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1、 生物化學(xué)實驗技術(shù)理論 一、層析技術(shù)l 1903年，俄國科學(xué)家M.C.Jber首創(chuàng)了一種從綠葉中分離多種不同顏色色素成分的方法，命名為色譜法(Chromatography)，由于翻譯和習(xí)慣的原因又常稱為層析法。l 80多年來，層析法不斷發(fā)展，形式多種多樣。50年代開始，相繼出現(xiàn)了分配層析、離于交換層析、凝膠層析、親和層析、吸附層析等。l幾乎每一種層析法都已發(fā)展成為一門獨立的生化高技術(shù)，在生化領(lǐng)域內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用。 一、層析技術(shù)l 1、層析技術(shù)原理l 2、層析技術(shù)分類l 3、常用層析技術(shù)原理 1、層析技術(shù)原理l層析原理：是一種物理的分離方法，利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不
2、同程度分布在兩相中，其中一相為固定相，另一相流過此相稱作流動相，并使各組分以不同速度移動，從而達到分離的目的。l可分離物質(zhì)：糖類、有機酸、氨基酸、核苷酸。 名稱操作方式固定相流動相分離依據(jù)分配層析紙層析薄層層析液體液體溶解度離子交換層析離子交換柱層析固體液體帶電性靜電引力吸附層析吸附薄層層析氣體吸附層析固體固體液體氣體吸附力親合層析酶與底物抗原與抗體固體液體配體專一性凝膠層析 凝膠過濾固體液體分子大小 淀粉凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 凝膠支持物區(qū)帶電泳 紙電泳 醋酸纖維薄膜電泳 薄層電泳 非凝膠支持物電泳 用支持物區(qū)帶電泳 顯微電泳等電聚焦電泳等速電泳 不用支持物電泳 是否用支持
3、物 u= v = d/t = dle V/l Vt 類型優(yōu)點缺點紙 電 泳 設(shè) 備 操 作 簡 單 分 辨 率 差 ， 電 滲 現(xiàn)象醋 酸 纖 維 薄 膜 電泳 設(shè) 備 操 作 簡 單 ， 樣 品用 量 少 分 辨 率 差瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 快 速 ， 分 辨 率 高 電 滲 現(xiàn) 象 嚴 重聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠電 泳 可 調(diào) 節(jié) 凝 膠 孔 徑 ， 樣品 用 量 少 分 辨 率 高 ，無 電 滲 現(xiàn) 象 高 濃 度 凝 膠 難 剝 離 OCH2=CH-C-NH2 O OCH2=CH-C-NH -CH2-NH-C-CH=CH2 A. 樣品的濃縮效應(yīng)緩沖液成分及pH的不連續(xù)性l 濃
4、縮 膠 pH6.7l 緩 沖 液 濃 縮 膠 Tris-HCl, 電 極 緩 沖 液 Tris-Glyl 解 離 度 ： Cl 蛋 Gly l mcl clm蛋 蛋 m Gly Glyl 凝 膠 中 Cl 為 快 離 子 ， Gly 為 慢 離 子 ，蛋 白 質(zhì) 樣 品 被 夾 在 中 間 。 緩 沖 液樣 品濃 縮 膠分 離 膠 緩沖液成分及pH的不連續(xù)性導(dǎo)致蛋白質(zhì)樣品濃縮效應(yīng)示意圖 快離子 慢離子 蛋白質(zhì)樣品 E：每 厘 米 的 電 壓 降 E I(電 流 強 度 )/ (電 導(dǎo) 率 ) E與 電 泳 速 度 成 正 比l 電 泳 開 始 后 ， 由 于 快 離 子 泳 動率 最 大 ，
5、在 快 離 子 后 面 形 成 一個 離 子 濃 度 低 的 低 電 導(dǎo) 區(qū) ， 產(chǎn)生 較 高 的 電 位 梯 度 ， 使 蛋 白 質(zhì)和 慢 離 子 加 速 移 動 ， 蛋 白 質(zhì) 樣品 被 進 一 步 濃 縮 。電位梯度的不連續(xù)性 l E：每 厘 米 的 電 壓 降 E I(電 流 強 度 )/ (電 導(dǎo) 率 )l E與 電 泳 速 度 成 正 比l 電 泳 開 始 后 ， 由 于 快 離 子 泳 動率 最 大 ， 在 快 離 子 后 面 形 成 一個 離 子 濃 度 低 的 低 電 導(dǎo) 區(qū) ， 產(chǎn)生 較 高 的 電 位 梯 度 ， 使 蛋 白 質(zhì)和 慢 離 子 加 速 移 動 ， 蛋 白
6、質(zhì) 樣品 被 進 一 步 濃 縮 。 電位梯度的不連續(xù)性 A. 樣品的濃縮效應(yīng) 四個不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括：l 緩 沖 液 成 分 及 pH的 不 連 續(xù) 性l 電 位 梯 度 的 不 連 續(xù) 性 緩 沖 液濃 縮 膠樣 品分 離 膠 A. 樣品的濃縮效應(yīng) 四個不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括：l凝膠層的不連續(xù)性： 樣 品 進 入 濃 縮 膠 有 一 個 堆 積 濃 縮效 應(yīng) (緩 沖 液 pH8.3) 蛋 白 質(zhì) 從 “ ” 極 向 “ ” 極 移動 ， 從 濃 縮 膠 進 入 分 離 膠 ， 速度 變 慢 ， 堆 積 濃 縮 。 緩 沖 液樣 品濃 縮 膠分 離 膠 A. 樣品的
7、濃縮效應(yīng) 四個不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括：l凝膠層的不連續(xù)性： 樣 品 進 入 濃 縮 膠 有 一 個 堆 積 濃 縮效 應(yīng) (緩 沖 液 pH8.3) 蛋 白 質(zhì) 從 “ ” 極 向 “ ” 極 移動 ， 從 濃 縮 膠 進 入 分 離 膠 ， 速度 變 慢 ， 堆 積 濃 縮 。 緩 沖 液樣 品濃 縮 膠分 離 膠 A. 樣品的濃縮效應(yīng) 四個不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括：l凝膠層的不連續(xù)性： 樣 品 進 入 濃 縮 膠 有 一 個 堆 積 濃 縮效 應(yīng) (緩 沖 液 pH8.3) 蛋 白 質(zhì) 從 “ ” 極 向 “ ” 極 移動 ， 從 濃 縮 膠 進 入 分 離 膠 ， 速度
8、 變 慢 ， 堆 積 濃 縮 。 緩 沖 液濃 縮 膠分 離 膠 A. 樣品的濃縮效應(yīng) 四個不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括：l凝膠層的不連續(xù)性： 樣 品 進 入 濃 縮 膠 有 一 個 堆 積 濃 縮效 應(yīng) (緩 沖 液 pH8.3) 蛋 白 質(zhì) 從 “ ” 極 向 “ ” 極 移動 ， 從 濃 縮 膠 進 入 分 離 膠 ， 速度 變 慢 ， 堆 積 濃 縮 。 緩 沖 液濃 縮 膠分 離 膠 B.電荷效應(yīng)l蛋白質(zhì)樣品進入分離膠后 pH增 大 (pH 8.9)， Gly 解 離 度 增大 ， 不 存 在 快 、 慢 離 子 之 分 ，蛋 白 質(zhì) 樣 品 在 均 一 電 場 強 度 和pH條 件 下 泳 動 。l由于各種蛋白質(zhì)pI不同，所載有效電荷不同，因此質(zhì)點的 有效遷移率不同，形成不同區(qū)帶。 緩 沖 液濃 縮 膠分 離 膠 C.分子篩效應(yīng)l分離膠的孔徑小，各分子由于大小和形狀不同，所受阻力不同，表現(xiàn)出不同的 泳動速度，即分子篩作用。分子量小，形狀為球形的泳動速度最快。 緩 沖 液濃 縮 膠分 離 膠
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