豬肺炎支原體對(duì)上皮細(xì)胞損傷的影響

豬肺炎支原體對(duì)上皮細(xì)胞損傷的影響豬肺炎支原體對(duì)上皮細(xì)胞損傷的影響 2014/10/14 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)2014年第八期方法菌液培養(yǎng)株和株接種于培養(yǎng)基中。以復(fù)壯，待菌液培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)備用。細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)于含小牛血清、青霉素和鏈霉的培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)時(shí)，胰蛋白酶消化，稀釋至，以孔接種于孔培養(yǎng)板，在、的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。感染細(xì)胞取新鮮培養(yǎng)的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的和菌液以，離心，菌體沉淀用洗滌次，用培養(yǎng)基（無(wú)血清）重懸?？装逯械募?xì)胞棄去上清，然后用洗滌次。（無(wú)血清）培養(yǎng)基重懸的接種于鋪有細(xì)胞的孔中，對(duì)照組接種等體積的（無(wú)血清）培養(yǎng)基，、的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。感染時(shí)間、劑量的篩選在感染、時(shí)取細(xì)胞上清，用試劑盒測(cè)定濃度；取細(xì)胞用法測(cè)定細(xì)胞活力，找出差異顯著的感染時(shí)間點(diǎn)；用感染劑量為、和的感染細(xì)胞，利用上一步確定的感染時(shí)間，檢測(cè)細(xì)胞活力及。檢測(cè)取感染好的細(xì)胞，先將細(xì)胞收集到離心管中，棄上清，加入過氧化氫檢測(cè)裂解液，充分勻漿以裂解細(xì)胞，取上清，按照試劑盒測(cè)定方法檢測(cè)。免疫熒光法檢測(cè)洗滌未黏附的次，每次；無(wú)水乙醇固定。洗滌次，封閉，洗滌次，與單抗（稀釋）孵育，洗滌次，與羊抗小鼠（稀釋）孵育，洗滌次，熒光顯微鏡觀察，拍照。染色免疫熒光拍照后，將孔板用洗滌次，每次，加入染色，洗滌次，每次，熒光顯微鏡觀察，拍照。統(tǒng)計(jì)分析測(cè)定結(jié)果使用軟件進(jìn)行分析。結(jié)果感染時(shí)間和感染劑量的篩選不同感染時(shí)間后細(xì)胞上清濃度和細(xì)胞活力從圖可以看出，在時(shí)，和感染細(xì)胞后，細(xì)胞活力相同，但引起的濃度顯著（）高于。不同感染劑量后細(xì)胞上清濃度從圖可以看出，不同感染體積，細(xì)胞活力無(wú)差異，但在感染量為時(shí)，其濃度顯著性高于其它感染體積（），并且顯著性高于（）。感染細(xì)胞后測(cè)定的濃度結(jié)果顯示，在感染后，和感染細(xì)胞產(chǎn)生的濃度極顯著（）高于對(duì)照，而感染細(xì)胞產(chǎn)生的也顯著（）高于。感染細(xì)胞后檢測(cè)和對(duì)細(xì)胞影響的間接免疫熒光結(jié)果見圖，與對(duì)照相比，在上的黏附量高于。感染細(xì)胞后染色對(duì)感染細(xì)胞進(jìn)行染色如圖。與對(duì)照相比，感染后，細(xì)胞受到損傷，細(xì)胞膜破損，染色質(zhì)向外周聚集，呈絮狀，細(xì)胞體積明顯腫脹變大，而感染的細(xì)胞，細(xì)胞體積也增大，對(duì)細(xì)胞損傷較輕，其細(xì)胞周邊也有較少的染色質(zhì)聚集。討論株是野毒分離株，具有一定的感染性，為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所早期分離鑒定。株經(jīng)多年的連續(xù)傳代培育為適應(yīng)無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基（）的人工致弱毒株，即株，已用該菌株研發(fā)成功具有良好的安全性和免疫保護(hù)效力的弱毒活疫苗，可有效預(yù)防豬氣喘病的發(fā)生。豬肺炎支原體致病株株和弱毒株株是來(lái)源于同一母本株的不同毒力株，全基因組分析顯示基因組差異較小，選這兩株同一來(lái)源不同毒力的感染細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行氧化損傷分析，可為該病的致病機(jī)制研究提供非常良好的理論基礎(chǔ)。這在國(guó)內(nèi)外屬于首次報(bào)道。豬肺炎支原體可以黏附于豬呼吸道上皮細(xì)胞、豬肺泡上皮、豬腎細(xì)胞、微型豬肺纖維原細(xì)胞和人肺纖維原細(xì)胞。車巧林等用豬肺炎支原體黏附豬腎細(xì)胞從而建立豬肺炎支原體黏附宿主細(xì)胞間接免疫熒光檢測(cè)的方法，張旭等也利用間接免疫熒光法檢測(cè)了不同毒力支原體分別對(duì)豬腎細(xì)胞的黏附情況。眾多的文獻(xiàn)研究豬肺炎支原體感染豬氣管上皮細(xì)胞，而利用強(qiáng)弱毒株體外感染靶細(xì)胞后的氧化損傷差異分析卻未見報(bào)道。作者希望對(duì)強(qiáng)弱毒株感染細(xì)胞的氧化損傷差異進(jìn)行分析，從感染細(xì)胞后的反應(yīng)中獲得宿主的差異表達(dá)方面，通過分子病理學(xué)，分子免疫學(xué)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等多方面來(lái)共同進(jìn)行研究，只有這樣才能更加全面準(zhǔn)確地解釋和揭示豬肺炎支原體的致病機(jī)制，才能對(duì)豬支原體肺炎的防治和診斷起到積極的作用。作者：李彥偉劉茂軍劉蓓蓓武昱孜倪博白方方紀(jì)燕張映邵國(guó)青單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心山西農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 上一個(gè)文章： 小議畜牧獸醫(yī)創(chuàng)業(yè)人才的培養(yǎng)的路徑下一個(gè)文章： 基因芯片對(duì)雞法氏囊差異的表達(dá)