長，可收集的細胞信號光通量大，配上廣角收集透鏡，可獲得很高的檢號光通量大，配上廣角收集透鏡，可獲得很高的檢測靈敏度和測量精度。流動室內(nèi)充滿了鞘液，鞘液測靈敏度和測量精度。流動室內(nèi)充滿了鞘液，鞘液的作用是將樣品流環(huán)包，鞘液流是
7、一種穩(wěn)定流動，的作用是將樣品流環(huán)包，鞘液流是一種穩(wěn)定流動，操作人員無法隨意改變其流動的速度，樣品流在鞘操作人員無法隨意改變其流動的速度，樣品流在鞘液的環(huán)包下形成流體力學聚焦，使樣品流不會脫離液的環(huán)包下形成流體力學聚焦，使樣品流不會脫離液流的軸線方向，并且保證每個細胞通過激光照射液流的軸線方向，并且保證每個細胞通過激光照射區(qū)的時間相等，從而得到準確的細胞熒光信息。區(qū)的時間相等，從而得到準確的細胞熒光信息。樣本壓力和鞘液壓力是不同的，且樣本壓力總是大于鞘液壓力。樣本壓力調(diào)節(jié)器通過改變樣本壓力的方法控制樣本流速。流式細胞儀的結構及工作原理流式細胞儀的結構及工作原理 Components and Pr
8、inciple of FCM(二二)激光光源與光束形成系統(tǒng)激光光源與光束形成系統(tǒng) 目前臺式機目前臺式機FCM，大多采用氬離子氣體激光器。，大多采用氬離子氣體激光器。流式細胞儀通常以激光作為激發(fā)光源流式細胞儀通常以激光作為激發(fā)光源,經(jīng)過聚焦整形后經(jīng)過聚焦整形后的光束垂直照射在樣品流上的光束垂直照射在樣品流上,被熒光染色的細胞在激光被熒光染色的細胞在激光束的照射下產(chǎn)生束的照射下產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光散射光和激發(fā)熒光。這兩種信號同時。這兩種信號同時被前向光電二極管和被前向光電二極管和90方向的光電倍增管方向的光電倍增管(PMT)接收。光散射信號在前向小角度進行檢測接收。光散射信號在前向小角度進行檢測,
9、稱為前向散稱為前向散射射(forward,FSC),這種信號基本上反映細胞體積這種信號基本上反映細胞體積的大小的大小;90散射光又稱側向散射散射光又稱側向散射(side scatter,SSC),是指與激光束是指與激光束2液流平面垂直的散射液流平面垂直的散射光光,其信號強度可反映細胞部分結構的信息。其信號強度可反映細胞部分結構的信息。流式細胞儀的結構及工作原理流式細胞儀的結構及工作原理 Components and Principle of FCM(三三)光學系統(tǒng)光學系統(tǒng) FCM的光學系統(tǒng)中主要光學原件是濾的光學系統(tǒng)中主要光學原件是濾光片，主要分成光片，主要分成3類：類：長通濾片長通濾片(lo
10、ng-pass filter，LP)、短通濾片、短通濾片(short-pass filtr，SP)及及帶通濾帶通濾片片(band-pass filter，BP)。FCM的光的光學系統(tǒng)學系統(tǒng)流式細胞儀的結構及工作原理流式細胞儀的結構及工作原理 Components and Principle of FCM(四四)信號檢測與分析系信號檢測與分析系當細胞攜帶熒光素標記物通過激光照射區(qū)時，受激光激當細胞攜帶熒光素標記物通過激光照射區(qū)時，受激光激發(fā)產(chǎn)生代表細胞內(nèi)不同物質(zhì)、不同波長的熒光信號，這發(fā)產(chǎn)生代表細胞內(nèi)不同物質(zhì)、不同波長的熒光信號，這些信號以細胞為中心，向空間些信號以細胞為中心，向空間360立體角
11、發(fā)射，產(chǎn)生立體角發(fā)射，產(chǎn)生散射光和熒光信號。散射光和熒光信號。流式細胞儀的結構及工作原理流式細胞儀的結構及工作原理 Components and Principle of FCM(四四)信號檢測與分析系信號檢測與分析系統(tǒng)統(tǒng) 散射光分為散射光分為前向角前向角散射散射(forward scatter，F(xiàn)SC)和和側向角散射側向角散射(side scatter，SSC)。散散 射射 光光 信信 號號(1)前向角散射：前向角散射：前向角散射與被前向角散射與被測細胞的大小有測細胞的大小有關關。(2)側向角散射：側向角散射：側向角散射是指側向角散射是指與激光束正交與激光束正交90方向的散射方向的散射光信號
12、，可提供光信號，可提供有關細胞內(nèi)精細有關細胞內(nèi)精細結構和顆粒性質(zhì)結構和顆粒性質(zhì)的信息的信息。流式細胞儀的結構及工作原理流式細胞儀的結構及工作原理 Components and Principle of FCM流式細胞儀的結構及工作原理流式細胞儀的結構及工作原理 Components and Principle of FCM目前采用這兩個參數(shù)組合，可區(qū)分裂解紅細胞處理后外周血白細胞目前采用這兩個參數(shù)組合，可區(qū)分裂解紅細胞處理后外周血白細胞中的淋巴細胞、單核細胞和中性粒細胞中的淋巴細胞、單核細胞和中性粒細胞3個細胞群體，或在未進行裂個細胞群體，或在未進行裂解紅細胞處理的全血樣品中找出血小板和紅細胞
13、等細胞群體。解紅細胞處理的全血樣品中找出血小板和紅細胞等細胞群體。下圖下圖（圖（圖3-2）為）為FSC和和SSC組成的二維散點圖，從圖中可以很容易把組成的二維散點圖，從圖中可以很容易把全血樣本中淋巴細胞、單核細胞及粒細胞區(qū)分開。全血樣本中淋巴細胞、單核細胞及粒細胞區(qū)分開。流式細胞儀的結構及工作原理流式細胞儀的結構及工作原理 Components and Principle of FCM碘化丙錠碘化丙錠(propidium iodide，PI)橙橙紅色紅色 620nm藻紅蛋白藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)橙橙黃色黃色575nm異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素(fluorescein i
14、sothiocyanate，F(xiàn)ITC)綠色綠色530nmPE-CY5等。等。熒光信號熒光信號 當激光光束與細胞正交時，一般會產(chǎn)生兩種熒光信號。當激光光束與細胞正交時，一般會產(chǎn)生兩種熒光信號。一種是細胞自身在激光照射下，發(fā)出微弱熒光信號，稱為細胞自一種是細胞自身在激光照射下，發(fā)出微弱熒光信號，稱為細胞自發(fā)熒光發(fā)熒光;另一種是經(jīng)過特異熒光素標記細胞后，受激發(fā)照射得到另一種是經(jīng)過特異熒光素標記細胞后，受激發(fā)照射得到的熒光信號，通過對這類熒光信號的檢測和定量分析，就能對所的熒光信號，通過對這類熒光信號的檢測和定量分析，就能對所研究細胞進行定性與定量測定研究細胞進行定性與定量測定 .選取染料或單抗所標記
15、的選取染料或單抗所標記的熒光素，必須考慮儀器所熒光素，必須考慮儀器所配置光源的波長。配置光源的波長。目前臺式機目前臺式機FCM常配置的激光器波長為常配置的激光器波長為488 nm，通常可采用的染料如下，通常可采用的染料如下流式細胞儀的結構及工作原理流式細胞儀的結構及工作原理 Components and Principle of FCM通道式分選通道式分選 分選分選 電荷式分選電荷式分選(五五)FCM分選分選 流式細胞儀在細胞凋亡上的應用流式細胞儀在細胞凋亡上的應用 Application of FCM on apoptosis G0流式細胞儀在細胞凋亡上的應用流式細胞儀在細胞凋亡上的應用 A
16、pplication of FCM on apoptosis在凋亡誘導劑的作用下，首先是細胞色在凋亡誘導劑的作用下，首先是細胞色素素C和和apa f1形成復合體，線粒體的形成復合體，線粒體的功能發(fā)生衰退；后是功能發(fā)生衰退；后是caspase家族激活，家族激活，磷脂酰絲氨酸外翻，這時細胞的形態(tài)已磷脂酰絲氨酸外翻，這時細胞的形態(tài)已經(jīng)發(fā)生了改變，可以看到細胞變小，胞經(jīng)發(fā)生了改變，可以看到細胞變小，胞核皺縮；最后是細胞內(nèi)核皺縮；最后是細胞內(nèi)DNA斷裂，形成斷裂，形成凋亡小體。在凋亡發(fā)生的各個過程當中，凋亡小體。在凋亡發(fā)生的各個過程當中，都有相應的流式細胞儀的檢測方法都有相應的流式細胞儀的檢測方法.Ap
17、optosisApoptosisCell deathFasFasLTNF-R1TNFTRADDFADDCas8CaseffMitCyt cProtein degradationDNase流式細胞儀在細胞凋亡上的應用流式細胞儀在細胞凋亡上的應用 Application of FCM on apoptosis流式細胞儀在細胞凋亡上的應用流式細胞儀在細胞凋亡上的應用 Application of FCM on apoptosis細胞細胞DNA含量分析含量分析Apo2.7法法流流式式細細胞胞儀儀常常用用的的A Ap po o檢檢測測方方法法半胱氨酸蛋白半胱氨酸蛋白-3(caspase-3)磷脂結合蛋白
18、磷脂結合蛋白AnnexinV-FITC/PI法法TUNEL法法或或DNA斷點法斷點法u機制機制流式細胞儀的結構及工作原理流式細胞儀的結構及工作原理 Components and Principle of FCMCaspaseCaspase家族成員特性一覽表家族成員特性一覽表家族成員特性一覽表家族成員特性一覽表名稱名稱原名原名功能功能底物特異性底物特異性Caspase-1ICE輔助促炎癥輔助促炎癥YVADCaspase-2ICH-1凋亡反應凋亡反應VDVADCaspase-3CPP32,Yama,apopain凋亡反應凋亡反應DEXDCaspase-4ICErel-II,TX,ICH-2輔助促炎
19、癥輔助促炎癥LEVDCaspase-5ICErel-III,TY輔助促炎癥輔助促炎癥WEHDCaspase-6Mch-3凋亡反應凋亡反應VEIDCaspase-7Mch3,ICE-LAP3,CMH-1凋亡反應凋亡反應Caspase-8MACH,FLICE,Mch5凋亡反應凋亡反應IETDCaspase-9ICE-LAP6,Mch6凋亡反應凋亡反應LEHDCaspase-10Mch4凋亡反應凋亡反應AEVDCaspase-11ICH-3Caspase-12Caspase-13ERICELEEDCaspase-14MICE(Mini-ICE)注：W為色氨酸，E谷氨酸、H為組氨酸、D為天冬氨酸、I為
20、異亮氨酸、L為亮氨酸、V為纈氨酸、X為任何氨基酸（by Thonberry,1997)Caspase活化的三種方式CaspaseCaspase的活化的活化的活化的活化 Application of FCM on apoptosis半胱氨酸蛋白半胱氨酸蛋白-3(caspase-3)磷脂酰絲氨酸外翻分析（磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）法）流式細胞儀在細胞凋亡上的應用流式細胞儀在細胞凋亡上的應用 Application of FCM on apoptosis不同凋亡階段的區(qū)分不同凋亡階段的區(qū)分不同凋亡階段的區(qū)分不同凋亡階段的區(qū)分流式細胞儀在細胞凋亡上的應用流式細胞儀在細胞凋亡上的應用
21、Application of FCM on apoptosisAnnexinV-FITC/PI法法TUNEL法法檢測原理：檢測原理：凋亡產(chǎn)生的斷裂的DNA-TdT酶標記dUTP-Biotin-結合鏈霉親和素-HRP-作用于底物DAB顯色TUNEL法法流式細胞儀在細胞凋亡上的應用流式細胞儀在細胞凋亡上的應用 Application of FCM on apoptosisTunel 原位凋亡檢測試劑盒原位凋亡檢測試劑盒u檢測方法檢測方法石蠟包埋組織石蠟包埋組織切片切片冰凍組織切片冰凍組織切片固固 定定脫脫 蠟蠟水水 合合 樣樣本本通通透透性性的的促促進進(蛋蛋白白酶酶K或或Triton-100處處
22、理理)TdT酶作用下酶作用下Biotin-dUTP與樣本與樣本DNA的標記反應的標記反應加入加入StreptavidinStreptavidin-HRP-HRP及底物及底物DABDAB的顯色反應的顯色反應 光學顯微鏡觀察光學顯微鏡觀察細細胞胞涂涂片片、貼貼壁細胞爬片壁細胞爬片Tunel 原位凋亡檢測試劑盒n檢測結果流式細胞儀在細胞凋亡上的應用流式細胞儀在細胞凋亡上的應用 Application of FCM on apoptosis流式細胞儀在細胞凋亡上的應用流式細胞儀在細胞凋亡上的應用 Application of FCM on apoptosis圖圖4-2-13 細胞壞死碎片峰的細胞壞死碎
23、片峰的DNA直方圖直方圖在在DNA二倍體二倍體G0/1峰前呈反拋物線形，自左向右呈從高至低分布，峰前呈反拋物線形，自左向右呈從高至低分布，即為細胞碎片峰。另有即為細胞碎片峰。另有1個個DNA二倍體二倍體G0/1細胞峰細胞峰(紅色紅色)和和2個個DNA異倍體異倍體G0/1細胞峰細胞峰(黃色和綠色黃色和綠色)。流式細胞儀在細胞凋亡上的應用流式細胞儀在細胞凋亡上的應用 Application of FCM on apoptosis圖圖4-2-14 凋亡細胞峰的凋亡細胞峰的DNA直方圖直方圖在在DNA二倍體細胞二倍體細胞G0/1峰前出現(xiàn)一個呈對稱分布的峰前出現(xiàn)一個呈對稱分布的亞二倍體亞二倍體DNA含量
24、細胞峰，即為凋亡細胞峰含量細胞峰，即為凋亡細胞峰;另有另有1個個DNA二倍體二倍體G0/1細胞峰細胞峰(紅色紅色)和和1個異倍體細胞個異倍體細胞G0/1細胞峰細胞峰(黃色黃色)。流式細胞儀在細胞凋亡上的應用流式細胞儀在細胞凋亡上的應用 Application of FCM on apoptosis圖圖4-2-15 細胞碎片和凋亡同時存在的細胞碎片和凋亡同時存在的DNA直方圖直方圖在細胞在細胞DNA直方圖上，在直方圖上，在DNA二倍體細胞二倍體細胞G0/1峰前，即有峰前，即有呈反拋物線形分布的細胞碎片峰，也有呈對稱分布的細胞凋亡峰呈反拋物線形分布的細胞碎片峰，也有呈對稱分布的細胞凋亡峰;還有還有1個個DNA二倍體二倍體G0/1期細胞峰期細胞峰(紅色紅色)和和1個個DNA異倍體異倍體G0/1期細胞峰期細胞峰(黃色黃色)。Diagram
細胞凋亡 流式細胞技術
