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1、第九章 臨床常見病原體檢測 Detection of clinical pathogen,,1、臨床各類標本的采集、運送和檢查的方法； 2、臨床常見病原體的種類分布及變遷情況 ； 3、耐藥病原體檢測的意義。,醫(yī)院感染常見病原體的檢查。,掌握,1、藥敏試驗的原理和方法 2、性傳播疾病病原體檢查的內(nèi)容,了 解,熟 悉,,一、臨床各類標本的采集運送和檢查方法 二、病原體耐藥性檢測 三、臨床常見病原體檢測 四、病毒性肝炎檢測 五、性傳播疾病病原體檢測 六、醫(yī)院感染常見病原體檢測,一、臨床各類標本的采集運送和檢查方法,,標本采集的基本原則,根據(jù)病史與臨床表現(xiàn)確定標本采集的類型與部位，盡量采集病變明顯
2、部位標本。 在發(fā)病的早期或急性期采集標本，最好在抗生素使用前（如使用過抗生素應在申請單上注明）。 采集標本防止污染，并置于無菌容器，加蓋密封、立即送檢。 標本必須貼上標簽，與檢驗申請單同時送檢。 所有的標本都視為感染性標本，做好安全防護。,（一）血液標本的采集,血 液,菌血癥、敗血癥或 膿毒血癥,發(fā)熱初期 發(fā)熱前 2 小時 發(fā)熱高峰期,成人：10-20 嬰兒、兒童：5,24小時內(nèi) 采血23次,采集頻率,采血量（ml）,采集時間,,,,需厭氧同時采集可增加陽性率,（二）尿液標本的采集,采集量：10-20ml,中段尿 晨尿 注意清潔 外生殖器,導尿 更換新的導 尿管,穿刺尿 考慮厭氧菌 感染,（三
3、）糞便標本采集,自然排便者：挑取膿、血或粘液部分于清潔容器中送檢 排便困難者：采用直腸拭子采集。 懷疑霍亂弧菌感染引起的腹瀉，立即接種或將標本置于堿性蛋白胨水或卡-布運送培養(yǎng)液送檢。 傳染性腹瀉應連續(xù)送檢3次。,（四）呼吸道標本,類型：鼻咽拭子、痰 經(jīng)氣管采集的標本。,合格痰標本 鱗狀上皮10/LP。,上呼吸道存在正常菌群， 在采集標本與結果分析 時應予考慮！,（五）腦脊液與其它無菌體液采集,胸水 腹水 心包液,無菌采集是培養(yǎng)成功 的首要因素!,,,腦膜炎奈瑟菌 肺炎鏈球菌 流感嗜血桿菌 不耐冷！,（六）眼、耳標本采集,采樣容器：運送拭子 眼部標本：亦可在局部麻醉后取角膜
4、刮屑。 耳標本：外耳道癤和中耳道炎用拭子采樣， 鼓膜穿刺亦可用于新生兒和老年人。,（七）泌尿生殖道標本采集,女性： 外陰糜爛面病灶邊緣分泌物、陰道宮頸口分泌物。 生殖道皰疹常穿刺抽取皰疹液。 盆腔膿腫患者則于直腸子宮凹陷處穿刺取膿液。,注：宮頸拭子采樣時，用拭子插入宮頸3-4 cm， 輕輕轉動并停留時10-15秒后取出,（七）泌尿生殖道標本采集,（七）泌尿生殖道標本采集,男性： 尿道口分泌物：性傳播性疾病 前列腺液：前列腺炎 尿道拭子：在取材前2小時內(nèi)不應排尿，用男性采樣拭子插入尿道3-4 cm，輕輕轉動并停留時10-15秒后取出,,（八）創(chuàng)傷、組織和膿腫標本,,不同部位采集多份標本,采集膿液
5、及病灶深部分泌物,無菌干燥注射器抽取,取膿液后立即排凈注射器內(nèi)空氣， 針頭插入無菌橡皮塞送檢。,創(chuàng)傷范圍大,開放性膿腫,封閉性膿腫,疑為厭氧菌,（九）血清,用于檢測患者特異性抗原抗體 病毒肝炎性抗原抗體檢測 梅毒、艾滋病病毒抗原抗體檢測 血清學試驗,標本送檢,一般要求標本采集后2小時內(nèi)送達實驗室。 血培養(yǎng)標本、腦脊液標本延遲送檢不應放4保存。 烈性傳染病標本需專人護送。,,可能貼錯條形碼,這樣不對，扭著我腰都酸啦！,標本的實驗室質量評估標準,1、標本信息要全。 2、仔細核對標本采集日期和送檢日期。延誤的標本，一般情況 下不接收。通常用于細菌學檢驗的標本的存放不要超過
6、24h。 而病毒檢測的標本可于4存放23天。 3、檢查送檢容器是否完整，有無破損或滲漏等情況，若有則不予 接收。 4、標本儲存、運送方式不當，不予接收。,標本的實驗室質量評估標準,5、明顯被污染的標本不予接收。 6、標本量明顯不足的標本，不予接收。 7、同一天申請做同一實驗的重復送檢標本(血培養(yǎng)除外)，不予接收 8、對于烈性傳染病標本的采集和運送應嚴格執(zhí)行相關規(guī)定，要有完善的防護措施，按規(guī)定包裹及冷藏，附有詳細的采樣及送檢紀錄，由專人護送,檢查方法,（一）直接顯微鏡檢查 （二）病原體特異性抗原檢查 （三）病原體核酸檢查 （四）病原體的分離培養(yǎng)和鑒定 （五）血清學試驗,（一）直接顯微鏡檢查-
7、不染色標本,方法：壓滴法、懸滴法、 濕片法。 意義：是否有生長、活動方式。部分病原體可借此初步診斷，如梅毒螺旋體。,（一）直接顯微鏡檢查-染色標本,染色標本目的：了解細菌的形態(tài)、染色性或觀察宿主細胞內(nèi) 包涵體。 方法：革蘭染色、墨汁染色、抗酸染色、熒光染色 意義：快速診斷的方法之一,革蘭染色,陽性：紫色或紫紅色 陰性：紅色,墨汁染色 目的：檢查新型隱球菌,腦脊液標本如不能及時送檢，是否可冷藏保存？為什么？,（五）腦脊液與其它無菌體液采集,胸水 腹水 心包液,無菌采集是培養(yǎng)成功 的首要因素!,,,腦膜炎奈瑟菌 肺炎鏈球菌 流感嗜血桿菌 不耐冷！,抗酸染色,陽性：菌體呈紅色
8、陰性：菌體呈藍色 主要用于分枝桿菌（結核）、奴卡菌鑒別,熒光染色,用形態(tài)學和免疫學相結合的方法可特異性地檢測某些病原體的存在 陰道加德納菌 沙眼衣原體,SARS（severe acute respiratory syndrome ）病原體的確定。,電鏡檢查,電鏡檢查不常規(guī)用于臨床，對某些病毒感染卻有確診的價值,(二)病原體特異性抗原檢查,,原理：利用抗原抗體之間的特異性反應，用已知 抗體檢測患者血清及其他體液中的待測抗原。,方法：免疫熒光技術、酶聯(lián)免疫技術、 化學發(fā)光 技術、乳凝集試驗、對流免疫電泳,不足：標本中如果存在多種正常寄居微生 物， 可因交叉抗原存在
9、而不能肯定診斷。,(二)病原體特異性抗原檢查,細菌的血清分型： 檢測細菌不同的抗原構造，還可分析細菌的菌群和血清型，如沙門菌屬、志賀菌屬和霍亂菌屬等,（三）病原體核酸的檢測,意 義 靈敏度高，是檢測病原體微生物最靈敏的方法，但具有一定的假陽性與假陰性。 特異性強，陽性只表明存在某種病原體的核酸，是否正被感染應結合臨床具體分析。 特別適用于目前尚不能分離培養(yǎng)或很難分離培養(yǎng)的微生物。 適用于核酸變異的病原微生物，如病毒,（三）病原體核酸的檢測,常用試驗方法有： 1、聚合酶鏈式反應PCR（polymerase chain reaction）。 2、核酸探針雜交技術 3、實時熒光定量PCR （Real
10、time PCR） 4、基因芯片等,（三）病原體核酸的檢測,（四）病原體的分離培養(yǎng)和鑒定,明確感染病原體 提供體外抗微生物藥物敏感試驗結果,1.細菌 分離培養(yǎng)是微生物學檢驗中確診的關鍵步驟，標本的正確采集尤為重要！,（四）病原體的分離培養(yǎng)和鑒定,采集合適的標本,合適的培養(yǎng)方法/培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件,菌落特征、生化反應結果和血清學實驗進行鑒定,,,（四）病原體的分離培養(yǎng)和鑒定鑒定的方法：手工法、儀器法（半自動、全自動、快速質譜儀）,全自動細菌鑒定儀,質譜儀,2.不能人工培養(yǎng)的病原體 將標本接種易感動物、雞胚或行細胞培養(yǎng),（四）病原體的分離培養(yǎng)和鑒定,（五）血清學試驗用已知病原體的抗原檢測患者
11、血清中相應抗體以診斷感染性疾病。,人體感染病原體后經(jīng)過一定時間產(chǎn)生特異性抗體，在體內(nèi)可維持數(shù)月或更長時間。,（五）血清學試驗,方法：凝集試驗、沉淀試驗、補體結合試驗、 間接免疫熒光、放射免疫、酶聯(lián)免疫吸附 試驗。 雙份血清檢查：病程早期和晚期分別采血清2-3份檢查，雙份血清 的滴度呈4倍或4倍以上升高，考慮病原體感染。 單份血清檢查：特異性 IgM可作為感染性疾病的早期診斷指標，且 可區(qū)分原發(fā)與復發(fā)感染。,（五）血清學試驗,適用范圍 血清學診斷可用于現(xiàn)癥診斷，還可以用于疾病追溯調查。 血清學診斷對于某些病原體不能培養(yǎng)或難以培養(yǎng)的疾病，可以提供診斷的依據(jù)。 不適于疾病的早期診
12、斷，因為抗體檢出最早也需在感染4-5天以后，2周后效價才逐漸增高,（六）細菌毒素檢測,內(nèi)毒素：革蘭陰性桿菌死亡或自溶后釋放。 外毒素：葡萄球菌腸毒素、肉毒毒素、霍亂腸毒素。 方法有生物學法、基因探針技術、免疫血清法、儀器法,,二、病原菌耐藥性檢測,,,概念及方法,藥物敏感性試驗:測定抗感染藥物在體外對病原微生物有無 抑菌或殺菌作用的方法稱為簡稱藥敏試驗。 方法：1、 K-B紙片瓊脂擴散法 2、稀釋法 3、濃度梯度紙條擴散法 4、耐藥篩選試驗 5、折點敏感試驗,,,,,,,,藥物敏感試驗,待檢菌,生理鹽水,MH平板,藥敏試片,,K-B紙片瓊脂擴散法(Kirby-Baue
13、r disc agar diffusion method）,,,18-24小時培養(yǎng),,藥物敏感試驗,稀釋法（dilution test） 瓊脂稀釋法 肉湯稀釋法,,藥物敏感試驗,濃度梯度紙條擴散法(gradient diffusion method),藥物敏感試驗,耐藥篩選試驗：以單一藥物、單一濃度檢測細菌耐藥性。 折點敏感試驗：是僅用特定抗生素檢測細菌耐藥性。,藥物敏感試驗,報告方法： 敏感(susceptible，S) S ：測試菌能被測定藥物常規(guī)劑量給藥后在體內(nèi)達到的血藥濃度所抑制或殺滅。 耐藥(resistant，R) R：測試菌不能被在體內(nèi)感染部位可能達到的抗菌藥物濃度所
14、抑制。,藥物敏感試驗,中度敏感(intermediate，I) I：測試菌能被測定藥物大劑量給藥后在體 內(nèi)達到的血藥濃度所抑制或在測定藥物濃集部位的體液(如尿 )中被抑制。 最低抑菌濃度（Minimal inhibitory ncentration MIC) MIC ：夠抑制 檢測菌肉眼可見生長的最低藥物濃度稱為最低抑菌濃度。 執(zhí)行標準均來自臨床實驗室標準協(xié)會（CLSI）,（一） 概 念,耐藥性（drug resistance）：是指細菌對藥物所具有的相 對抵抗性。 固有耐藥性（intrinsic resistance）：是由細菌染色體基 因決定而代代相傳的耐藥，如腸
15、道桿菌對青霉素的耐藥。 獲得耐藥性（acquired resistance）：是細菌與藥物反復接觸后對藥物的敏感性降低或消失，大多由質粒介導其耐藥性，但亦可由染色體介導。,（二）耐藥性病原體,1、耐甲氧西林葡萄球菌（MRS） 2.氨基糖苷類抗生素高耐藥和耐萬古的腸球菌（VRE） 3.耐青霉素肺炎鏈球菌（PRSP） 4、超廣譜-內(nèi)酰胺酶的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌（ESBL） 5、多重耐藥或泛耐藥的銅綠假單胞菌和鮑曼不動相菌 6、耐拉米夫定和泛昔洛韋的乙肝病毒。,（三）耐藥機制,1、細菌水平和垂直傳播耐藥基因的整合子系統(tǒng)； 2、產(chǎn)生抗生素滅活酶或鈍化酶； 3、改變藥物的作用靶位； 4、外膜通透性下
16、降； 5、主動外排系統(tǒng)過度表達； 6、形成生物膜及外源耐藥基因的獲得。 細菌的多種耐藥基因可協(xié)同作用，導致多耐藥菌株的出現(xiàn)。,（三）耐藥機制,,,（四）耐藥菌檢測的意義,（四）耐藥菌檢測的意義,（四）耐藥菌檢測的意義,（四）耐藥菌檢測的意義,檢出耐藥菌需采取的重要措施： 接觸隔離??！,,（五）病原體耐藥基因檢測,耐藥基因的產(chǎn)生：1、獲得外源性基因 2、細菌自身基因突變 細菌耐藥基因檢測方法：PCR法、生物芯片、PCR-RFLP分析、 動測序、PCR-SSCP分析,三、臨床常見病原體檢測,細菌、病毒、真菌、寄生蟲、支原體、衣原體以及立克次體等。,（一）細菌感染檢查項目的選擇,細
17、菌感染,抗原抗體檢測,PCR技術 基因探針技術,培養(yǎng),涂片鏡檢,,,,,,（二）病毒感染檢查項目的選擇,,電鏡檢查,核酸檢測（PCR）,細胞培養(yǎng),特異性抗體檢測,,,,,,（三）真菌感染檢查項目的選擇,,真 菌,,培養(yǎng),,涂片鏡檢,抗原檢測,災光定量PCR 核酸雜交技術 rDNA序列測序 基因組核酸電泳 核型分析,,,G試驗 GM試驗,,,,（四）寄生蟲病,病原學診斷 免疫學診斷 寄生蟲 DNA探針技術 PCR,,（四）支原體檢測,,支 原 體,肺炎支原體：肺炎 解脲支原體、人型支原體： 泌尿生殖道感染,培養(yǎng)法,免疫熒光法 光定量PCR和DNA探針技術,（六
18、）螺旋體檢測,暗視野顯微鏡檢查：,梅毒血清學試驗 （1）過篩試驗：RPR、VDRL、TRUST （2）確診試驗：FTA-ABS、MHA-TP、 TPPA TP-PCR：TPPCR檢測梅毒螺旋體DNA，特異性很強，敏感性很高，是目前診斷梅毒螺旋體的先進方法。PCR檢測梅毒螺旋體的DNA，其敏感性、特異性均優(yōu)于血清學方法,（六）螺旋體檢測,（七）立克次體檢測驗,專性細胞內(nèi)生長的原核細胞性微生物 對多種抗生素敏感 引起自然疫源性疾病，且為人畜共患 斑疹傷寒（流行性斑疹傷寒、地方性斑疹傷寒、 加拿大斑疹傷寒） 立克次體屬 斑點熱（洛磯山斑
19、點熱、紐扣熱、昆士蘭熱、 立克次體痘、北亞蜱傳斑疹傷寒）,,,（七）立克次體檢測,外斐試驗：為非特異性血清學診斷試驗，用于 斑疹傷寒、斑點熱和恙蟲病的確診 特異性血清學試驗：免疫熒光試驗、酶聯(lián) 吸附試驗和補體結合試驗等,（八）衣原體感染檢測,直接顯微鏡檢查：檢查衣原體包涵體 細胞培養(yǎng)：陽性可明確診斷。 直接熒光抗體檢測 定量PCR DNA探針,（九）流感病毒的檢測,病毒核酸檢測 病毒分離培養(yǎng) 病毒抗原檢測 血清學診斷,（十）嚴重急性呼吸道綜合征（SARS）病毒的檢測,免病學方法：免疫熒光試驗（IAF） 酶聯(lián)免疫吸咐試驗（ELISA） 基因檢測方法
20、細胞培養(yǎng),實驗結果分析和臨床應用注意點,1、分離培養(yǎng)的陰性結果不能完全排除感染的可能; 2、抗原檢測需考慮共同抗原引起的交叉反應； 3、核酸檢測由于靈敏度高，影響因素多，容易出現(xiàn)假陽性或假陰性; 4、血清學試驗：IgM現(xiàn)期感染,IgG既往感染。,四、 病毒性肝炎檢測,病毒性肝炎主要有7型， 甲型(HA)---甲型肝炎病毒 (HAV) 乙型(HB)---乙型肝炎病毒 (HBV) 丙型(HC) ---丙型肝炎病毒 (HCV) 丁型(HD)---丁型(HDV)和戊型肝炎病毒 (HEV) 戊型(HE)---戊型肝炎病毒 (HEV) 庚型(HG)---庚型肝炎病毒 (HGV) 、 輸血傳播病毒肝炎---
21、輸血傳播病毒(TTV),目前常用的檢測方法,酶聯(lián)免疫吸咐試驗（ELISA） 實時熒光PCR 聚合酶聯(lián)反應（PCR） 放射免疫法（RIA） 血細胞凝集法 斑點雜交法,,（一）甲型肝炎病毒標志物檢測,（一)甲型肝炎病毒標志物檢測,標志物名稱 檢測方法 參考值抗HAV-IgM ELISA 陰性抗HAV-IgG ELISA 陰性抗HAV-IgA ELISA 陰性HAVAg ELISA 陰性HAV-RNA RT- PCR 陰性,(二) 乙型肝炎病毒標志物檢測,(二)乙型肝炎病毒標志物檢測,(二)乙型肝炎病毒標志物檢測,(二)乙型肝炎病毒標志物檢測,1,3,
22、4,5,2,,,,,大三陽,小三陽,(二)乙型肝炎病毒標志物檢測,HBV DNA： 是HBV感染最直接，最靈敏和最特異的檢測指標，且血清中HBV DNA的水平可作為治療方案與療效觀察的指標。 是診斷乙型的佐證，表明HBV復制及有傳染性。也用于HBsAg疫苗后垂直傳播的阻斷效果評價,(三)丙型肝炎病毒標志物,丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）為黃病毒屬、單鏈正股RNA病毒。 血液為其主要傳播途徑。 病情雖較乙型肝炎輕，但更易轉為慢性。,(三)丙型肝炎病毒標志物,檢測方法與參考值 標志物 檢測方法 參考值 HCV-RNA RT-PCR 陰性 抗-HCV
23、IgM ELISA 陰性 抗-HCV IgG ELISA 陰性,(三)丙型肝炎病毒標志物,(三)丙型肝炎病毒標志物,五、性傳播疾病病原體檢測,傳播途徑： 性行為傳播 間接接觸傳染 血液與血制品傳播 對胎兒與新生兒的傳播 職業(yè)性傳播,,常見的性病有哪些？,疾病種類：20余種 1、艾滋病 2、梅毒------螺旋體 3、淋病 4、軟下疳 5、 生殖器皰疹 尖銳濕疣 6、非淋病性尿道炎支原體、衣原體,（一）流行病學,,,,病毒,細菌,,,國家乙類傳染病,中國愛滋病村里的病人,愛滋病家庭遺孤,正規(guī)醫(yī)療機構是性病患者的正確選擇
24、,（六) 醫(yī)院感染常見病原體檢查,醫(yī)院感染：又稱院內(nèi)感染或醫(yī)院獲得性感染。是指住院患者在醫(yī)院內(nèi)獲得的感染，包括住院期間發(fā)生的感染和醫(yī)院內(nèi)獲得出院后發(fā)生的感染。 醫(yī)務工作人員在醫(yī)院內(nèi)獲得的感染也屬醫(yī)院感染,(一) 醫(yī)院感染的判斷標準,1、無明確潛伏期的感染，規(guī)定入院48小時后發(fā)生的感染為醫(yī)院感染；有明確潛伏期的感染，自入院時起超過平無潛伏期后發(fā)生的感染。 2、本次感染直接與上次住院有關。 3、在原有感染基礎上出現(xiàn)其他部位的感染（除外膿毒血癥遷徙灶），或在原感染已知病原體基礎上又分離出新的病原體（排除污染和原來的混合感染）的感染。,(一)醫(yī)院感染的判斷標準,4、新生兒在分娩過程中產(chǎn)生獲得的感染。
25、5、由于診療措施激活的潛在性感染，如皰疹 病毒、結核桿菌的感染。 6、醫(yī)務人員在醫(yī)院工作期間獲得的感染。,(二)病原學,,,某年我分離院菌屬分布圖,,(二)病原學,,肝炎病毒、流感病毒、皰疹病毒 水痘病素、輪狀病毒、 巨細胞病毒、腸道病毒、柯薩奇病毒,病 毒,真菌類、弓形蟲、肺孢子蟲,(三)常見臨床類型,1、下呼吸道感染 2、尿路感染 3、手術切口感染 4、胃腸道感染 5、血液感染 6、皮膚和軟組織感染,(四)醫(yī)院環(huán)境中細菌污染監(jiān)測和滅 菌效果的監(jiān)測,,空氣（CFU/m3）,物體表面（CFU/m2）,醫(yī)務人員（CFU/m2）,細菌、真菌,病毒,寄生蟲,螺旋體 支原體 衣原體 立克次體,血液、尿液、糞便 無菌體液、各種拭子 組織、膿液 血清,顯微鏡檢查 培養(yǎng) 抗原抗體檢測 分子生物學技術 G試驗、GM試驗,電鏡檢查 細胞培養(yǎng) 抗原抗體檢測 核酸檢測,病原學檢查 免疫學檢查 DNA探針 PCR,耐甲氧西林葡萄球菌 （MRSA、MRSE） 大腸、肺克（ESBL） 耐青霉素的肺鏈（PRSP） 耐萬古腸球菌（VRE） 泛耐的銅綠 泛耐的鮑曼,小 結,思考題,1、臨床標本采集的基本原則是什么？ 2、臨床感染常見的病原體類型有哪些？,,謝謝！ 電話：13517721420 郵箱：JLJ,
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