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1、固定化酶與固定化細胞技術 王海磊 河南師范大學生命科學學院AEM室,2. 酶在應用中受到的限制因素：,1. 酶作為:生物催化劑的優(yōu)點,穩(wěn)定性差，易失活 反應速度隨時間減慢（3分鐘內吸光度的變化） 回收困難（淀粉酶水解廢棄淀粉） 經濟上不合算：多不能重復使用。 一些酶價格昂貴（漆酶用于木板粘合）,反應專一性強。 催化效率高（比一般催化劑高107-1013倍）。 反應條件溫和（常溫常壓）。,（1）人工合成酶：應用化學合成法合成具有像酶那樣活性的催化劑。這是有機合成和聚合化學中的最新技術。但距實際應用還有很大距離。 （2）酶的人工“改性”、“修飾”：酶和細胞固定化是其中的一類。其它如基因工程、化學修
2、飾等方法。,3. 克服上述限制性因素的途徑：,難得的報道：人工合成脂肪酶獲得成功 隨著生物產業(yè)的發(fā)展，人類對環(huán)境逐步認識，酶的廣泛用途越來越得到人類的重視，尤其脂肪酶，在日化洗滌劑領域、醫(yī)藥美容領域、能源領域生物柴油生產中顯得無可替代的優(yōu)勢。一般脂肪酶生產主要來源于發(fā)酵微生物生產法獲得，產量受到限制，成本較高，很難滿足工業(yè)需求。關于人工合成脂肪酶在中國乃至世界未曾有過相關報道。 經過不懈努力，我公司通過人工合成的手段獲得成功，實屬國際首例。經檢驗它不僅具備生物酶的通性，具有生物酶的全效功能，而且其催化性能、環(huán)境要求、毒化耐性各項指標遠遠高于普通生物酶。生產成本不足普通酶的三分之一，而且不受產量
3、的局限，可大規(guī)模投入生產。 石家莊市華北聯化科技有限公司,第一節(jié) 固定化酶 （Immobilized Enzyme）,一、發(fā)展概況,(1) 1916，Nelson和Griffin發(fā)現蔗糖酶結合于骨炭末上仍具有活力，但未引起人們重視。 (2) 1950前，研究不多，不超過10篇相關論文。有目的開展固定化研究始于50年代。1953，Grubhofer和Schloith將聚氨基聚苯乙烯樹脂重氮化后與淀粉酶、蛋白酶結合最早固定化酶 (3)60年代進展較快：固定化酶投入工業(yè)化生產。 (4)70年代為快速發(fā)展時期。,固定化酶：連接于某種載體上或者限制在一定空間范圍內、能連續(xù)使用的酶。,二、制備固定化酶的原
4、則,1、保持酶原有專一性、高效催化能力和常溫常壓下起催化反應的特點。制備盡可能在溫和條件下進行（低溫、最適pH、水溶液中）。 2、能回收、貯藏和反復使用酶和載體結合牢固性問題。 3、有一定機械強度，以利于機械化、自動化操作。 4、酶與載體結合部位應避開活性中心及與維持酶高級結構有關的基團。且在制備過程盡可能保護這些基團。 5、最小的空間位阻：載體盡可能地不阻礙與底物的接近。 6、穩(wěn)定性：載體不與底物、產物和反應液發(fā)生化學反應。 7、易與產物分離，便于回收和重復使用。 8、盡量降低成本。,三、固定化酶的制備方法,物理法: 吸附法、包埋法 化學法: 交聯法、化學共價法 綜合法: 逆膠束包囊法,（一
5、）吸附法,采用固體吸附劑將酶吸附在它的表面使之固定的方法。,（1）無機吸附載體：礦物質和其它無機載體。 高嶺土：胰凝乳蛋白酶 皂土： 過氧化氫酶、核糖核酸酶 氧化鋁：葡萄糖氧化酶 二氧化硅（覆蓋卵磷脂/腦磷脂）：酸性磷酸酯酶、磷酸葡萄糖變位酶。 不銹鋼：直徑100-200粒子，以氧化鈦處理，可吸附-半乳糖苷酶（17mg/g載體）。,1、載體類型,9,高嶺土,性質：良好粘結性 粒度和細度 較強結合能力 離子吸附性及交換性,瓷土，現在世界上都把它叫做“高嶺土”，在很久很久以前，高嶺村有一家姓盛的窮苦夫妻，日子苦得就像黃連一樣。 盛家夫妻心地卻特別善良。有一年冬天，天氣寒
6、冷，屋檐下躺著個白發(fā)蒼蒼的老公公，盛家妻子端來了一碗熱開水，送到那老公公跟前，請他喝下暖暖身子。妻子借來米，男人生火熬粥，一會兒工夫，一大碗香噴噴，熱騰騰的米粥端到了老公公的面前。老公公見了，也不客氣，一口氣就把粥喝了下去。 我沒有什么好報答你們，我走后，可到村后東南面的松山頂上一口氣挖它個九九八十一鋤，老公公早已不見蹤影。 軟乎乎得就像糯米粉一樣：“松山頂上的石頭，可以拿來做瓷器，做成的瓷器能跟玉器一樣的值錢哩！” 將挖起的土石做成一個個碗和杯的坯子來，放進窯里一燒，果然個個晶瑩潔白，真象玉器一樣。 從此，高嶺村的窮人們在盛家夫妻的帶領下，改行挖土建窯燒瓷器了。松山因地處高嶺，就改名叫高嶺山
7、，山上的瓷土，就叫做高嶺土了。,10,皂土：膨潤土、火山黏土。,皂土是由天然膨潤土精制而成的無機礦物凝膠。膨潤土一般是指主 要由蒙脫土組成的一種黏土巖。皂土的主要有效成分即為蒙脫土， 含量大約90%。,蒙脫石是由兩個硅氧四面體夾一層鋁氧八面體膨潤土組成的2:1型晶體結構，由于蒙脫石晶胞形成的層狀結構存在某些陽離子 如Cu、Mg、Na、K等,且這些陽離子與蒙脫石晶胞的作用很不牢 固，易被其它陽離子交換，故具有較好的離子交換性 。,（2）有機吸附載體 纖維素粉：糖苷水解酶 火棉膠：木瓜蛋白酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（70mg酶蛋白/ cm2） ),（3）離子交換劑作為吸附載體
8、 CM-纖維素、DEAE（二乙胺基乙基）-纖維素、DEAE-葡聚糖。 人工合成的陰離子、陽離子交換樹酯。由苯乙烯、二乙烯合成的聚合物。 陽離子型：磺酸、磷酸、-COOH、酚基等基團 陰離子型：季胺、仲胺、伯胺基團。,火棉膠： 硝化棉溶液；硝化纖維素：用一種天然膠或合成膠增塑的樹脂與之相結合,通過溶劑蒸發(fā)而干燥后制成的材料。 對眼睛、呼吸道粘膜有刺激作用。經呼吸道和消化道進入人體，影響中樞神經系統。人接觸后有咽喉痛、頭痛、嗜睡、精神遲鈍、腹痛、嘔吐、皮膚及眼結膜充血、疼痛。本品極易燃。遇明火、高熱、氧化劑或胺能引起燃燒爆炸。長期貯存能自燃。,CM-纖維素 CMcellulose 即羧甲
9、基纖維素（carboxymethyl cellulose）為陽離子交換纖維素之一。,2、影響因素,pH：pH變化影響載體和酶蛋白的電荷，從而影響酶的吸附。一般在蛋白的等電點時可達最大吸附。 (2) 鹽：影響復雜。一般會阻止吸附。實際上已被用來洗脫從低鹽溶液吸附的酶。個別情況可促進蛋白的吸附于原來不吸附的惰性支持物上。 (3) 溫度：隨溫度升高而增加吸附量。但酶失活會加速 (4)載體：與載體表面積、多孔度、載體預處理有關。顆粒越小則吸附越好。多孔載體與孔的大小和表面積有關。另外載體的預處理是極為重要的：有的載體會影響酶的結合量、有的會引起酶變性、有的會降低酶的活性。例如多孔硅，其表面有較高的酸性
10、而易使酶變性，需要用緩沖液進行予處理。,3、吸附法優(yōu)缺點,(1) 優(yōu)點 操作簡單;可充分選擇不同電荷、不同形狀的載體; 酶的純化和固定化可在吸附過程中一步完成;酶使用過程的失活可重新活化;載體可再生 (2)缺點 pH、溫度、離子強度、時間等多因素對固定化酶影響復雜，不同酶、不同載體的情況各不相同。 最適酶量的選擇是經驗性的。 吸附程度和固定化酶的活力間不一定平行。 酶與載體結合力不強，易導致催化力喪失和污染反應產物。,4、方法舉例,酶的發(fā)酵生產 Aspergillus oryzae 3042擴大曲40-50小時發(fā)酵6倍冷蒸餾水抽提2次壓濾酶液（亮黃色）測活力。（25M/小時/ml） 載體予處
11、理：DEAE-sephadex 25溶脹0.05mol/L NaOH處理洗滌。 固定化：酶液調節(jié)pH7.0-7.0與載體混合（載體濕重：酶液=1g：60ml）4-7冷庫攪拌吸附過夜吸去上清液用蒸餾水和0.15Mol/L醋酸鈉水溶液洗滌水洗滌后4備用。,米曲霉氨基?；?（二）共價結合法,在酶蛋白分子上功能團與固相支持物表面上的反應基團之間形成化學共價鍵連接而使酶固定的方法。 固定化酶研究中最活躍的一大類方法,可供共價結合于載體的功能團包括： 氨基：N端-氨基、賴氨酸殘基的-氨基 羧基：C端羧基、門冬-羧基、谷氨酸-COOH 巰基：半胱氨酸-SH 羥基：酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸的-OH 苯環(huán)：苯丙
12、氨酸、酪氨酸 咪唑基：組氨酸 吲哚基：色氨酸,在進行一種酶的固定時，首先要考慮酶的氨基酸組成、活性中心的氨基酸、立體結構及專一化學修飾對酶活性和影響。實際上，共價偶聯中最普遍使用的基團是：氨基、羧基、和苯環(huán)。 共價偶聯反應應注意的問題： (1) 共價結合的功能基團不影響酶的催化活性。 (2) 反應盡可能溫和 (3) 最好能在水溶液中進行 (4) 較高的反應專一性：只對某一類功能基團有很高的專一性，而對其它基團或才水溶液幾乎無副反應。,載體選擇時的注意問題： (1) 理化性質：應是親水性質的，疏水載體往往對酶有變性的作用。 (2) 有盡能大的表面積：較細顆粒、多孔載體。 (3) 機械強
13、度和穩(wěn)定性 (4) 具備在溫和條件下與酶結合的功能團。,常用載體： (1) 天然高分子材料：纖維素、瓊脂糖、淀粉、葡聚糖凝膠、膠原及其衍生物。 (2)合成高聚物：尼龍、多聚氨基酸、乙烯-順丁烯二酸酐共聚物等。 (3)無機支持物：多孔玻璃、金屬氧化物等。,按載體連接的基團類型分為： (1) 苯氨基載體 (2) 羧基載體 (3) 酯族氨基載體 (4) 硅烷化無機載體,載體表面獲得反應基的反應類型 ： 苯氨基：重氮法、異硫氰酸法 羧基：疊氮法、酰氯法、活化酯法、酸酐法 羧基、氨基：縮合法 氨基：戊二醛活化法 含羥基化合物：溴化氰法 活潑鹵素、二硫化合物、醛基高聚物：直接與酶偶聯 其它：硅烷化法、金屬
14、鰲合法、四元縮合反應,1、重氮法,原理：帶芳氨基側鏈的聚合物用亞硝酸處理，形成重氮鹽，在中性偏堿性條件處（pH8-9），親電子的芳族重氮離子攻擊活潑的芳香環(huán)，如酪氨酸的酚基、組氨酸的咪唑基，形成相應的偶氮衍生物。而與-NH2(N端-氨基、賴氨酸殘基的-氨基)的反應，須在過量重氮鹽存在下形成雙偶氮化合物。,,,,pH8-9,芳族重氮基具有疏水性，趨向于吸附蛋白分子上疏水性的酪氨酸集中區(qū)域。,重氮法常用的載體有： 帶苯氨基的珠狀聚丙烯酰胺 帶苯氨基的多孔玻璃 間氨基苯甲氧基纖維素 對氨基苯纖維素。,ABSE-多糖（對氨基苯磺酰乙基 )制備過程：,例：ABSE-纖維素固定化胰蛋白酶,
15、（1）堿性纖維素制備：24g干甘蔗芒桿纖維素，加48ml 12% NaOH溶液，0攪拌1h，15倍水稀釋后過濾。 （2）活化劑配制：對-硫酸酯乙砜基苯胺24g，加60ml蒸餾水，40攪拌，加1mol/L Na2CO3溶液調節(jié)pH至6.5（約48ml），離心去沉淀，得到對-硫酸酯乙砜基苯胺溶液。 （3）ABSE纖維素制備：加堿性纖維素、活化劑溶液于反應器，熱水浴保持溫度達60，立即用0.5M NaOH調節(jié)至pH13,溫度升至80,維持pH13保溫45min。以2L 0.05M NaOH洗滌3次,再以水洗滌3次。得ABSE-纖維素（約75g）,（4）偶聯酶： A. 配制酶液: 20mg胰蛋白酶溶于
16、16ml0.05M CaCl2-0.03ml正丁胺(保護劑)混合液(預先以1M HCl調至pH9.5)； B. ABSE-纖維素處理：取5gABSE-纖維素，加10ml蒸餾水，冰水浴，邊攪拌邊加1M HCl、5%NaNO2各2.5ml，搖勻，冰浴15min抽濾，取出濾餅，迅速用預冷的0.05M HCl和蒸餾水各洗滌三次。(重氮化) C. 偶聯：濾餅投入胰蛋白酶液中，立即用2M Tris液調pH至7.5-7.8，攪拌1h，抽濾。 D. 洗滌：固定化酶以50ml 3%NaCl攪拌洗滌3次，水洗滌2次后，懸浮于0.05M CaCl2溶液中，冰箱保存?zhèn)溆谩?2、疊氮法,將載體上羧基活化成疊氮化合物，可
17、以與酶分子上的-NH2、-OH、-SH發(fā)生共價結合。 這是最早、也是經常使用的一種共價結合的方法。 該類方法所使用的載體有：CM-纖維素、CM-Sephadex、聚門冬氨酸、生物膠CM-100等。,反應原理,即CM載體在酸或三氟化硼催化下以甲醇酯化，然后用水合肼肼解，再通過亞硝酸活化成疊氮化合物?？膳c酶-NH2基反應形成肽鍵而偶聯（pH7.5-8.5，高聚疊氮化合物易結合-NH2基）。,3、溴化氰法,帶-OH基的多糖載體，通過溴化氰活化后連接酶. 具有連位-OH基的高聚物（纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等）都可用此法。反應原理：,多糖在高pH（10-11.5）用CNBr活化，在稍低pH條件
18、下連接蛋白游離氨基。亞氨基碳酸鹽對蛋白的氨基的親核反應十分敏感，生成N-取代異脲、N-取代亞胺碳酸酯、N-取代氨基甲酸酯的衍生物。 實際連接過程很簡單，即載體先與CNBr短時間反應，洗去未反應CNBr，投入酶液即發(fā)生連接。 該法優(yōu)點：1）可應用不同的載體；2）酶連接量高；3）固定化活力高。 注意問題：CNBr有毒，稱量、溶解及活化反應均就在通風櫥內進行。過量試劑可在pH11條件下，用過量漂白粉處理一晚后棄去。,HCl（鹽酸）?。罕容^酸，感覺嘴里滑溜溜的，典型的嘔吐物感，微辣。濃：極度的酸，吐掉以后回味苦，然后整個嘴里發(fā)涼，10分鐘后好轉。H2SO4（硫酸）?。旱乃嵛?，回味感覺油膩，微熱，甜
19、，無任何不適感。較濃的（40%左右的）：超燙，感覺喝燙稀飯了，然后微甜感和痛感并存，持續(xù)2天才退（98%的純正濃硫酸不敢喝）。HNO3（硝酸）?。合仁强?，然后整條舌頭麻了，然后痛，起了白斑，持續(xù)疼痛，3-4天后消退，同時嘴里感覺大吸了一口汽車尾氣。濃：不敢喝 （猜測是濃硫酸的加強版）。NaOH（氫氧化鈉）稀：基本上同濃Na2CO3（我嘗過，咸），多一些辣感（對蛋白質腐蝕性強的都會有辣感 ）。濃：含在嘴里十分的辣(可能是已經反應起來了) 然后舌頭燒壞,呈黃色,肉腐爛，1個月不能說話,口里有赤痛感而且舌頭麻木 有辛辣感半年后出院,說話變得不準,味覺幾乎消失,嘴部留下疤痕（這東西對蛋白質的反應不是鬧
20、著玩的）。CuSO4（硫酸銅）一開始沒味道，吐出后回味淡淡的苦澀（我的確嘗過）。BaCl2（氯化鋇）：極苦咸，大約相當于MgCl2的加強版CCl4（四氯化碳）這個最恐怖了，整個嘴里感到燒塑料的味道，極濃郁，吐掉以后出現說不出的怪異甜味，直感覺全身松軟 （的確，聞起來還可以，嘗起來就郁悶了）。Na2O2（過氧化鈉）一般的咸 （Na鹽基本都這個味道）。無水酒精嘴里完全沒味道，之后花露水的味道在鼻子里揮之不去。FeCl3）（氯化鐵）涼，然后酸，與硬幣放嘴里感覺差不多（Fe鹽都這味道）。AgNO3（硝酸銀）沒味道。。。稀Br2（溴）水溶液極其濃重味道，感覺像汽車尾氣與松節(jié)油混合的味（只能如此形容）Hg
21、(NO3)2（硝酸汞）很淡的味道，有點像味精和醋混合了 。H2O2（雙氧水）特辣，趕緊吐了，之后就沒什么事情了 。還有一個百度知道里面的：極其微量的氰化物是苦的，寶貴資料啊。乙酰水楊酸我試過有點酸，有點澀，最后有點苦盡甘來的那種感覺。我嘗過溴化氫，一不小心吸進去的。味道上沒什么感覺，但是非常嗆，吸進去很少，但是咳了一整個下午，一直到吃晚飯都反胃，印象深刻啊,4、硅烷化法,無機載體機械強度好、耐受有機溶劑的作用和微生物侵蝕能力強，可以再生，在廣泛范圍的pH、壓力、溫度下載體不改變結構，同時來源豐富、價格低廉。 無機載體支持物表面采用硅烷化反應引入功能團，進一步可通過不同的化學反應制成帶有苯氨基
22、、醛基等基團成為活性載體。然后連接酶蛋白 。 載體：多孔玻璃、多孔陶瓷、多孔氧化鋁、磁性氧化鐵等,,1,2,3,與支持物表面硅烷醇或O-離子連接，相鄰硅烷間還可以發(fā)生聚合。其產物烷胺基玻璃是帶有有機功能團（氨基）的無機載體。進一步可通過不同的化學反應制成帶有苯氨基、醛基等基團，成為活性載體。 例如，乳酸脫氫酶可通過此法偶聯與多孔玻璃。 上述方法制備的固定化酶，其穩(wěn)定性超過有機多聚物作為載體的固定化酶。,利用多功能試劑進行酶蛋白分子間的交聯，酶分子與多功能試劑間形成共價鍵，得到立體交聯的網架結構。,（三）交聯法,常用的交聯劑有： 戊二醛 雙重氮聯苯胺-2,2-二磺酸 1,5-二氟-2,4-二硝
23、基苯 已二酰亞胺二甲酯。,戊二醛可直接參與酶蛋白分子的交聯，便其作用機理不完全清楚。實驗證明，酶蛋白分子中的賴氨酸參與了反應?？赡苓^程如下：,多功能試劑制備固定化酶，可進一步分為： （1）單獨與酶使用。 (交聯酶法) （2）輔助蛋白、酶與之共同使用。 ( 酶輔助蛋白交聯法) （3）酶吸附載體后再進行交聯。 (吸附交聯) （4）先與載體反應，形成多功能基團載體，然后再連接酶。(載體交聯法) 直接交聯酶法雖然操作簡便，但固定化顆粒太細，活力往往不高。,（四）包埋法,將酶包裹于凝膠格子、或聚合物半透膜微膠囊中的方法?？煞譃槟z包埋法和微膠囊化法。,1、凝膠包埋法（格子型）,常用載體：海藻酸、K-角
24、叉菜（卡拉膠）、瓊脂、三醋酸纖維素、聚丙烯酰胺凝膠等。 方法：混合單體、交聯劑和酶（于緩沖溶液中進行），然后加入催化劑，系統開始聚合。 固定化酶成型可分為凝膠后成型、邊凝聚邊成型兩種。前者是在凝膠聚合后，將其切成小塊，再經擠壓后形成不規(guī)則顆粒。后者是在聚合過程中使之聚合成珠狀。,卡拉膠：鹿角菜膠、角叉菜膠。是從某些紅藻類海草中提煉出來的親水性膠體，化學結構是由半乳糖及脫水半乳糖所組成的多糖類硫酸酯的鈣、鉀、鈉、銨鹽。由于硫酸酯結合形態(tài)的不同，可分K型、I型、L型。在果凍，軟糖，冰激凌等食品工業(yè)應用廣泛。,海藻酸：來自海藻的由D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸組成的多糖?？梢种拼笫竽c道對鍶(90S
25、r)吸收。除褐藻等海藻外，棕色固氮菌等細菌亦產生藻酸類型的多糖 。海藻酸為淡黃色粉末；無臭；幾乎無味，在水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿中不溶，在氫氧化堿溶液中溶解。有助懸、增稠、乳化、粘合等作用。可用為微囊囊材，或作為包衣及成膜的材料。,以聚丙烯酰胺凝膠為例加以介紹： （1）單體：丙烯酰胺、丙烯酸、甲基丙烯酸 （2）雙功能交聯劑：N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis) （3）催化系統： 堿催化系統：TEMED（四甲基乙二胺）和過硫酸胺系統；-二甲基丙腈和過硫酸鉀系統。 光催化：核黃素過硫酸胺系統 輻射、冰凍無氧輻射等。 （4）珠狀聚合包埋過程：酶、保護劑、單體、交聯劑、聚合催化劑混合后
26、，立即在疏水相（一種乳化劑，與水有同樣密度）的有機溶劑中分散成珠狀凝膠。,舉例：制備珠狀聚丙烯酰胺包埋-半乳糖苷酶 酶液：酵母半乳糖苷酶100mg，溶于56ml磷酸緩沖液（0.05M, pH7.3）。其中含15-30%的單體、Bis 5%。 催化劑：含TEMED 0.6ml、200mg過硫酸銨的緩沖液4ml。 疏水相：1ml山梨聚糖倍半油酸與400ml甲苯-氯仿（290：110）混合. 反應與成型：與混合后迅速加到疏水相，攪拌分散。反應器為1L圓底燒瓶，一漿狀攪拌器，240rpm，反應器中保持氮氣（保護物料不受氧化，保持產品質量，還能保證安全） 。4聚合反應30min 過濾、洗滌：砂芯漏斗過濾
27、；用500ml緩沖液洗滌，再在0.1M NH4HCO3中攪拌洗滌60min。過濾,2、微膠囊化法,酶溶液被包裹在膜內，膜既能使酶存在于類似于細胞內的環(huán)境，又阻止了酶的脫落或直接與外環(huán)境接觸。又分為界面沉淀法和界面聚合法。,（1）界面沉淀法 某些高聚物在在水相和有機相的界面上溶解度極低而形成皮膜（沉淀析出），從而將酶包裹的方法。 酶溶液在與水互不相溶的有機相中乳化，使用油溶性表面活性 劑，可形成油包水的微滴。再將溶于有機溶劑的高聚物加入攪拌著的乳化液中，然后加入一種不能溶解高聚物的有機溶劑，使高聚物在油-水界面上沉淀、析出、形成膜，最后轉移入水相，制成固定化酶即所謂 “人工細胞”。,微囊直徑
28、與乳化的程度有關，乳化分散的好壞又與攪拌的速度有關。 制作膜材料的高聚物： 硝酸纖維素 聚苯乙烯 聚甲酯丙烯酸甲酯等 優(yōu)點：條件溫和，不引起酶的失活。 缺點：除去膜上有機溶劑比較麻煩。,舉例：界面沉淀法制備“人工細胞” 材料：10%血紅蛋白溶液(Whatman No42濾紙過濾) 酶液：懸浮于10%血紅蛋白溶液 有機相：100ml水飽和的乙醚加1ml Span 85（水-油乳化劑），用前配制。 硝酸纖維素溶液：4%硝酸纖維素的乙醇-乙醚（1：3）溶液，蒸發(fā)至原先重量的20%，然后加乙醚至原體積，重新溶解。 苯甲酸正丁酯- Span 85溶液：1ml Sp
29、an 85加于100ml苯甲酸正丁酯（用前配制）。 Tween 20：50%和1%的水溶液（去乳化和洗滌）。 磁力攪拌器、磁力攪棒、燒杯,,方法： 血紅蛋白-酶液乳化：25ml酶液加等體積有機溶液，立即2600rpm磁力攪拌5秒鐘。 加成膜材料，乳化：25ml硝酸纖維素溶液，繼續(xù)磁力攪拌60秒。 微囊沉降：4放置45min。若全部沉降，去上清（約4ml），否則離心（350g，5min）去上清。 成膜：去大部分上清后，立即加苯甲酸正丁酯- Span 85溶液30ml，1200rpm攪拌30秒。4放置30min。微囊沉降完全，否則離心（350g，5min），去上清。 微囊轉移至水相：加25
30、ml50%Tween 20，2900rpm攪拌分散30秒，減至1200rpm，同時加入25ml水，再攪拌30秒，用200ml水稀釋。離心（350g，5min），去上清。 洗滌：1%Tween 20反復洗滌，直到不再含有血紅蛋白和苯甲酸正丁酯氣味。最后懸浮于0.9%NaCl溶液中,(2)界面聚合法：,化學制微囊的方法。在油-水界面發(fā)生聚合反應而成膜。 成膜材料：尼龍610、聚酰胺、聚脲等。 主要過程: (以尼龍膜制備為例) 酶液與聚合單體混合：酶溶于10%血紅蛋白溶液，加已甲叉二胺水溶液。 乳化：分散相為含1% Span 85的氯仿-環(huán)已烷。 聚合：加溶于有機相的癸二酰氯。 去乳
31、化、洗滌：Tween去乳化和洗滌，轉移至水相。,表1固定化化酶制備方法及特性比較,50,四、固定化載體材料新進展,（1）傳統載體材料的改性 利用有機聚合物對傳統無機載體材料改性修飾： 右旋糖苷對硅膠表面改性修飾可改善其表面的生物親和性， 用于固定 -葡萄糖苷酶時可大大提高了酶的負載量。 原子轉移自由基聚合(ATRP)方法，在Si(111)表面進行甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)的接枝聚合則在硅表面形成刷狀 P(GMA)，并可調節(jié)P(GMA)側鏈的長度,51,,上述復合載體的傳質性能良好，側鏈富含能與酶共價連接的環(huán)氧基，故提高了固定化葡萄糖氧化酶(GOD)的載酶量，達到 0.2mg/cm2,52,
32、無機多孔材料硅藻土在低壓下強化吸附殼聚糖，經戊二醛活化后共價固定化青霉素?；笗r，明顯提高了酶的儲存穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。 多孔且富含氨基的殼聚糖覆蓋在 SiO2 表面上并采用多種方式活化氨基時，共價偶聯胰蛋白酶的效果良好 。,53,有機高分子載體改性 甲基丙烯酸甲酯(MMA)接枝聚合到尼龍膜上，或先把苯乙烯接枝聚合到尼龍膜上再將 MMA接枝聚合到聚苯乙烯包覆層上，在膜表面引入了大量的反應性酯基，再借助己二胺和戊二醛活化并共價固定化 -半乳糖苷酶，膜上的載酶量達到 0.5mg/cm2。 一種聚合物對另一種聚合物的表面改性修飾： Ye 等先合成聚丙烯腈-順丁烯二酸超濾中空纖維膜，用 1-乙基-3-
33、(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCHCl)和 N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)將低分子量的殼聚糖縮合覆蓋到膜表面，形成雙層仿生膜并用戊二醛將脂肪酶偶聯到殼聚糖上，從而有效地降低了膜骨架對酶促反應的干擾，提高了酶對酸堿和熱的耐受性。,54,55,2、新型載體材料,磁性載體：磁性載體具有特殊的磁響應性，可以借助外部磁場從反應體系中快速簡便地富集、分離、回收固定化酶，從而可以隨時控制酶促反應，提高酶的使用效率。 納米級的鐵氧化物則是使用較為廣泛的一類磁性載體材料。 磁性高分子微球可以通過共聚、表面改性等化學反應在微球表面引入多種反應性功能基，對酶進行共價連接固定。,56,57,環(huán)境敏感性載體：
34、均相催化和異相分離特點的環(huán)境敏感性材料成為固定化酶的新型載體，通過調節(jié)反應體系的溫度或 pH 實現了這一目的。 Kato 等用 N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)和丙烯酰胺(AAM)共聚合成了溫敏性凝膠載體，它具有低臨界溶解溫度(LCST)特性，即可通過升溫或降溫來調節(jié)凝膠在水中的沉淀或溶解，提高了固定化淀粉葡萄糖苷酶(AG)的催化能力。 將適當量的聚乙二醇(PEG)接枝到殼聚糖上而制得的溫敏性高分子水凝膠載體，隨著溫度的改變能在溶膠-凝膠之間轉變。 先將木瓜蛋白酶與 N-羥基琥珀酰亞胺丙烯酸酯(NAS)反應，再利用自由基溶液聚合反應，制備的固定化木瓜蛋白酶具有pH敏感相分離特性，兼有溶液酶和固
35、相酶兩者的優(yōu)點,58,導電載體： 導電載體具有一定的電子傳導性，作為固定化酶的一類特殊載體，在基于酶電極的生物傳感器領域得到了廣泛應用。導電載體材料主要包括兩類，導電高聚物載體和導電復合載體，前者一般是具有共軛結構和導電能力的有機高聚物,如聚苯胺(PAn)、聚噻吩(PTh)、聚吡咯(PPy)及其衍生物等，后者則是在導電材料中復合一些特殊物質而制得的導電復合載體。,59,第二節(jié) 固定化細胞,采用物理或化學的方法固定微生物細胞，是利用酶或酶系的一條捷徑。70年代迅速發(fā)展起來的一項技術。沿用了固定化酶的方法，但其應用速度超過的固定化酶。,優(yōu)點： （1）免去破碎細胞提取酶的復雜過程。 （2）酶在細
36、胞內環(huán)境中，穩(wěn)定性更高，固定后酶活損失較少。 （3）可催化較復雜的反應（復合酶系統）。 （4）制備成本低。,缺點： （1）多適用于胞內酶； （2）對底物和產物有一定限制：要求底物、產物易透過細胞膜。 （3）產物較復雜，有副反應，給提取增加了難度。 制備方法與固定化酶相類似，但以吸附法、包埋法應用最多。其它方法也有嘗試，如超過濾、共價結合、交聯法等。,一、包埋法,載體：瓊脂、 明膠、 聚丙烯酰胺凝膠、 卡拉膠、 血纖維蛋白、 環(huán)氧樹脂等。,1、明膠包埋法:明膠戊二醛包埋鏈霉菌細胞 實例:葡萄異構酶產生菌玫瑰暗黃鏈霉菌固定化,（1）戊二醛處理菌體細胞：10克菌體
37、（濕重），0.1ml25%戊二醛，混勻。 （2）明膠液配制：1克明膠，加8ml水溶解。 （3）固定制膜：混合（1）和（2），鋪成2-3mm厚的膜，0-5凝固1h。 （4）戊二醛處理：0.25%戊二醛溶液75ml，浸泡24-48h。 （5）成型：機械破碎，成10目大小，蒸餾水洗滌待用。,2、聚丙烯酰胺凝膠包埋法 大腸桿菌和產氨短桿菌已分別用于工業(yè)化生產L-天冬氨酸、L-蘋果酸。,聚丙烯酰胺凝膠包埋大腸桿菌（L-天冬氨酸酶）： （1）材料準備： 菌懸液：E. coli ATCC II303，1kg菌體（濕重）加2L生理鹽水，冷至8。 單體溶液：丙烯酰胺750g，N,N甲叉雙丙烯酰胺40g，溶于2
38、.4L水, 冷至8。,（2）固定化 混合菌懸液與單體懸液,加入催化劑:100ml25%-二甲基丙腈,500ml1%過硫酸鉀。 聚合：20-25，15-20min（聚合反應約在5min后開始。溫度升高，當溫度升至30時，迅速用冰水冷卻）。 成型：切成3-4mm顆粒，水洗。 （3）活化細胞 固定化細胞在含有1mM Mg2+的1N反丁烯二酸銨（pH8.5）中，3724-48h。（天冬氨酸酶活力可提高9-10倍）。,3、海藻酸鹽包埋法 海藻酸為d-甘露糖醛酸和l-古羅糖醛酸通過1,4糖苷鍵聯接而成的聚合物。 （1）海藻酸鈉溶液配制：6g溶于96ml水（約6%濃度）。 （2）混合菌體：0.3g濕菌體
39、/ml (30%W/V)。 （3）固化和成型：固化液（含Ca2+、Zn2+、Al3+等多價陽離子溶液，如0.1MCaCl2），將海藻酸鈉與菌體的混合液用針形管滴入固化液中。 （4）硬化與洗滌：顆粒放置于0.1M CaCl2浸泡1小時進一步固化。 缺點：在高濃度的電解質（K+、Na+等）中顆粒不穩(wěn)定。 Ca2+等多價離子會在磷酸緩沖溶液沉淀，導致機械強度降低，和重新溶解。,二、吸附法,細胞表面帶有電荷，因此可以通過離子交換或吸附作用結合于載體。該法簡便，易于再生，但結合力弱，易脫落。工業(yè)應用上較少。 陰離子樹脂：固定放線菌（葡萄糖異構酶，生產果糖） DEAE-纖維素：固定巨大芽 孢桿菌（青霉
40、素?；?，生產6-APA）。,三、其它 交聯法有少量嘗試，如含有天冬氨酸酶的大腸桿菌曾用多種雙功能試劑交聯，發(fā)現只有戊二醛交聯能獲得有活力的制劑，但所得固定化細胞顆粒太細，機械強度差。 共價結合法：少數細菌表面可能存在氨基，如微球菌，可以碳二亞胺脫水與CM-纖維素連接。細胞無生存能力，但仍保留組氨酸氨裂合酶的活性，故引起人們注意，有等進一步的發(fā)展。,第三節(jié) 固定化酶和細胞的應用,一、在工業(yè)方面的應用,1、氨基酸工業(yè),（1）利用固定化?；福毎┥aL-氨基酸 DL氨基酸拆分,工業(yè)上化學合成氨基酸都是無光學活性的DL型外消旋混合物。須將它進行光學拆分以獲得L型氨基酸。 外消旋氨基酸拆
41、分方法:物理、化學和生物學方法，其中以酶法最有效，能夠生產純度較高的L-氨基酸。反應式如下：,,（2）氨基酸的轉化生產 門冬氨酸的生產：利用固定化門冬氨酸酶（細胞，E. coli）生產 HOOCCH=CHCOOH+NH3L-門冬氨酸 反丁烯二酸 L-丙氨酸、L-鳥氨酸、L-瓜氨酸的生產：利用固定化門冬氨酸脫羧酶（細胞，惡臭假單胞菌）生產，其原理是， L-門冬氨酸L-丙氨酸+CO2 L-精氨酸L-瓜氨酸(冷凍固定化細胞) L-鳥氨酸（不冷凍）,（3）固定化細胞直接生產氨基酸 谷氨酸、組氨酸、精氨酸已通過這種方法生產。,2、抗生素工業(yè),（1）從青霉素生產青霉烷酸（6-APA
42、）,青霉素是-內酰胺類抗生素，都有一個共同母核6-APA。改變其側鏈結構，則可改變其抗菌譜、水溶性、耐酸性、和抗-內酰胺酶的能力。在發(fā)酵法中，對不同的側鏈前體進行發(fā)酵以生產不同的青霉素進行了廣泛的研究，獲得近百種，但成功的只有青霉素V，其它則因產率低、產物復雜等原因而無實用價值。,半合成是將6-APA用不同側鏈羧酸?；?，進一步合成了許多廣譜、耐酸、抗-內酰胺酶、毒性低、適合不同用途的新抗生素，如氨芐青霉素、對羥芐青霉素、苯甲異惡 唑青霉素、對羥氨芐青霉素等。,獲得半合成起始物6-APA是半合成各種青霉素的關鍵。發(fā)酵法生產6-APA產量低，分離困難。故直接發(fā)酵法被排除。50年代酶催化水解青霉素生
43、產6-APA成功。已工業(yè)化大規(guī)模生產。使用酶法生產6-APA產率很低。固定化細胞（酶）可提高6-APA的產率（100-500倍）。反應原理是：,（2）固定化法生產7ACA(7-氨基頭孢霉烷酸)和7-ADCA(7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢霉烷酸),發(fā)酵法生產的主要產物是頭孢霉素C，其母核是7-ACA。7-ACA是制備半合成抗生素頭孢噻吩、頭孢唑啉的起始化合物。 可由頭孢霉素C經Ps. pudita(惡臭假單胞菌)產生的?；杆馍?-ACA。 也有兩步法的研究：頭孢霉素CTrigonopsis variabilis生物轉化為谷氨酰-7ACA再由Ps. sp 或Comamonas sp.水解為7ACA。,（3）催化合成新的青霉素和頭孢霉素 6APA（7ADCA）+側鏈衍生物固定化?；福毎┬碌那嗝顾鼗蝾^孢霉素。 但由于底物、產物抑制作用、反應的可逆性，反應產率低，與化學合成法相比優(yōu)越性不突出。個別產率較高的值得進一步探索。 （4）固定化直接發(fā)酵生產抗生素 青霉素、桿菌肽。,3、糖和醇類的生產 果葡糖漿的生產 山梨糖山梨醇 乙醇、異丙醇、正丁醇等。 4、其它 有機酸：反丁烯二酸L-蘋果酸。萘水楊酸等 甾體轉化：氫化可的松氫化波尼松 生產核酸、核苷酸、輔酶等,二、在生化分析上的應用 酶電極、微生物傳感器（如致癌物的篩選等）,
固定化酶與固定化細胞技術
