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1、實驗注意事項及影響試驗結果的因素分析 一、實驗注意事項 二、影響試驗結果的因素分析 三、企業(yè)產品優(yōu)勢,一、試驗操作注意事項 2005年版中國藥品檢驗標準操作規(guī)程P297細菌內毒素檢查法 實驗前，須用肥皂洗手，用75酒精棉球消毒。 在使用洗耳球、移液管取樣時，應注意不要將洗耳球中的氣體吹入溶液中，以防止氣體中的內毒素進入供試液。 復溶0.5ml鱟試劑時，在旋渦混合器上點擊1-3秒，促進鱟試劑的溶解。,由于凝集反應是不可逆的，所以在反應過程中及觀察結果時應注意不要使試管受到振動，以免使凝膠破碎產生假陰性結果。 進行干擾實驗時，標準對照系列和含內毒素的供試品溶液系列應同時進行，并使用同一支細菌內毒素
2、標準品。,在進行鱟試劑靈敏度復核、干擾實驗和供試品細菌內毒素檢查時，各個實驗中要求的對照應同時進行，并在實驗有效的情況才能進行計算和判斷。 在進行鱟試劑靈敏度復核、干擾實驗和供試品細菌內毒素檢查時，各個實驗中要求的對照應同時進行，并在實驗有效的情況才能進行計算和判斷。,二、試驗誤差分析及改進措施 鱟試劑質量及靈敏度標示值得的影響 細菌內毒素工作標準品效價及使用的影響 實驗器皿的的影響 樣品成份及理化性質的影響 實驗員的影響 環(huán)境的影響,1、鱟試劑質量及靈敏度標示值得的影響 鱟試劑的質量：抗干擾能力，穩(wěn)定性； 鱟試劑靈敏度標示值的準確性 。,1）、鱟試劑靈敏度的誤差 是否用細菌內毒素國家標準品標
3、定？ 標示值是否準確？ 不同廠家的鱟試劑雖然標示值（）相同，但仍然存在較大的誤差。比如，標示值為0.5EU/ml的鱟試劑，有的真實靈敏度可能是0.65EU/ml；而另一個廠家的鱟試劑可能是0.30EU/ml時，按0.5-2誤差標準都是合格產品，但對同一檢品在相同的稀釋倍數(shù)下，這兩個廠家的鱟試劑產品對內毒素的檢出水平卻不同。,我本公司對鱟試劑質量得控制： 原料；工藝用水；生產環(huán)節(jié)；靈敏度標定。,鱟試劑的活性只能控制在某一個范圍內，不可能控制在一個點，我們要求允許波動的范圍盡可能的小減少批間誤差。,2、細菌內毒素標準品引起的誤差 細菌內毒素標準品種類 細菌內毒素標準品效價誤差 細菌內毒素標準品操作
4、誤差 細菌內毒素單位表示誤差 細菌內毒素標準品的錯誤使用,1）、細菌內毒素標準品種類 細菌內毒素國際標準品 細菌內毒素國家標準品 細菌內毒素工作標準品 細菌內毒素國家標準品系自大腸埃希菌提取精制而成，用于標定、復核、仲裁鱟試劑靈敏度和標定細菌內毒素工作標準品的效價。 細菌內毒素工作標準品系以細菌內毒素國家標準品為基準標定其效價，用于試驗中鱟試劑靈敏度復核、干擾試驗及各種陽性對照。 2005年版中國藥典,2）、細菌內毒素標準品效價誤差 細菌內毒素國家標準品與細菌內毒素工作標準品之間或細菌內毒素工作標準品與細菌內毒素工作標準品之間的生物效價存在一定的誤差，用不同細菌內毒素標準品復核同一批鱟試劑靈
5、敏度時可能存在一定的誤差。中國藥典要求“當c在0.5-2(包括0.5和2)時，方可用于細菌內毒素檢查，并以標示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度?！痹囼灲Y果只要在這合格范圍內表示鱟試劑標示靈敏度準確。,3）、內毒素標準品操作誤差,取細菌內毒素工作標準一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，用75%酒精棉球擦拭后啟開，防止玻璃屑落入瓶內。,,,正確,（易折點）錯誤,注意：只能在安瓿的易折點上部開啟內毒素，不能沿易折點開啟，防止振蕩過程中內毒素粘在封口膜上。 只能取1ml的細菌內毒素檢查用水復溶細菌內毒素工作標準品。 若使用的為細菌內毒素國家標準品，可按其使用說明書中的方法將其稀釋
6、至規(guī)定濃度后分裝保存。若為細菌內毒素工作標準品，為一次性使用。,4）、錯誤使用 有部分客戶使用廠家生產的細菌內毒素來復核鱟試劑的靈敏度，這是一種錯誤行為，更有甚者使用廠家生產的細菌內毒素來交叉復核鱟試劑的靈敏度，這是一種嚴重錯誤行為。,3、實驗器皿的影響 器皿的計量管理（校正） 器皿的選擇標準 器皿的正確處理,1）、器皿的選擇標準 鱟試驗對器皿的要求：刻度準確；內表面光滑；易于清理。細菌內毒素檢查實驗不宜選用注射器，最好使用經過校正的刻度玻璃吸管或吸嘴。注射器刻度不精確，內壁磨沙面吸附內毒素，而且要特別注意注射器針頭引入的鐵離子對試驗結果的干擾，故不宜選用注射器。,如果用量不大，使用頻率不高，
7、建議大家選用本公司提供的一次性耗材。無熱原耗材是一種在此行業(yè)中被鑒定為無內毒素和-葡聚糖污染的產品，其中包括, 無熱原試管、無熱原移液器吸頭。這些產品可以給您的工作帶來很大方便,另外，當實驗出現(xiàn)誤差時可首先排除器皿方面的因素,很快分析判斷出誤差原因。,2）、器皿的正確處理 2005年版中國藥品檢驗標準操作規(guī)范278頁細菌內毒素檢查法“實驗準備”規(guī)定：“將被洗滌的玻璃器皿用洗滌劑和自來水洗凈并烘干水分后，置洗液中浸泡4小時，取出將洗液瀝干，用自來水將殘余的洗液洗凈，再用蒸,餾水沖洗干燥后置適宜的密閉金屬容器中，迅速置烤箱中，除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內毒素?！?應該特別注意，該規(guī)程明確規(guī)定
8、最后沖洗玻璃器皿必須“用蒸餾水沖洗，禁用純化水沖洗。”有的客戶使用反滲透制備的純化水沖洗試驗用玻璃器皿，結果試驗中所有的陽性對,照都為陰性，復核鱟試劑靈敏度時試驗結果誤差較大，這主要是由于純化水和蒸餾水的質量不同所造成的。因純化水中存在的陰陽離子經250高溫干烤不能完全被破壞，這時不同的離子就產生對鱟試劑酶反應抑制或增強的反應，為了保證試驗結果的準確性和檢驗報告的權威性，我們應該嚴格遵守操作規(guī)程，用多效蒸餾水沖洗鱟試驗用玻璃器皿。,移液管浸泡洗液時，應如何放置？ A、正 B、反 反放（尖端向上）的優(yōu)點？ 1、保護移液管刻度的準確性； 2、防止標本缸底部結晶體堵塞移液管。,4、樣品成份及理
9、化性質的影響 -葡聚糖樣物質的影響 PH值的影響 金屬離子和弱酸陰離子的影響 藥物濃度的影響,1）、 -葡聚糖樣物質的影響 常見現(xiàn)象：假陽性。 鱟試劑的特異性系指在藥品、生物制品和血液制品中鱟試劑能準確測出被測物質內毒素的能力，既不能造成樣品內毒素的漏檢，也不能將其它物質錯判為內毒素。,目前我公司研究證明，已知能與鱟試劑發(fā)生反應的物質有細菌內毒素和-葡聚糖，而內毒素反應曲線為S型特征曲線，-葡聚糖反應曲線為經過0點的斜線。鱟試劑的特異性差的另一種表現(xiàn)，是將其它物質（如-葡聚糖）判定為內毒素，錯誤將合格藥品判為不合格，造成制藥廠直接經濟損失。,鱟試劑反應機理圖,判斷假陽性的方法： 1、特異性鱟試
10、劑法； 2、定量反應曲線分析法； 3、家兔模擬試驗法。,假陽性事件： 1、2003年山東省青州某制藥廠，5%葡萄糖注射液（規(guī)格：100ml 產品批號：0307040101）； 2、2004年廣東省湛江某制藥公司，Vc注射液（產品批號：）； 3、2006年上海市某制藥公司，塑瓶裝5%葡萄糖注射液（產品批號：0501142）；,2）、PH值對反應速度的影響 常見現(xiàn)象：樣品陽性不成立。 鱟試劑與內毒素反應的最適宜pH在6.5-8.0；pH 3 或10時，酶活性受到抑制。,,,,,相對活力,PH,7.0,PH對反應速度的影響: 影響酶原的激活； 影響酶分子的構象，過高過低的PH會改變酶的活性中心的構象
11、，或甚至改變整個酶分子的機構使其變性失活。,故鱟試驗時，供試品 pH 最好應預調和6.5-8.0 為好，必要時可用無內毒素的 HCl 或NaOH 稀溶液調節(jié) pH 值。美國、日本藥局方以及中國藥典故2005版規(guī)定檢品必須調節(jié)PH值6.0-8.0。,成功案例： 1、頭孢吡肟 2、鹽酸土霉素、土霉素 3、喹諾酮類輸液 4、血液保存液、紅細胞保存液,3）、金屬離子和弱酸陰離子 離子對細菌內毒素測定結果影響較大，一方面陽離子如Fe3+、Al3+強度較大會引起內毒素的聚集造成內毒素局部濃度過高，同時還必須注意高價陽離子（如Fe3+）的氧化性對鱟試劑酶反應具有強抑制作用；重金屬離子如Ag+、Cu2+、P
12、b2+可以使蛋白質變性而使酶失活；另一方面鱟試劑必須在二價陽離子Ca2+、Mg2+的參與下才能被激活形成凝膠反應。,許多藥物因PH值10時，其中的陰離子會吸收鱟試劑中的 Ca2+、Mg2+離子，使實驗呈假陰性。,成功案例： 1、碳酸氫鈉注射液 2、乙肝疫苗 3、注射用果糖二磷酸鈉,4）、藥物濃度 1、10%葡萄糖注射液 2、白蛋白、小牛血清 3、醫(yī)用透明質酸鈉 4、中藥類注射液,5、實驗員的影響 操作時嚴格按操作規(guī)程進行，安瓿開啟前應先用酒精棉球擦拭曲頸部，用將頸部折斷，防止碎玻屑掉入安瓿內。在鱟試劑的溶解、樣品的稀釋及加樣時，取樣均應準確。如果一人獨立完成試驗，可先稀釋配制好內毒素標準溶液和
13、樣品溶液，然后開啟復溶鱟試劑，最后加樣，盡可能縮短鱟試劑溶液暴露在空氣中的時間（最好控制在15分鐘內）。,6、環(huán)境的影響 保溫時間 保溫溫度 1）、保溫溫度 將細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水稀釋成2，進行鱟試驗，然后分別放置于25、28、31、34、37、41、43、46、49水浴保溫。實驗中觀察到凝膠形成的速度隨著溫度的升高而加快，但到達49保溫90min也未出現(xiàn)凝膠。,從實驗可以看出，溫度對鱟試劑的靈敏度影響很大，保溫溫度在2541之間，隨著溫度的升高，反應速度也升高，41尚未達到反應速度峰值，25 時反應速度已相當快；在4146之間，溫度對鱟試劑的靈敏度無明顯影響；達到49或更
14、高溫度時，隨溫度升高而使酶蛋白逐漸變性，則鱟試劑被破壞，反應速度反而降低。,2）、保溫時間 將細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水稀釋成2，進行鱟試驗，37保溫，分別在10、20、30、40、50、70min時觀察，發(fā)現(xiàn)凝膠的形成狀態(tài)隨著時間的延長而堅固。,因此夏天室溫較高，如果試驗操作時間太長，細菌內毒素與鱟試劑混合液不等進入反應儀器反應已開始，實際反應時間超過1小時。由于室溫不同，冬夏季節(jié)、南北地區(qū)之間的操作誤差將會很大。即使在25準室溫下操作，操作時間拖得過長，細菌內毒素含量較高時，測定誤差也不會小。,三、企業(yè)產品優(yōu)勢 1、能準確判斷假陽性 用本企業(yè)研制生產的定量鱟試劑第一家準確無
15、誤地檢測出了內毒素與葡聚糖二者之間的區(qū)別，并公布了內毒素與非內毒素反應曲線。截止目前，還沒有第二個品牌的鱟試劑將假陽性區(qū)別出來，其他國內外研究機構也未公布同類型曲線。 對于假陽性的鑒別已經遠遠走在了世界同行業(yè)的前面。,2、對外交流歷史悠久，全面掌握中美兩國鱟試劑的區(qū)別 1）對外交流我公司歷史最悠久、交流技術最全面； 2）我公司掌握了中國和美國鱟試劑的全面區(qū)別； 3）用美國和中國的內毒素標準品，我公司鱟試劑標示靈敏度都相當準確。 4）通過十多年的技術交流結果顯示，本公司的鱟試劑與美國同類產品質量相比沒有任何差別，而且個別項目要優(yōu)于美國產品。,三、售后技術服務專業(yè)，技術優(yōu)勢明顯 細菌內毒素檢查法
16、在我國已開展了十多年，經過許許多多專家學者的努力，目前該行業(yè)已經取得了非常重要的成果，但是該領域仍然有許多我們無法解決問題的存在，它并不想我們想象的那么簡單，這些問題的存在嚴重阻礙了該行業(yè)的進一步發(fā)展，我們將與客戶的交流以及客戶咨詢的相關問題，進行一次歸納總結。通過工作中出現(xiàn)的問題有必要對以下情況進行交流，以加強對細菌內毒素檢查法的正確理解，同時糾正一些錯誤的觀念。,如何全面理解細菌內毒素檢查法中污染物對試驗結果的影響？ 如何正確認識器皿洗滌的重要性？ 如何正確理解鱟試劑的抗干擾能力和鱟試劑的特異性？,許多客戶對污染的認識是不全面或錯誤的，他們認為在細菌內毒素檢查過程中，器皿被污染的結果必然導
17、致陽性結果的出現(xiàn)，但試驗結果正好與他們的認識有時正好相反，可能陽性對照全為陰性，對此亦有百思不得其解。要正確理解這個問題，首先要正確理解鱟試劑與內毒素的反應機理，鱟試劑與內毒素的反應為一系列酶反應，生物酶反應受許多因素的干擾。在日常工作中，我們要特別注意一些因素對試驗結果的影響，如PH值、器皿的潔凈度以及環(huán)境因素等。,解決這些問題需要非常豐富的專業(yè)知識，我們公司在專業(yè)知識方面具有得天獨厚的優(yōu)勢，其他鱟試劑生產企業(yè)望塵莫及。 下面我們將客戶遇到的困難，其他鱟試劑生產企業(yè)無法解決的技術問題，最終由我們幫助解決了的案例列舉如下：,1、輸液塑瓶溶出物聚丙烯添加劑假陽性反應鑒別方法； 2、鹽酸土霉素細菌內毒素定量分析回收率偏低的技術問題； 3、陽性對照為陰性結果的問題； 4、頭孢類抗生素細菌內毒素檢測假陽性問題； 5、乙肝疫苗細菌內毒素檢測樣品陽性對照為陰性問題。,通過解決以上技術問題，我們展示了企業(yè)的技術實力，加強了與客戶之間的溝通，贏得了客戶的信任，贏得了市場。,
《細菌內毒素檢查法》PPT課件
