KJ 201906 動(dòng)物源性食品中喹諾酮類物質(zhì)的快速檢測(cè) 膠體金免疫層析法
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附件6 動(dòng)物源性食品中喹諾酮類物質(zhì)的快速檢測(cè) 膠體金免疫層析法 (KJ201906) 1 范圍 本方法規(guī)定了動(dòng)物源性食品中喹諾酮類物質(zhì)的膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法。 本方法適用于生乳、巴氏殺菌乳、滅菌乳、豬肉、豬肝、豬腎中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、達(dá)氟沙星、二氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氟甲喹、噁喹酸殘留的快速測(cè)定。 2 原理 本方法采用競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析原理。樣品中的喹諾酮類物質(zhì)與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合,抑制了抗體和檢測(cè)線(T線)上抗原的結(jié)合,從而導(dǎo)致檢測(cè)線顏色深淺的變化,通過(guò)檢測(cè)線與控制線(C線)顏色深淺比較,對(duì)樣品中喹諾酮類物質(zhì)進(jìn)行定性判定。 3 試劑和材料 除另有規(guī)定外,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T 6682規(guī)定的二級(jí)水。 3.1 試劑 3.1.1 乙腈。 3.1.2 甲酸。 3.1.3 分散固相萃取劑I:分別稱取硫酸鎂18 g、醋酸鈉4.5 g放于研缽中研碎。 3.1.4 分散固相萃取劑II:分別稱取硫酸鎂27 g、N-丙基乙二胺(PSA)4.5 g放于研缽中研碎。 3.1.5 甲酸-乙腈溶液:98 mL乙腈中加入2 mL甲酸,混勻。 3.1.6 甲醇。 3.1.7 稀釋液:脫脂奶粉︰水(1︰10)。 3.2 參考物質(zhì) 喹諾酮類參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子量見(jiàn)表1,純度≥99%。 表1 喹諾酮類參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子量 序號(hào) 中文名稱 英文名稱 CAS登錄號(hào) 分子式 相對(duì)分子量 1 洛美沙星 Lomefloxacin 98079-51-7 C17H19F2N3O3 351.35 2 培氟沙星 Pefloxacin 70458-92-3 C17H20FN3O3 333.36 3 氧氟沙星 Ofloxacin 82419-36-1 C18H20FN3O4 361.37 4 諾氟沙星 Norfloxacin 70458-96-7 C16H18FN3O3 319.33 5 達(dá)氟沙星 Danofloxacin 112398-08-0 C19H20FN3O3 357.38 6 二氟沙星 Difloxacin 5522-39-4 C28H33N3F2 449.58 7 恩諾沙星 Enrofloxacin 93106-60-6 C19H22FN3O3 359.16 8 環(huán)丙沙星 Ciprofloxacin 85721-33-1 C17H18FN3O3 331.13 9 氟甲喹 Flumequine 42835-25-6 C14H12FNO3 261.25 10 噁喹酸 Oxolinic Acid 14698-29-4 C13H11NO5 261.23 注:或等同可溯源物質(zhì)。 3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 3.3.1喹諾酮類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 mg/mL):分別精密稱取喹諾酮類參考物質(zhì)(3.2)適量,置于50 mL燒杯中,加入適量甲醇(3.1.6)超聲溶解后,用甲醇轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶中,定容至刻度,搖勻,配制成濃度為1 mg/mL的喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。-20℃避光保存,有效期6個(gè)月。 3.3.2喹諾酮類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中間液(1 μg/mL):分別吸取喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 mg/mL)(3.3.1)100 μL于100 mL容量瓶中,用甲醇(3.1.6)稀釋至刻度,搖勻,配制成濃度為1 μg/mL的喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)中間液。 3.4 材料 3.4.1 金標(biāo)微孔(含膠體金標(biāo)記的特異性抗體)。 3.4.2 試劑條或檢測(cè)卡。 4 儀器和設(shè)備 4.1 移液器:100 μL、200 μL和1 mL。 4.2 渦旋混合器。 4.3 離心機(jī):轉(zhuǎn)速≥4000 r/min。 4.4 電子天平:感量為0.01 g。 4.5 孵育器:可調(diào)節(jié)時(shí)間、溫度,控溫精度±1℃。 4.6 讀數(shù)儀。 4.7 氮吹儀。 4.8 環(huán)境條件:溫度15℃~35℃,濕度≤80%(采用孵育器與讀數(shù)儀時(shí)可不要求環(huán)境溫度)。 5 分析步驟 5.1 試樣制備 液體乳直接用于測(cè)定,豬肉、豬肝、豬腎用組織搗碎機(jī)等攪碎后備用。 5.2 試樣的提取 5.2.1 生乳、巴氏殺菌乳、滅菌乳 分別吸取同等體積的液體乳樣品與稀釋液混合后為待測(cè)液。 5.2.2 豬肉、豬肝、豬腎 準(zhǔn)確稱取2.5±0.01 g均質(zhì)后的組織樣品于15 mL離心管中,加入5 mL甲酸-乙腈溶液(3.1.5),渦旋混合1 min,振蕩5 min,4000 r/min離心5 min。將上清液2 mL轉(zhuǎn)入10 mL 離心管中,分別加入0.6 g分散固相萃取劑I(3.1.3)漩渦混合1 min、再加入0.6 g分散固相萃取劑II(3.1.4)后漩渦混合1 min,靜置分層后取1 mL于10 mL 離心管中,于氮吹儀60℃吹干后用1 mL樣品稀釋液溶解作為待測(cè)液。 5.3 測(cè)定步驟 5.3.1 檢測(cè)卡測(cè)定步驟 5.3.1.1將檢測(cè)卡平放入孵育器中。小心撕開(kāi)檢測(cè)卡的薄膜至指示線處,避免提起檢測(cè)卡和海綿。 5.3.1.2用移液器取待測(cè)液(5.2)300 μL,避免產(chǎn)生泡沫和氣泡。豎直緩慢的滴加至檢測(cè)卡兩側(cè)任意一側(cè)的凹槽中,將粘箔重新粘好。 5.3.1.3蓋上孵育器的蓋子,孵育器上的計(jì)時(shí)器自動(dòng)開(kāi)始計(jì)時(shí),紅燈閃爍,孵育3 min。 5.3.1.4 取出檢測(cè)卡,不要擠壓樣品槽,放于讀數(shù)儀中,讀數(shù)前保持樣品槽一端朝下直到在讀數(shù)儀上讀取結(jié)果,或從孵育器上取出后直接目視法進(jìn)行結(jié)果判定。 5.3.2試劑條與金標(biāo)微孔測(cè)定步驟 吸取300 μL待測(cè)液(5.2)于金標(biāo)微孔(3.4.1)中,抽吸5~10次使混合均勻,將試劑條(3.4.2)吸水海綿端垂直向下插入金標(biāo)微孔中,孵育5~8 min,從微孔中取出試劑條,進(jìn)行結(jié)果判定。 注:試劑條(或檢測(cè)卡)具體檢測(cè)步驟可參考相應(yīng)的說(shuō)明書(shū)操作。 5.4 質(zhì)控試驗(yàn) 每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)。 5.4.1 空白試驗(yàn) 稱取空白試樣,按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。 5.4.2 加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取空白試樣(精確至0.01 g)置于具塞離心管中,加入一定體積的諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)中間液,使諾氟沙星終濃度為6 μg/kg,按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。 6 結(jié)果判定 6.1 讀數(shù)儀測(cè)定法 按讀數(shù)儀說(shuō)明書(shū)要求操作直接讀取并進(jìn)行結(jié)果判定, 6.2 目視法 通過(guò)對(duì)比控制線(C線)和檢測(cè)線(T線)的顏色深淺進(jìn)行結(jié)果判定。目視判定示意圖見(jiàn)圖1。 6.2.1 無(wú)效 控制線(C線)不顯色,表明不正確操作或試劑條/檢測(cè)卡無(wú)效。 6.2.2 陰性 檢測(cè)線(T線)顏色比控制線(C線)顏色深或者檢測(cè)線(T線)顏色與控制線(C線)顏色相當(dāng),表明樣品中喹諾酮類低于方法檢測(cè)限,判定為陰性。 6.2.3 陽(yáng)性 檢測(cè)線(T線)不顯色或檢測(cè)線(T線)顏色比控制線(C線)顏色淺,表明樣品中喹諾酮類的含量高于方法檢測(cè)限,判定為陽(yáng)性。 6.3 質(zhì)控試驗(yàn)要求 空白試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果應(yīng)為陰性,加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性。 圖1 目視判定示意圖 7 結(jié)論 當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí),應(yīng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行確證。 8 性能指標(biāo) 8.1 檢測(cè)限 生乳、巴氏殺菌乳、滅菌乳、豬肉、豬肝、豬腎中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、達(dá)氟沙星、二氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氟甲喹、噁喹酸為3 μg/kg。 8.2 靈敏度 靈敏度應(yīng)≥99%。 8.3 特異性 特異性應(yīng)≥95%。 8.4 假陰性率 假陰性率應(yīng)≤1%。 8.5 假陽(yáng)性率 假陽(yáng)性率應(yīng)≤5%。 注:性能指標(biāo)計(jì)算方法見(jiàn)附錄A。 9 其他 本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便,在使用本方法時(shí)不做限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前,須對(duì)其進(jìn)行考察,應(yīng)滿足本方法規(guī)定的各項(xiàng)性能指標(biāo)。 本方法參比標(biāo)準(zhǔn)為GB/T 21312-2007 《動(dòng)物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測(cè)方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》。附錄A 定性方法性能指標(biāo)計(jì)算方法 表A.1 性能指標(biāo)計(jì)算表 樣品情況a 檢測(cè)結(jié)果b 總數(shù) 陽(yáng)性 陰性 陽(yáng)性 N11 N12 N1.=N11+N12 陰性 N21 N22 N2.=N21+N22 總數(shù) N.1=N11+N12 N.2=N21+N22 N=N1.+N2.或N.1+N.2 顯著性差異(х2) c2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21), 自由度(df)=1 靈敏度(p+,%) p+=N11/N1. 特異性(p-,%) p-=N22/N2. 假陰性率(pf-,%) pf-=N12/N1.=100-靈敏度 假陽(yáng)性率(pf+,%) pf+=N21/N2.=100-特異性 相對(duì)準(zhǔn)確度,%c (N11+N22)/(N1.+N2.) 注: a由參比方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果或者樣品中實(shí)際的公議值結(jié)果; b由待確認(rèn)方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果。靈敏度的計(jì)算使用確認(rèn)后的結(jié)果。 N:任何特定單元的結(jié)果數(shù),第一個(gè)下標(biāo)指行,第二個(gè)下標(biāo)指列。例如:N11表示第一行,第一列,N1.表示所有的第一行,N.2表示所有的第二列;N12表示第一行,第二列。 C為方法的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確性的結(jié)果,與一致性分析和濃度檢測(cè)趨勢(shì)情況綜合評(píng)價(jià)。 本方法負(fù)責(zé)起草單位:黑龍江省質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院。 驗(yàn)證單位:國(guó)家農(nóng)林副產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心、國(guó)家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心、海南省藥品檢驗(yàn)所。 主要起草人:佟曉芳,楊光,趙平,陳薇薇,李春娟,姜金斗,王玉芝,陳堅(jiān)。- 1.請(qǐng)仔細(xì)閱讀文檔,確保文檔完整性,對(duì)于不預(yù)覽、不比對(duì)內(nèi)容而直接下載帶來(lái)的問(wèn)題本站不予受理。
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