熒光介紹及熒光顯微鏡的使用

熒 光 介 紹 及 熒 光 顯 微 鏡 的 使 用 Leica 圖 象 分 析 儀 組 成 部 分 顯 微 鏡 熒 光 顯 微 鏡 可 見(jiàn) 光 顯 微 鏡 成 象 系 統(tǒng) 照 相 機(jī) 圖 象 采 集 軟 件 檢 出 能 力 高 對(duì) 細(xì) 胞 的 刺 激 小 能 進(jìn) 行 多 重 染 色 物 體 構(gòu) 造 的 觀 察 熒 光 的 有 無(wú) 、 色 調(diào) 比 較 進(jìn) 行 物 質(zhì) 判 別 發(fā) 熒 光 量 的 測(cè) 定 對(duì) 物 質(zhì) 定 性 、 定 量 分 析 物 質(zhì) 中 的 電 子 吸 收 光 的 能 量 由 低 能 狀 態(tài) 轉(zhuǎn) 變 為 高 能 狀 態(tài) ，再 回 到 低 能 狀 態(tài) 時(shí) 釋 放 出 的 光 。 即 ： 物 質(zhì) 吸 收 短 波 光 ， 發(fā) 射 出 的 長(zhǎng) 波 光 。 一 種 光 化 熒 光 透 射 熒 光 顯 微 鏡 原 理 熒光激發(fā)濾色塊 透 過(guò) 能 使 標(biāo) 本 產(chǎn) 生 熒 光 的 特 定 波 長(zhǎng) 的 光 ， 同時(shí) 阻 擋 對(duì) 激 發(fā) 熒 光 無(wú) 關(guān) 的 光 。 幾種主要的熒光激發(fā)濾色塊 熒 光 顯 微 鏡 標(biāo) 本 制 作 要 求 （ 一 ） 載 玻 片 載 玻 片 厚 度 應(yīng) 在 0.8 1.2mm之 間 ， 太 厚 的 坡 片 ， 一 方 面 光 吸 收 多 ， 另一 方 面 不 能 使 激 發(fā) 光 在 標(biāo) 本 上 聚 集 。 載 玻 片 必 須 光 潔 ， 厚 度 均 勻 ， 無(wú) 明 顯 自發(fā) 熒 光 。 有 時(shí) 需 用 石 英 玻 璃 載 玻 片 。 （ 二 ） 蓋 玻 片 蓋 玻 片 厚 度 在 0.17mm左 右 ， 光 潔 。 （ 三 ） 標(biāo) 本 組 織 切 片 或 其 他 標(biāo) 本 不 能 太 厚 ， 如 太 厚 激 發(fā) 光 大 部 分 消 耗 在 標(biāo) 本 下 部 ，而 物 鏡 直 接 觀 察 到 的 上 部 不 充 分 激 發(fā) 。 另 外 ， 細(xì) 胞 重 迭 或 雜 質(zhì) 掩 蓋 ， 影 響 判斷 。 （ 四 ） 封 裱 劑 封 裱 劑 常 用 甘 油 ， 必 須 無(wú) 自 發(fā) 熒 光 ， 無(wú) 色 透 明 ， 熒 光 的 亮 度 在 pH8.59.5時(shí) 較 亮 ， 不 易 很 快 褪 去 。 所 以 ， 常 用 甘 油 和 0.5mol/l pH9.0 9.5的 碳 酸 鹽緩 沖 液 的 等 量 混 合 液 作 封 裱 劑 。 （ 五 ） 鏡 油 一 般 暗 視 野 熒 光 顯 微 鏡 和 用 油 鏡 觀 察 標(biāo) 本 時(shí) ， 必 須 使 用 鏡 油 ， 最 好 使 用特 制 的 無(wú) 熒 光 鏡 油 ， 也 可 用 上 述 甘 油 代 替 。 單 細(xì) 胞 懸液 制 備制 膠 片 DNA堿 解 旋電 泳中 和細(xì) 胞 裂 解染 色 與 觀 察單 細(xì) 胞 凝 膠 電 泳 試 驗(yàn) （ 彗 星 試 驗(yàn) ） 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中肺泡巨噬細(xì)胞DNA遷移的實(shí)驗(yàn)圖象 二 、 可 見(jiàn) 光 顯 微 鏡 的 使 用 光 源 在 顯 微 鏡 下 方 ， 不 需 要 開(kāi) 汞 燈 可 以 觀 察 載 玻 片 上 的 任 何 物 質(zhì) 三 、 成 象 系 統(tǒng)1、 照 相 機(jī)2、 圖 象 采 集 軟 件 Leica100圖 象 分 析 軟 件 ， 把 顯 微 鏡 下 看 到 的 圖 象 拍 攝下 來(lái) ， 保 存 成 圖 片 文 件 ， 再 進(jìn) 行 相 關(guān) 分 析 。 標(biāo) 本 制 作 正 確 選 擇 濾 色 鏡 200W的 超 高 壓 汞 燈 作 光 源 ， 需 預(yù) 熱 15分 。 壽 命 有 限 ， 標(biāo)本 應(yīng) 集 中 檢 查 ， 以 節(jié) 省 時(shí) 間 ， 保 護(hù) 光 源 。 防 止 污 染 （ 載 物 臺(tái) 已 被 EB污 染 ） 染 色 后 盡 快 觀 察 ， 熒 光 逐 漸 減 弱 測(cè) 試 題1、 該 儀 器 由 哪 幾 部 分 組 成 ？2、 什 么 是 熒 光 ？ 熒 光 有 幾 種 類(lèi) 型 ？ 有 什 么 性 質(zhì) ？3、 該 儀 器 的 使 用 要 點(diǎn) 有 哪 些 ？4、 熒 光 顯 微 鏡 分 哪 兩 種 ？ 謝謝大家！歡迎提出寶貴意見(jiàn)！